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Methodenartikel

Eisenchlorid-induzierte Thrombose Mausmodell für Halsschlagader und Mesentery Vessel

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DOI:

10.3791/52838

⸱

29. Juni 2015

 , 
1Vascular Biotechnology Laboratory, Baker IDI Heart and Diabetes Institute

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das FeCl3-induzierte Thrombosemodell bei Mäusen wird hierin beschrieben. Es wird eine Methode zur Überwachung des Thrombuswachstums durch intravitalmikroskopische Beobachtung an einem Mesenterialgefäß und durch Blutflussmessung in der Halsschlagader vorgestellt.

Zusammenfassung

Schwere Thrombosen und ihre ischämischen Folgen wie Myokardinfarkt, Lungenembolie und Schlaganfall sind weltweit große Gesundheitsprobleme. Die Eisenchlorid-Verletzung ist heute eine gut etablierte Technik, um schnell und genau die Bildung von Thromben in freiliegenden Venen oder Arterien mit kleinem und großem Durchmesser zu induzieren. Dieses Modell hat eine Schlüsselrolle bei der Erforschung der Pathophysiologie von Thrombosen, bei der Entdeckung und Validierung neuartiger Antithrombotika und beim Verständnis des Wirkmechanismus dieser neuen Wirkstoffe gespielt. Im Folgenden wird die Implementierung dieser Technik an einem Mesenterialgefäß und einer Halsschlagader bei Mäusen vorgestellt. Die Methode beschreibt, wie zirkulierende Leukozyten und Blutplättchen mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert und intravitalmikroskopisch am exponierten Mesenterium ihre Anreicherung an der verletzten Gefäßwand beobachtet werden kann, was zur Bildung eines Thrombus führt. An der Halsschlagader wird der durch die Gerinnselbildung verursachte Verschluss durch Überwachung des Blutflusses mit einer Dopplersonde gemessen.

Einleitung

Die Untersuchung der Mechanismen der Entstehung von Thrombosen und der Bewertung der Wirksamkeit der anti-thrombotischen Arzneimitteln zu erfordert etablierten experimentellen Tiermodellen. Großtiermodellen waren die ersten, verwendet werden, da sie große Schiffe mehr ähnlich wie beim Menschen als Nagetiere 1. Jedoch hohe Kosten, die größeren Einrichtungen erforderlich, und die Schwierigkeiten bei der Manipulation von ihnen genetisch sind große Nachteile auf ihre Verwendung und große Tiere werden nun bis zum späten präklinischen Studien beschränkt, sobald vorläufige Tests an Nagetieren haben aussagekräftige Ergebnisse 2 angegeben. Mit breiten Verfügbarkeit von transgenen und Knockout-Stämme und ihre geringe Größe, die die Menge des antithrombotischen Arzneimitteln zur in vivo Tests erforderlich minimiert werden Mäuse hauptsächlich für Thrombose Forschung eingesetzt. Daher wurden mehrere Modelle von thrombotischen Störungen bei Mäusen 3 entwickelt.

Viele etablierte Thrombose Modelle stören die intimeine Schicht der Gefässwand, gefolgt von der Belichtung der Unter endothelial extrazelluläre Matrix auf den Blutfluss Induktion der Bildung von Blutgerinnseln 4. Thromben können durch eine Exposition von Kollagen, die Blutplättchen-Aktivierung und / oder aus der Exposition der Gewebefaktor, der die Gerinnungskaskade aktiviert, löst 5 führen. Verschiedene Techniken werden dann verwendet, um die anfängliche Gefäßverletzung zu erreichen. Pierangeli et al. Entwickelten eine mechanische Zerstörung Modell mit einem Mikrochirurgie-Tool auf die Oberschenkelvene 6. Kikushi et al. Beschrieben ist ein Modell, das in der Verabreichung einer photoreaktiven Verbindung (Rose Bengal), die in der Lipiddoppelschicht von Endothelzellen und anschließend die spezifische Erregung der Gefäßwand von Interesse mit grünem Licht (540 nm) 7 akkumuliert besteht. Die Verletzung kann auch durch einen kurzen Impuls hoher Intensität Laserbeleuchtung 8 induziert werden. Eine andere Technik zum einen von der Halsschlagader von Ratten etabliertbesteht in der topischen Anwendung von Eisenchlorid (FeCl 3) 9. In diesem Fall werden die Behälter Denudation Ergebnisse aus freien Radikalen durch FeCl 3 erzeugt werden, die Lipidperoxidation und die Zerstörung von Endothelzellen 10 verursacht. Die Verletzung induziert die Expression von mehreren Adhäsionsmoleküle Auslösung Thrombozytenadhäsion und -aggregation sowie Leukozyten Rekrutierung. Es wurde gezeigt, daß Leukozyten, insbesondere Neutrophilen, spielen eine entscheidende Rolle bei der Aktivierung der Blutgerinnungskaskade, die zur Thrombose 11. Dieses Verfahren ist gut geeignet, um die Koagulationskaskade zu reproduzieren; Ermittler müssen bedenken, dass, in diesem Mausmodell, Thrombose ist in der Regel in gesunden Gefäßen induziert wohin Thrombose beim Menschen ist vor allem in erkrankten zB auftreten zu halten. atherosklerotischen Gefäßen.

Da dieses Modell ist sehr einfach zu implementieren und ist auch wirksam in Mäusen, ist es das meist genutzte Thrombose Modusl für kleine Tier in vivo-Studien. Darüber hinaus bietet dieses Verfahren die Möglichkeit, die Bildung von Thromben in einer Vielzahl von Gefäßen herbeizuführen. Zielgefäße können Arterien oder Venen mit großem Durchmesser (Carotis, Oberschenkel, Hohlvene), oder mit kleinem Durchmesser (Gekröse, cremaster) 12-14 sein. In jüngerer Zeit wurde auch am proximalen mittleren Hirnarterie verwendet, um ein Modell der Hub 15 zu entwickeln. Die Thrombosebildung kann direkt durch Intravitalmikroskopie nach Fluoreszenz-Markierung der Blutplättchen und Leukozyten beobachtet oder durch Messung der Abnahme des Blutflusses mit einer Temperatursonde oder einer Dopplersonde 12,16,17 überwacht werden. Mehrere Parameter, wie Okklusionszeit Thrombusbildung Zeit oder Thrombus Größe kann dann untersucht werden. Die physiologischen Unterschiede zwischen den untersuchten Schiffen zu erheblichen Veränderungen in der erhaltenen Thromben. Daher Ermittler der Regel wählen die Zielgefäß nach den Parametern sie measu wollenre und / oder die Krankheit Einstellung sie zu untersuchen möchten. Typischerweise ist das Modell auf die Halsschlagader für die Forschung an Atherothrombose Zusammenhang mit Herzinfarkt oder Schlaganfall in der Erwägung, Studien über die Hohlvene sind für die Erforschung von tiefer Venenthrombose relevanter mehr relevant. Die Zugänglichkeit der verschiedenen Gefäßen bestimmt auch die verwendet werden, um das Wachstum zu messen Thrombus Verfahren. Zum Beispiel sind die mesenterialen Gefäße leicht zugänglich macht dieses Modell auch für intravitalmikroskopischen Beobachtung und der Untersuchung der Dynamik von Thrombusbildung geeignet. Die Halsschlagader ist weniger zugänglich, aber größere ermöglicht Blutflussmessungen und bieten ein hervorragendes Modell, um okklusiven Thrombose zu studieren.

Das Eisenchlorid induzierten Thrombosemodell hat enorme Fortschritte im Verständnis dieser Krankheit zur Verfügung gestellt. Es wurde in vielen Studien, die die Rolle der von Willebrand-Faktor bei Thrombosebildung 18,19 verwendet. In Kombination mit genetischen modifizierung Techniken hat sich die Identifizierung der vielen spezifischen Gens in thrombotischer Erkrankungen beteiligt erlaubt. Lamrani et al. haben beispielsweise gezeigt, daß eine Knock-in-der JAK2 V617F Gen mit einer Beschleunigungs Bildung instabiler Gerinnsel 20 verbunden. Zhang et al. Haben die physiologischen Auswirkungen der P2Y12- Plättchenrezeptor untersucht und gezeigt, dass nur transgene Mäuse, welche spezifisch diesen Rezeptor der Blutplättchen zeigten eine schnelle und stabile Thrombusbildung in Mesenterialarterie mit FeCl 3 21 verletzt. Die wichtige Rolle von Gewebetyp-Plasminogen-Aktivator (tPA) und Urokinase-Plasminogen-Aktivator (uPA) der Fibrinabbauprodukte Verfahren ist auch bei diesem Verfahren 22 untersucht worden. Weiterhin stellt dieses Modell auch eine einfache und genaue Methode zur Prüfung der fibrinolytischen Kapazitäten vieler neuer Medikamente in vivo. Zum Beispiel haben Wang et al. Dieses Modell für th verwendete präklinischen Validierung eines neuen rekombinanten Plasminogenaktivator gegen aktivierte Plättchen 23 ausgerichtet. Diese Methode ermöglichte auch die Validierung von therapeutischen Proteinen aus dem Speichel von Zecken, Vampirfledermäuse und Mücken oder aus dem Gift von Schlangen mit spezifischen Identifizierung des Ziel 24-27 isoliert. Diese Beispiele zeigen die Vielseitigkeit des Ferrichlorid-Modell. In diesem Artikel konzentrieren wir uns auf zwei Methoden und Studieneisenchlorid induzierte Thrombose auf zwei verschiedenen Behältertyps; mesenterialen Gefäß und Halsschlagader.

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Protokoll

Alle Experimente mit Tieren wurden von der Alfred Medical Research and Education Precinct Tierethikkommission (E / 1534/2015 / B) freigegeben. Alle chirurgischen Manipulationen wurden unter Vollnarkose durchgeführt und die Tiere nicht Schmerzen können jederzeit auftreten. Alle beschriebenen Versuche sind keine Wiederherstellung.

1. Vorbereitung

  1. Geschnitten dünne Bänder aus Filterpapier (1 mm x 2 mm).
  2. Frisch herzustellen 2 Eisenchloridlösungen von 4% (w / v) bis 6% (w / v) in entionisiertem Wasser verdünnt. Vorbereitung Rhodamin 6G Lösung 0,3% in PBS, durch 0,22 um filtriert.
  3. Schneiden Sie ein kleines Stück (5 mm x 1 cm) von der weißen Plastikspritzen Wrapper.

2. Mesentery Arteriole Thrombusbildung durch Intravitalmikroskopie beobachtet

  1. Wiegen 10-12 Wochen alten männlichen C57BL / 6-Wildtyp-Maus und betäuben entsprechend mit einem Gemisch aus Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg), obwohl intraperitoneale Injektion. Überwachung der Narkosetiefe durch Reaktion auf Spitze, Schwanz und / oder Haut Prise, Reaktivität von Hornhaut und der Augenlid Prise, und Abwesenheit von Whisker-Bewegung. Falls erforderlich, Injizieren eine zweite Dosis von Ketamin (50 mg / kg) auf die Anästhesie des Tieres zu halten. Bewerben vet Salbe auf die Augen bis zur Trockenheit während der Narkose zu verhindern. Platzieren Sie die Maus in eine kleine Petrischale auf einem Heizkissen auf 37 ° C eingestellt platziert.
    Hinweis: Auch wenn IP Injektion können in Schmerzen für die Tiere zur Folge haben, wird die Dauer dieser Beschwerden minimal (weniger als 3 sec) sein. Schmerzen und Beschwerden mit Injektionen verbunden sind, werden durch den Einsatz von erfahrenen und kompetenten Personal und entsprechenden Nadel (25 G) minimiert werden. Nach all den Verfahren, einschläfern alle Tiere mit einer Überdosis von Ketamin und Xylazin durch Genickbruch folgte.
  2. Führen Sie eine Bauchmittelschnitt von ca. 3 cm in der Haut und schneiden Sie vorsichtig das Bauchfell.
  3. Positionieren Sie die Maus auf der Seite des Tieresri Schüssel, sanft exteriorisieren seinen Darm und sorgfältig verbreitete das Mesenterium mit 2 Wattestäbchen in ein geeignetes Gefäß an die Oberfläche der Petrischale zu bringen. Richtig zu trocknen mit einem zarten Wischer.
    HINWEIS: Um die Bewegung der Mesenterialgefäße zu begrenzen, kann Papaverin verwendet, um Darm-Peristaltik hemmen.
  4. Weichen Sie den Schwanz der Maus in warmem Wasser, um die Gefäße erweitern und injizieren 30 ul Rhodamin 6G (0,3%) in die Schwanzvene der Maus mit einer 29 G Spritze von Leukozyten und Blutplättchen zu kennzeichnen.
  5. Legen Sie die Petrischale unter einem inversen Mikroskop und konzentrieren sich auf die gewählte Arteriole mit der Hellfeldkanal.
  6. Tränken Sie ein Band aus Filterpapier mit 6% (w / v) Eisen (III) -chlorid und wenden Sie das Filterpapier auf der Arteriole mit zwei Zangen; die erste, die das Filterpapier, das zweite, um sanft drücken Sie ihn auf den Bereich von Interesse zu halten. Thrombusbildung zu beobachten in den ersten 10 sec nach der Abscheidung von dem Filterpapier.
    HINWEIS: Es ist durchaus commauf, um die Mikrogefäß umgeben und die Genauigkeit der Abscheidung des Filterpapiers und der Druck sanft verletzen ist daher wichtig, dieses Problem zu begrenzen.
  7. Beobachten Thrombusbildung durch Fluoreszenzmikroskopie (TRITC Kanal: Peakanregungs 557 nm Peakemission 576 nm), durch das Filterpapier. Beachten Sie die zirkulierenden Leukozyten und Blutplättchen, die das Rhodamin 6G und deren Aggregation in den Thrombus genommen ist daher leicht zu identifizieren.
  8. Nehmen Sie das Filterpapier nach 1 min der Einwirkung von Eisen (III) -chlorid und weiter, um die Bildung des Thrombus zu überwachen. Das Gefäß mit PBS waschen.
  9. Beobachten und notieren Sie die dynamische Bildung des Thrombus mit der Kennzeichnung von Thrombozyten und Leukozyten mit dem Rhodamin 6G hervorgehoben. Erfassen Sie die Bilder und messen Sie die Größe des Thrombus. Die hier präsentierten Bilder wurden mit einem invertierten Intravitalmikroskop erhalten, obwohl eine objektive 4X, in der TRITC Fluoreszenzkanal.
  10. Fach alle Verfahren, das Tier einschläfern mit einer Überdosis von Ketamin und Xylazin durch Genickbruch folgte.

3. Halsschlagader Thrombusbildung von Blutströmungsmessung Veranlagte

  1. Wiege eine 10-12 Wochen alte männliche C57BL / 6-Maus und betäuben entsprechend mit einem Gemisch aus Ketamin (100 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg), obwohl die intraperitoneale Injektion. Bewerben vet Salbe auf die Augen bis zur Trockenheit während der Narkose zu verhindern.
  2. Befestigen Sie die Maus unter einem Operationsmikroskop mit Klebeband an den Beinen, auf einem Heizkissen auf 37 ° C eingestellt.
  3. Machen Sie ein kleines Kissen aus einem Wischer und kleben Sie sie unter dem Kopf der Maus, um den Kopf ein wenig zu erhöhen. Verwenden Sie eine Fadenschlinge mit einer Zange, um die Schnauze nach unten ziehen (verwenden Sie die oberen Zähne). Dadurch wird der Bereich der Halsschlagader zum einfachen Zugriff ermöglichen.
  4. Führen Sie einen kleinen 5 mm tiefen Einschnitt der Haut direkt unterhalb des Kiefers, bis zum Brustbein.
  5. Präparieren Sie die fascia und Isolierung eines Fragments von der linken oder der rechten Arteria carotis communis oberhalb der Bifurkation.
  6. Vorsichtig einführen Pinzette in-zwischen der Arterie und der Nerv, sie zu trennen. Den Nerv läuft in der Nähe der Arterie stören nicht und berühren Sie zu viel von der Halsschlagader, wie es kann Schäden am Schiff verursacht. Isolieren eines Abschnitts von mindestens 5 mm von der Arterie.
  7. Trocknet den Bereich der Arterie richtig mit Wischern zu verhindern, dass eine Flüssigkeit mit der FeCl 3 stört.
  8. Stecken Sie den kleinen weißen Plastikteil unter dem isolierten Teil der A. carotis so der FeCl 3 nicht in das umliegende Gewebe zu tränken. Zu diesem Zweck, verwenden Sie eine zweite Zange, um das Stück zum ersten dann langsam den Kunststoff Papier unter der Arterie zu bringen gleiten.
  9. Tränken Sie ein Stück Filterpapier mit 4% (w / v) bzw. 6% (w / v) Eisenchlorid und legen Sie sie alle um die Arterie.
  10. Nach 3 min Belichtung, nehmen Sie das Filterpapier gründlich mit PBS und trocknen Sie den Bereich with Wischer.
  11. Setzen Sie den Doppler-Sonde um den Behälter an der verletzten Bereich und starten Sie die Aufnahme der Änderungen in Fluss. Im gesunden carotis von erwachsenen Mäusen ist die Strömung in der Regel etwa 1 ml / min. Achtung! Kontakt der Sonde mit Eisenchlorid wird die Sonde beschädigen so jeglichen Kontakt zu vermeiden. Die hier vorgestellten Daten wurden mit einem Transonic Systems Inc. Durchflussmesser, TS420 perivaskuläre Modul mit einer Nano-Doppler-Strömungssonde 0,5 PBS ausgestattet erhalten.
    HINWEIS: Die Konzentration von Eisenchlorid kann die Kinetik der Thrombusbildung, was zu unterschiedlichen Verschlusszeiten ändern. Somit kann eine Belichtung mit 6% (w / v) Ferrichlorid ergibt einen schnelleren Okklusion als Einwirkung von 4% (w / v) Eisen-III-Chlorid.
  12. Nach all den Verfahren, einschläfern alle Tiere mit einer Überdosis von Ketamin und Xylazin durch Genickbruch folgte und vorsichtig reinigen Sie den Doppler-Sonde.

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Ergebnisse

Die Leuchtstoffintravitalmikroskopie Beobachtung des Mesenterium wird die Ansammlung von Rhodamin 6G zeigen markierte Thrombozyten und Leukozyten entlang der Gefäßwand durch FeCl 3 verletzt. Die fortschreitende Bildung eines Teil Thrombusbildung wird in einem 200 & mgr; m Mesenterium Gefäß (Abbildung 1) überwacht. Ein Thrombus langsam auftaucht und eindeutig identifizierbar ist nach der ersten Minute der Exposition gegenüber FeCl 3 (Abbildung 1, t = 60 s). 40 s...

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Diskussion

Das Eisenchlorid induzierte Thrombose-Modell ist eine hervorragende Forschungswerkzeug. Wie in dieser Studie gezeigt, ist es sehr einfach zu implementieren und in Kombination mit Intravitalmikroskopie oder Doppler-Durchflussmesser verwendet wird, eine gute Echtzeit-Überwachung der Thrombusbildung liefert sie. Einstellen der Belichtungszeit und der Konzentration von FeCl 3, sondern bietet auch die Möglichkeit, entweder nicht-okklusiv oder okklusive Thromben erzeugen.

Jedoch hat die...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Die Autoren möchten sich an den technischen Support von Joy Yao und Dr. Karen Alt sowie Mittel aus dem NHMRC und NHF anzuerkennen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Whatman Chromatographie-PapierGE Healthcare3030917
Eisen(III)-chlorid 40% (w/v)VWR24212.298
Rhodamin 6GSigmaR4127
Inverses Mikroskop OlympusIX81
Digitale Schwarz-Weiß-Kamera OlympusXM10
Doppler-DurchflussmessgerätTranssonicTS420
Nano-Doppler-DurchflusssondeTranssonic0,5 PBS
KetaminHospira 0409-2051-05
Xylazin (Rampun)Bayer75313 
PetrischaleSarstedt82.1472
Insulinspritze (29 G)BD Ultrafeine326103
Applikatoren mit WattespitzeBSN medical211827A
Dynek dysilk NahtmaterialDynek Pty LtdCS30100
Dulbecco's Phosphatpuffer Kochsalzlösung (PBS)Gibco life technologies21600-069
HeizkissenKirchnerT60

Referenzen

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Eisen(III)-chlorid-induzierte ThromboseIntravitalmikroskopieDoppler-FlussmesserFluoreszenzmarkierungThrombusbildungBlutflussmessungGefäßverschluss
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