Alginat Encapsulation pluripotenter Stammzellen Mit einer Co-Axial Düsen

Zusammenfassung

Wir haben eine Methode zur Verkapselung von pluripotenten Stammzellen (PS-Zellen) in Alginat-Hydrogel-Kapseln mit einer koaxialen Düse etabliert. Dies verhindert eine übermäßige Aggregation der Zellen und begrenzt die Scherspannung, der Zellen in Suspensionskulturen ausgesetzt sind. Die Technik ist sowohl auf die Massenproduktion von PS-Zellen als auch auf die Forschung in der Stammzellnische anwendbar.

Zusammenfassung

Pluripotente Stammzellen (PS-Zellen) stehen aufgrund ihrer Rolle in der regenerativen Medizin und im Wirkstoffscreening im Mittelpunkt intensiver Forschung. Für den Einsatz von PS-Zellen in diesen Anwendungen wäre jedoch die Entwicklung eines Massenkultursystems erforderlich. Die Suspensionskultur ist eine vielversprechende Kulturmethode für die Massenproduktion von PS-Zellen, obwohl einige Probleme wie die Kontrolle der Aggregation und die Begrenzung der Scherspannung durch das Kulturmedium noch ungelöst sind. Um diese Probleme zu lösen, haben wir eine Methode zur Verkapselung von Calciumalginat (Alg-Ca) mit einer koaxialen Düse entwickelt. Mit dieser Methode kann die Größe der Kapseln durch Mitströmen von N₂ -Gas leicht gesteuert werden. Der kontrollierbare Kapseldurchmesser muss größer als 500 μm sein, da eine zu hohe Durchflussrate von N₂ -Gas den Abbau von Tröpfchen und damit heterogen großen Kapseln verursacht. Darüber hinaus führt eine geringe Konzentration von Alg-Na und CaCl₂ zu nicht-sphärischen Kapseln. Obwohl sich eine Alg-Ca-Kapsel ohne eine Beschichtung aus Alg-PLL leicht auflöst und die Entnahme von Zellen ermöglicht, können sie möglicherweise auch aus Kapseln austreten, denen eine Alg-PLL-Beschichtung fehlt. Eine Alginat-PLL-Beschichtung kann zwar Zellleckagen verhindern, ist aber auch schwer zu brechen. Diese Technologie kann sowohl zur Erforschung der Stammzellnische als auch zur Massenproduktion von PS-Zellen verwendet werden, da die Verkapselung die Mikroumgebung, die die Zellen umgibt, einschließlich der extrazellulären Matrix und der Konzentration der sezernierten Faktoren, verändern kann.

Einleitung

Induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) sind derzeit aufgrund ihrer Rolle in der regenerativen Medizin die Quelle intensiver Forschung. Für die Geweberegeneration werden jedoch große Mengen an Zellen benötigt. Zum Beispiel werden etwa eine Milliarde Pankreaszellen für einen Typ-1-Diabetiker^{benötigt 1}. Die konventionelle Schalenkultur ist jedoch nur in der Lage, 1 × 10⁵ Zellen/^cm2 zu gewinnen, so dass 1 m² Kulturfläche erforderlich ist, um genügend aus Stammzellen gewonnene Pankreaszellen für die Behandlung eines Typ-1-Diabetikers zu erhalten. Die Entwicklung eines Systems zur Massenkultur von pluripotenten Stammzellen, wie z.B. Microcarrier² und Suspensionskultur, ist daher für die regenerative Medizin erforderlich. Die Suspensionskultur stellt eine vielversprechende Methode der Massenkultur dar, aber die Kontrolle der Aggregation von Zellen ist in direkten Suspensionskulturen von humanen iPS-Zellen eine Herausforderung³. In der Tat sind suspendierte Zellen Scherspannungen ausgesetzt, die zu Zellschäden³ oder Differenzierung⁴ führen.

Forschung zur Hydrogel-basierten Verkapselung wurde durchgeführt, um Probleme im Zusammenhang mit der Suspensionskultur zu lösen. In Hydrogel-Kapseln sind die Zellen vor der Strömung des Mediums geschützt. Frühere Berichte haben die Verwendung verschiedener Arten von Hydrogelen, einschließlich Agarose⁵, PEG⁶ und Alginat (Alg), für die zelluläre Verkapselung dokumentiert. Alg-Ca-Hydrogel ist eines der nützlichsten Hydrogele für die Zellverkapselung, da Alg-Ca-Hydrogel unmittelbar nach dem Abtropfen der Alginatlösung in eine_{CaCl-2-Lösung} gebildet wird und auch durch Enzyme oder chelatbildende Reagenzien leicht verdaut wird.

Hier haben wir einen stabilen Alginat-Verkapselungsprozess für iPS-Zellen mit einer koaxialen Düse etabliert. Durch die Verwendung des N₂ -Gasflusses zur Bildung von Tröpfchen ist es möglich, Zellen in gleichmäßige Kapseln einzukapseln, ohne dass andere Reagenzien wie Öl erforderlich sind. Bei dieser Methode sind die Flussrate von N₂ und die Konzentration von CaCl₂ und Alginat die wichtigsten Betriebsbedingungen, die die Größe, Form und Gleichmäßigkeit der Kapseln beeinflussen. Dieser Bericht zeigt die Optimierung dieser Betriebsbedingungen durch den Einsatz einer Hochgeschwindigkeitskamera und eines Mikroskops.

Protokoll

1. Vorbereitung Materialien

1. Herstellung von 10 mM HEPES-Puffer. Den pH-Wert auf 7,0 bei RT und fügen NaCl auf 0,9%.
2. Bereiten Sie 5% Alginat-Lösung und 10 mM EDTA-Lösung durch Mischen von HEPES-gepufferte Kochsalzlösung in 1.1 vorbereitet. Man stellt den pH auf 7,0 bei RT.
3. Autoklaven werden die Reagenzien (1.1, 1.2) für 20 Minuten bei 121 ° C.
4. Vorbereitung Gelatine beschichteten 60 mm-Schalen mit 1,2 geschichtet - 2,0 × 10 ⁶ embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) Zellen, die als Feeder-Zellen durch Inkubation in DMEM, das 10% ES-qualifizierte FBS und 10 ug / ml Mitomycin C für 90 behandelt werden, - 120 min.
5. Aufrechterhaltung der Maus induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) Zellen auf der Schale mit der Feeder-Zellen in Gegenwart von 5 ml DMEM mit hohem Glucose mit 20% ES-qualifizierte FBS, 50 uM 2-Mercaptoethanol, nicht-essentielle Aminosäure und Antibiotika ( 100 Einheiten / ml Penicillin G Natrium, 100 & mgr; g / ml Streptomycinsulfat, und 250 ng / ml amphotericin B).
6. Seed 4 x 10 ⁵ Zellen auf einer iPS Gelatine beschichteten 60 mm-Schale und inkubieren bei 37 ° C und 5% CO _2. Ändern Sie das Kulturmedium täglich während der Inkubation. Nach 3-4 Tagen Kultur trypsinize Zellen für 1 min mit 500 ul 0,05% Trypsin, enthaltend 0,02% EDTA bei 37 ° C und 5% CO _2. Danach lösen Zellen durch Antippen der Kulturschale zehnmal.
7. In 2,5 ml DMEM mit 10% der ES-qualifizierte FBS und Antibiotika (nach Dissoziation Maus iPS-Zellen in einzelne Zellen durch Pipettieren mit 1000 ul Mikropipette dreimal) Zentrifuge Zellsuspension bei 160 × g für 3 min und entfernen Überstand und zählen Sie die Zellen . Nach Zellzählung, ein erneutes Seeding der gesammelten Zellen auf einem mit Gelatine beschichtete Schale und Inkubation für 30 min, um die iPS-Zellen aus den MEF-Zellen zu isolieren. Nach dem Zählen der Zellen (in der Regel 1 bis 3 x 10 ⁶ Zellen / Schale gesammelt werden kann), reseed 4 × 10 ⁵ Zellen auf iPSder Teller.

2. Zell Encapsulation in Alginat-Hydrogel-Kapseln

1. Sammeln Sie die Zellen, die durch in 1.5 und 1.6 beschrieben das gleiche Verfahren. Nach der Zentrifugation bei 160 × g für 3 Minuten, waschen Sie die iPS-Zellpellet mit HEPES-gepufferte Kochsalzlösung dreimal. Nach Resuspendieren der Zellen in HEPES-gepufferter Kochsalzlösung, Filtern der Zellsuspension durch ein 40 & mgr; m Zellsieb um große Aggregate, die andernfalls die Düse verstopfen können.
2. Mix 2 ml der Zellsuspension in HEPES-gepufferter Kochsalzlösung und 3 ml 5% Alg-Na-Lösung. Schließlich 5 ml Zellsuspension innerhalb von 3% Alg-Na-Lösung erhalten wird. Zelldichte ist wünschenswerterweise mehr als 10 ⁶ Zellen / ml.
3. Nach dem Sammeln der Zellsuspension in eine 5-ml-Spritze, installieren Sie eine koaxiale Düse (1A, B) auf der Spritze und setzen Sie sie auf Spritzenpumpe. Emit N _{2 -Gasstrom} (niedriger als 1 l / min) durch die äußere Nadel des koaxialen Düse undvertreiben die Zellsuspension durch die innere Düse.
4. Sammeln Tröpfchen in 250 ml einer 0,5% CaCl ₂ -Lösung und warten 10-20 min zur Gelbildung unter Rühren bei 60-90 Umdrehungen pro Minute.

3. Behandlung von Alginat-Kapseln (optional)

1. Alg-Ca Kapseln Inkubieren in 0,05% (w / v) Poly-L-Lysin (PLL) Lösung für 5 min bei 37 ° C und 5% CO _2.
2. Nach dem Waschen der Kapseln mit HEPES-gepufferter Kochsalzlösung, inkubieren in DMEM enthaltend 10% FBS, um die elektrische Ladung auf ihrer Oberfläche zu neutralisieren. Nutzen sie als überzogene Kapseln (Abbildung 1c).
3. Inkubieren der Kapseln in HEPES-gepufferter Salzlösung, enthaltend 10 mM EDTA für 5 min. Die EDTA-behandelten Kapseln sind als Hohlkapseln (1C) eingesetzt.

4. Kultur und sammeln Zellen in Alginat-Kapseln

1. Die eingekapselten Zellen mit 75 UpM mit inkubieren bei 37 ° C und 5% CO ₂ Schüttelnfür 10 Tage.
2. Sammeln und inkubieren der Kapseln in 10 mM EDTA bei 37 ° C und 5% CO ₂ für 10 min. Sammeln Zellen aus den Alginatkapseln ohne PLL-Behandlung durch Zentrifugation bei 1.000 × g für 3 min.
3. Wenn Alginat Kapseln mit PLL behandelt, brechen die Alg-PLL Membran durch Auf- und Abpipettieren rund zehnmal mit einer Nadel an einer Spritze und Zentrifuge es bei 1000 angebracht - 5.000 × g für 5 min. Nadeldurchmesser sollte niedriger sein als Kapselgröße und 25 g (260 & mgr; m) Nadeln werden in diesem Experiment verwendet werden (600 um)
4. Nach dem Zentrifugieren sammeln Zellpellet strikt von gebrochenen Alg-PLL-Membranen, wenn Sie mRNA Proben von Zellen zu sammeln möchten. Verbleibende Alg-PLL Membranen möglicherweise verhindern, dass mRNA Reinigung.

Ergebnisse

Bei Protokoll 2.5, die vertrieben Alginat-Lösung bildet sofort eine Kugelform nach Vertreibung (2A - H). Wenn die Suspension mit einer N ₂ Durchflussrate von weniger als 1 l / min ausgestoßen, der Größe der Tröpfchen einheitlicher (2I). Wenn die N _{2 -Strom} größer ist als 1 l / min, unterbricht jedoch die Tröpfchen unten (Figur 2G, weiße Pfeile) und die Größe der Tröpfchen heterogen (2J). Angesichts dieser Tatsache ist es schwierig,...

Diskussion

Encapsulation Kultur kann mit direktem Suspensionskulturen verglichen werden. Suspensionskultur ist eine einfachere Methode, um große Mengen von pluripotenten Stammzellen als Einkapselungsverfahren erhalten. , Steuerung der Aggregation von Zellen in Suspensionskultur ist jedoch immer noch eine Herausforderung. Im Verkapselungsverfahren wird Zellaggregation in Kapseln beschränkt und kann daher gut kontrolliert werden. In einer früheren Publikation zeigte, dass eingekapselten Zellen gebildeten Aggregate von einheitl...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Fibroblast des Mausembryos	Cell Biolabs	SNL 76/7
Maus-induzierte pluripotente Stammzelle	RIKEN Bio Forschungszentrum	iPS-MEF-Ng-20D-17
DMEM mit hohem Glukosegehalt	GIBCO	11995
ES qualifiziert  FBS	GIBCO	16141079
Antibakterielle Antibiotika	GIBCO	15240
Nichtessentielle Aminosäure	GIBCO	11140
2-Mercaptoethanol	GIBCO	21985-023
ESGRO Leukämie-Hemmfaktor	Merck Millipore	ESG1107
Trypsin/EDTA	GIBCO	25300
26 G/16 G Nadel	Hoshiseido
10 ml Spritze	TERUMO	SS-10ESZ
Natrium  Chlorid	Wako	191-01665
HEPES	SIGMA	H4034
Natriumalginat	Wako	194-09955
Calciumchlorid	Wako	039-00475
Poly-L-Lysin (MW = 15.000 - 30.000)	SIGMA	P7890
EDTA	DOJINDO	345-01865
Spritzenpumpe	AS ONE
Mikroskop	Olympus	IX71
Mikroskop	Leica	DM IRB
Hispeed Kamera	nac Bildtechnik	Memrecam HX-3