Planung und Bau von künstlichen extrazellulären Matrix (aECM) Proteine ​​aus Escherichia coli Zum Haut Tissue Engineering

Zusammenfassung

Rekombinante Technologien haben es Materialdesignern ermöglicht, neuartige künstliche Proteine mit maßgeschneiderten Funktionalitäten für Tissue-Engineering-Anwendungen zu schaffen. Zum Beispiel können künstliche extrazelluläre Matrixproteine so gestaltet werden, dass sie strukturelle und biologische Domänen enthalten, die von nativen EZMs abgeleitet sind. Hier beschreiben wir den Aufbau und die Reinigung von aECM-Proteinen, die Elastin-ähnliche Wiederholungen enthalten.

Zusammenfassung

Rekombinante Technologie ist eine vielseitige Plattform zur Herstellung neuartiger künstlicher Proteine mit einstellbaren Eigenschaften. In den letzten zehn Jahren wurden viele künstliche Proteine beschrieben, die funktionelle Domänen enthalten, die von der Natur abgeleitet (oder de novo geschaffen) wurden. Insbesondere wurden Proteine der künstlichen extrazellulären Matrix (aECM) entwickelt; Diese aECM-Proteine bestehen aus biologischen Domänen, die aus Fibronektin, Lamininen und Kollagenen entnommen werden, und sind mit strukturellen Domänen wie Elastin-ähnlichen Repeats, Seiden- und Kollagen-Repeats kombiniert. Bisher wurden aECM-Proteine umfassend für Anwendungen im Tissue Engineering und in der Wundreparatur untersucht. Kürzlich entwickelten Tjin und Mitarbeiter integrinspezifische aECM-Proteine, die die Anheftung und Vermehrung von Keratinozyten an der menschlichen Haut fördern sollen. In ihrer Arbeit bauen die aECM-Proteine Zellbindungsdomänen aus Fibronektin, Laminin-5 und Kollagen IV sowie flankierende Elastin-ähnliche Wiederholungen ein. Sie zeigten, dass die in ihrer Arbeit entwickelten aECM-Proteine vielversprechende Kandidaten für den Einsatz als Substrate in künstlicher Haut sind. Im Folgenden skizzieren wir das Design und den Aufbau solcher aECM-Proteine sowie deren Aufreinigungsprozess unter Verwendung der thermoresponsiven Eigenschaften von Elastin.

Einleitung

Seit mehreren Jahrzehnten werden sowohl synthetische als auch natürliche Materialien für die Verwendung als Gerüste im Tissue Engineering erforscht^1,2. Synthetische Materialien wie Polymere bieten zwar eine hervorragende strukturelle Integrität und einstellbare mechanische Eigenschaften, weisen jedoch oft eine unzureichende Bioaktivität auf, um das Wachstum und die Infiltration von Geweben zu fördern. Auf der anderen Seite weisen natürliche Materialien wie Proteine der extrazellulären Matrix (ECM) eine ausgezeichnete biologische Aktivität auf, weisen jedoch Einschränkungen auf, wie z. B. Variabilität von Charge zu Charge, schnellen Abbau und Immunogenitätsprobleme. Als solche sind rekombinante Proteine erwünscht, da sie so gestaltet werden können, dass sie nur die wünschenswerten Eigenschaften nativer Proteine nachahmen^3,4.

Rekombinantes Protein-Engineering hat als vielseitige Plattform für das Design und die Produktion neuartiger künstlicher Protein-Biopolymere großes Interesse geweckt. Durch die Kontrolle der genetischen Sequenz können die Funktionalitäten der künstlichen Proteine für eine Vielzahl von Anwendungen maßgeschneidert werden^5,6. Insbesondere können Proteine der künstlichen extrazellulären Matrix (aECM) so angepasst werden, dass sie mehrere Funktionalitäten für Anwendungen im Tissue Engineering, in der Regeneration und in der Wundreparatur aufweisen^2,7. Noch wichtiger ist, dass die Fortschritte bei der Klonierung und Aufreinigung die Skalierbarkeit erhöht und die Kosten für die Herstellung rekombinanter Proteine enorm gesenkt haben. Es ist möglich, große Mengen rekombinanter Proteine zu niedrigen Produktionskosten herzustellen, die für den Einsatz in der Klinik wirtschaftlich sind⁵.

Künstliche extrazelluläre Matrixproteine wurden für Tissue^{Engineering-Anwendungen 8-11} entwickelt. Zum Beispiel entwarfen Tirrell et al. ein Gefäßtransplantat mit kleinem Durchmesser unter Verwendung künstlicher Proteine, die die Fibronektin-CS5-Sequenz und Elastin-ähnliche Wiederholungen (ELP-CS5) enthielten. Sie zeigten, dass humane Endothelzellen der Nabelschnurvene (HUVECs) in der Lage waren, an diesen Materialien zu haften und zu wachsen¹². Andere haben auch kurze bioaktive Sequenzen aus Fibronektin, Kollagen, Laminin, Fibrinogen und Vitronektin sowie strukturelle Domänen eingebaut, die Elastin, Spinnenseide und Kollagene nachahmen, um eine Vielzahl von Fusionsproteinen zu erzeugen¹⁰. Bulk-vernetzte Filme, die aus Elastin-basierten aECM-Proteinen hergestellt wurden, wiesen ebenfalls ähnliche mechanische Eigenschaften wie natives Elastin auf (Elastizitätsmodule liegen zwischen 0,3 und 0,6 MPa)¹³. In der Folge wurde auch berichtet, dass aECM-Proteine, die längere Fibronektinfragmente enthalten, die Wundheilung in vitro aufgrund erhöhter Integrin-Bindungsaffinitäten beschleunigen⁸.

Kürzlich wurden Integrin-spezifische künstliche EZM-Proteine von Tjin und Mitarbeitern entwickelt¹⁴. Jedes aECM-Protein enthält eine bioaktive Zellbindungsdomäne, die aus EZM-Komponenten der nativen menschlichen Haut^{entnommen wurde 2,7,15}, wie Laminin-5, Kollagen-IV und Fibronektin. Zum Beispiel wurde gezeigt, dass das Integrin α₃Β₁ die PPFLMLLKGSTR-Sequenz bindet, die in der Laminin-5 alpha-3-Kettenkugeldomäne 3 (LG3)^16,17 gefunden wurde. In ihrem Bericht zeigten sie, dass primäre epidermale Keratinozyten der menschlichen Haut bevorzugt unterschiedliche Integrine für die Bindung an jedes der aECM-Proteine einsetzen, abhängig von der Art der vorhandenen Zellbindungsdomäne.

Die in der Arbeit von Tjin et al. diskutierten aECM-Proteine enthalten flankierende Elastin-ähnliche Domänen {(VPGIG)₂VPGKG(VPGIG₎₂}₈, die eine Elastizität verleihen, die die mechanischen Eigenschaften der menschlichen Haut nachahmt. Darüber hinaus erhöht der Einbau von Lysinresten in die Elastin-ähnlichen Wiederholungen auch die Gesamtlöslichkeit des Proteins in wässrigen Lösungsmitteln. Darüber hinaus dienen die Lysinreste auch als Vernetzungsstellen, um die Bildung von vernetzten aECM-Filmen^{zu erleichtern 12}. Der Einschluss von Elastin-ähnlichen Wiederholungen in die aECM-Proteinsequenz ermöglicht eine einfache Aufreinigung der Proteine mittels Inverse Transition Cycling (ITC)¹⁴. Elastine durchlaufen einen scharfen und reversiblen Phasenübergang bei einer bestimmten Temperatur, die als untere kritische Lösungstemperatur (LCST) oder inverse Übergangstemperatur (T_t) bekannt ^ist18-20. Elastine und Elastin-ähnliche Wiederholungen nehmen unterhalb ihres LCST hydrophile Random-Coil-Konformationen an und werden wasserlöslich, während Elastine oberhalb ihres LCST schnell zu mikrometergroßen Partikeln aggregieren. Solche Phasenübergänge sind reversibel und können daher ausgenutzt werden, um die einfache Aufreinigung von elastinbasierten aECM-Proteinen mit der ITC-Technik^{zu ermöglichen 21}.

In dieser Arbeit berichten wir über ein verallgemeinertes Verfahren zum Design, zur Konstruktion und zur Reinigung künstlicher EZM-Proteine, die bioaktive Zellbindungsdomänen enthalten, die mit Elastin-ähnlichen Wiederholungen fusioniert sind. Der Prozess zum Design und Klonieren der Plasmide, die für die Aminosäuresequenzen für die aECM-Proteine kodieren, wird beschrieben. Die Schritte zur Aufreinigung der aECM-Proteine mittels ITC werden skizziert. Abschließend werden die Methoden zur Bestimmung der Reinheit der mittels SDS-PAGE-Elektrophorese und Western Blotting gewonnenen aECM-Proteine diskutiert.

Protokoll

1. Klonierung von rekombinanten Plasmiden, die für Proteine ​​aECM

1. Gestalten Sie die Aminosäuresequenz der funktionellen Domäne (zB Zellbindungsdomäne und Elastin-ähnliche Wiederholungen). Design Restriktionsstellen flankieren die Enden der funktionellen Domänen zu erleichtern Subklonierung mit freier Software nach Software-Anweisungen (zB http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/). Wählen Sie hier einmal vorkommende Restriktionsstellen, die nicht in der funktionalen Domäne vorhanden, um die Verdauung an die vorgesehenen Standorte beschränkt sind. Wählen Restriktionsstellen in der multiplen Klonierungsstelle (MCS) des Wirt-Vektor angegeben (z pET22b (+)) für Sub-Klonen.
2. Rückwärts übersetzen die Aminosäuresequenz in die Nukleotidsequenz mit kostenlosen Websites nach Software-Anweisungen. (ZB http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html). Stellen Sie sicher, Codons für E. optimiert coli-Hosts.
3. Gen von Interesse kann purchas seined Handel als Einzelstrang-Oligonukleotiden (dh, wenn die Oligonukleotide <100 Basenpaare (bp)) und durchzuführen, DNA Tempern (siehe Schritt 1.4), die Kosten zu reduzieren. Ansonsten für Gene größer als 100 bp, sie könnten durch die Handelsgesellschaften erworben werden.
4. DNA Annealing der Oligonukleotide
   1. Tempern die DNA-Oligomeren, um die gewünschte Gen-Sequenz zu erhalten. Aufzulösen DNA-Oligonukleotide in einem DNA-Oligomer-Puffer (10 mM Tris: 2-Amino-2- (hydroxymethyl) -propan-1,3-diol, pH 8,0, filtriert) zu einer Endkonzentration von 1 ug / ul.
   2. Hinzuzufügen 4 ul jedes Oligomers zu 32 ul DNA Annealing-Puffer (10 mM Tris, 100 mM NaCl und 100 nM MgCl _2), um insgesamt 40 ul Mischung zu erzielen.
   3. Kochen Sie ein Becherglas mit Wasser unter Verwendung einer Kochplatte und tauchen Sie die Mischung für 5 min, 95 ° C. Das Becherglas und allmählich abkühlen die gesamte in einem Styropor-Box O / N eingestellt. Die Oligomere wurden geglüht und sind bereit für die Verdauung.
5. Hinzufügen der entsprechenden Restriktionsenzyme, die geglüht Oligomere (dh als Einsatz bezeichnet) und Wirt-Vektor (dh pET22b (+)) separat zu verdauen. Verwenden des folgenden Rezepts (1-2 ug DNA, 2 ul jedes Restriktionsenzym wurden 5 ul 10x Restriktionsenzym-Puffer und Wasser bis zu insgesamt 50 & mgr; l Mischung) für 3-4 h bei 37 ° C.
   HINWEIS: Der pET22b (+) Plasmidvektor Ampicillin Antibiotika-resistente und enthält ein 6x-His-Tag am C-Terminus. Die 6x-His in pET22b (+) vorhanden tag ermöglicht es uns, His-markierten Antikörper zu verwenden, um das Zielprotein durch Western-Blot in Schritt 7 zu identifizieren.
6. In 6x Ladepuffer zu jedem Verdauungsgemisch. Führen Sie die Aufschlussgemische getrennt einschließlich einer DNA-Leiter auf 1,2% Agarosegelen DNA, enthaltend eine UV-fluoreszierende DNA-Farbstoff 1 h bei 100 V visualisieren die 1,2% DNA Agarosegel mit einer UV-Lichtbeleuchtung.
7. Schneiden Sie das Gel auf verdauten DNA-Produkte mit kommerziellen Gel Aufreinigungskits extrahieren. Elute mit dem Mindestvolumen für die Spalte, um eine minimale DNA-Konzentration von 50 bis 100 ng / & mgr; l zu erreichen.
8. Kombinieren der das interessierende Gen sequentiell durch Ligation des DNA-Inserts verdaut (dh Elastin Wiederholungen oder Zellbindungsdomänen von DNA Glühen erhalten wird) in den Plasmidvektor unter Verwendung von T4-Ligase mit dem folgenden Rezept: (2 & mgr; l Vektor, 1 ul T4-Ligase, 1,5 ul T4-Ligationspuffer, x ul Einsatz, 10,5 x ul Wasser für insgesamt 15 & mgr; l Mischung). Inkubieren Sie die Ligationsmischung bei RT für 2 h.
   HINWEIS: molare Konzentration von Vektor einfügen sollte geändert werden, um Ligationseffizienz zu optimieren. Volumen als x im Rezept beschrieben Einsatz ist abhängig von der eluierten DNA-Konzentration von Schritt 1.7.
9. Thaw E. coli DH5a chemisch kompetente Zellen (oder jedes Klonen Stamm) auf Eis. Warm 2xYT Agar-Platten (Tabelle 1), enthaltend Ampicillin (25 ug / ml) auf 37 ° C.
10. Transformieren der Zellen unter VerwendungHitzeschock:
    1. Aliquot 50 ul kompetenter Zellen in saubere, vorgekühlte Mikrozentrifugenröhrchen. Pipette 5 ul (zwischen 100 pg bis 100 ng) der Ligationsmischung in die Zellen, Pipettieren vorsichtig nach oben und unten zu mischen. Lassen Sie die Mischung auf Eis für 20 min.
    2. Eintauchen der Mikrozentrifugenröhrchen, das die Zellmischung in einem 42 ° C warmen Wasserbad für 2 Minuten und kehrte auf Eis für 2 min. Zeit der Eintauchdauer, um Hitzeschäden an den Zellen zu minimieren.
    3. Gib 500 & mgr; l SOC-Medium (Tabelle 1) in das Mikrozentrifugenröhrchen und Inkubieren bei 37 ° C unter Schütteln für 1 Stunde.
    4. Verbreiten 50 500 ul der Zell / Ligationsmischung auf einem 2 × YT-Agar-Platte, die auf RT erwärmt worden ist, enthaltend Ampicillin (25 ug / ml) und Inkubation Platten der Oberseite nach unten bei 37 ° CO / N (12-16 h) .
11. Am nächsten Tag abholen DNA Kolonien von der Agar-Platte mit saubere Pipettenspitzen. Wachsen die Kolonien in 5 ml 2YT-Medium (Tabelle1), das Ampicillin (25 ug / ml) O / N bei 37 ° CO / N (12-16 h) unter Schütteln (225 rpm).
12. Am folgenden Tag, mit einem Plasmid Isolation Kit, um die DNA-Plasmide für jede Kolonie nach Herstellerprotokoll aufgenommen zu extrahieren. Elution der DNA mit 50 ul Wasser.
13. Führen Sie einen Test verdauen mit Restriktionsenzymen mit folgender Rezeptur: (5 ul DNA, 0,2 ul jedes Restriktionsenzym, 1 ul 10x Restriktionsenzym-Puffer und füllen Sie Wasser für insgesamt 10 ul Gemisch), Inkubation für 2 Stunden bei 37 ° C zum Bildschirm für die Kolonien, die wahrscheinlich enthalten den Einsatz und laufen auf 1,2% Agarose-Gel-DNA, wie in Schritt 1.6.
    HINWEIS: Bei der Verdauung, eine erfolgreiche Ligation sollten die Ergebnisse in zwei Bänder, je eine für Vektor- und Insert, das auf ihre jeweiligen Molekulargewicht entspricht (Abbildung 1).
14. Senden Sie die wahrscheinlich Kolonien zur DNA-Sequenzierung unter Verwendung von T7-Promotor Vorwärts- und Rückwärtsprimer für kommerzielle Sequenzer.

2. Transformation der rekombinanten Plasmide in bakterielle Expressionswirt

1. Von der Sequenzierung Ergebnis, wählen Sie eine Kolonie, die erfolgreich ligiert wurde und verwenden Sie den DNA-Plasmid für die Transformation in einen E. coli Expressionswirt.
2. Thaw E. coli Expressionsstamm (BL21 (DE3) pLysS) auf Eis. Inzwischen warmen Agarplatten, enthaltend Ampicillin (25 ug / ml) und Chloramphenicol (34 ug / ml) auf Raumtemperatur.
   ANMERKUNG: Das Plasmid pLysS in Bakterien vorliegende Stamm BL21 (DE3) pLysS eine Chloramphenicol-Resistenz-Gen enthält. Die pLysS Plasmid enthält ein T7 Repressorgen, die konstitutiv exprimiert wird, um undichte Ausdruck der aECM Protein zu begrenzen. Chloramphenicol ist notwendig, um für die Bakterienzellen, die pLysS während der Kultur enthält auszuwählen.
3. Wiederholen Sie Schritt 1,10 bis transformierten E. zu erhalten coli-Zellen, die bereit sind, die künstliche Proteine ​​zu exprimieren sind. Wrap-Agar-Platten in Parafilm und lagern auf den Kopf in 4 6; C für bis zu einem Monat.

3. Bakterielle Expression des Proteins aECM

1. Siehe Abbildung 2, wählen Sie eine Kolonie von der Agarplatte transformiert mit einer Pipettenspitze und Beimpfen in 10 ml sterilem Terrific Broth (TB) -Medium (Tabelle 1), die sowohl Ampicillin und Chloramphenicol-Antibiotika in einem Reagenzglas. Inkubieren Sie dieses Starterkultur bei 37 ° CO / N (12-16 h) mit 225 rpm schütteln.
2. 10 ml der Starterkultur in 1 l frisch und sterile TB-Medien mit den gleichen Antibiotika in einen 3 l-Erlenmeyerkolben ergänzt. Inkubieren Sie die Kultur bei 37 ° C unter Schütteln bei 225 rpm für 2-3 Stunden und beobachten Sie die optische Dichte der Kultur (OD ₆₀₀₎ erreicht 0,6-0,8 durch Pipettieren von 1 ml der Kultur in eine leere Küvette zum Lesen. Sparen Sie 1 ml der Kultur vor der Induktion für SDS-PAGE Charakterisierung.
   1. Um OD ₆₀₀ von der Zellkultur messen, bereiten 1 Flasche TB Medien in einer Küvettefür eine Leermessung. Getrennt davon wurde je 1 ml der Kultur aus der Kulturflasche in eine neue leere Küvette. Anschließend wird die optische Dichte der Kultur mit einem Spektrophotometer gegen die Blindprobe bei einer Absorption von 600 nm.
   2. Speichern der Probe (für nachfolgende SDS-PAGE-Analyse) durch Übertragen der 1 ml der Kultur in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, Zentrifugieren bei 12.000 × g für 2 min, und Dekantieren.
3. Induzieren die Kultur mit Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) zu einer Endkonzentration von 1 mM und Inkubation bei 37 ° C unter Schütteln bei 225 rpm für weitere 4 Std. Speichern 1 ml der Kultur am Ende der Induktion bei 4 Stunden für die SDS-PAGE-Charakterisierung.
4. Ernte der Zellen durch die Übertragung der Kultur in 1 l-Zentrifugenflaschen und Zentrifugieren bei 12.000 xg für 30 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen, wiegen die Zellpellets und resuspendieren in TEN-Puffer (1 M Tris, 0,01 M EDTA, 0,1 M NaCl, pH = 8,0) bei 0,5 g / ml.

4. Die Lyse von Bakterienkulturen

1. Frieren Sie den resuspendierten Zellkultur bei -80 ° CO / N. Auftauen der gefrorenen Zellkultur in einem Wasserbad bei RT oder auf Eis, um die Zellen zu lysieren. Zugabe von 10 ug / ml Deoxyribonuclease I (DNase I), 10 & mgr; g / ml Ribonuclease A (RNase I), und 50 ug / ml Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), während dem Auftauen und homogenisieren der Lösung unter langsamem Rühren.
2. Nachdem alle resuspendierten Zellen werden aufgetaut, passen Sie die Lösung auf pH 9,0, um das Protein Löslichkeit in Wasser ¹² zu erhöhen. In 6 N NaOH tropfenweise unter Rühren auf Eis, um eine homogene Konsistenz zu erreichen. Lyse durch Ultraschall Unterbrechung für 20 Minuten auf Eis mit einem Durchmesser von 2 mm flache Spitze, 5 sec Puls.
3. Zentrifugieren Sie die Zell-Lösung bei 12.000 × g für 30 min bei 4 ° C. Den Überstand in ein sauberes, leere Flasche und bei 4 ° C zur Reinigung später.
4. Inzwischen Zellpellet wieder mit TEN-Puffer und wieder einfrieren bei -80 ° C. Bisvollständige Zelllyse, wiederholen Einfrieren / Auftauen und Beschallen Prozess bis zu dreimal. Sparen Sie 20 ul Zellysat für SDS-PAGE-Charakterisierung.

5. Reinigung von Proteinen mit aECM Inverse Transition Radfahren

1. Kollationieren des Zelllysats aus Schritt 4.3 und damit fortfahren, die aECM Proteine ​​mittels ITC, ähnlich der für die Reinigung von Proteinen elastinbasiertem ²¹ verwendet zu reinigen. Zyklen bei den verschiedenen Temperaturen, die 4 ° C durchgeführt werden und 37 ° C (bezeichnet als "kalt" bezeichnet) Zyklen (nachfolgend als "warm" bezeichnet) auf.
2. Spalten die Zelllysat in 50 ml-Zentrifugenflaschen und Zentrifugieren bei 40.000 × g für 2 Stunden bei 4 ° C. Das Aussehen der Zellpellet sollte dunkelbraun sein und freuen flüssig.
3. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette, um eine saubere Trennung von dem Pellet zu erhalten. Sammeln Sie den Überstand in sauberes Zentrifugenflaschen und NaCl bis zu einer Endkonzentration von 1 M (bis zu einem Maximum von 3 M). Warmdie Lösung auf 37 ° C für 2 Stunden mit Schütteln bei 225 rpm.
   HINWEIS: Die Zugabe von NaCl wird der Übergang des Elastin-Komponente des aECM verursachen Aggregation auszulösen. Der Überstand wird sich trüben. Wenn die Proteinkonzentration hoch genug ist, kann weißen schaumigen Protein an den Seiten des Zentrifugenflasche ersichtlich ist.
4. Zentrifugieren der Überstand aus Schritt 5.3 bei 40.000 × g für 2 Stunden bei 37 ° C. Den Überstand umfüllen. Crush the Pellet mit einem Metallspatel und das Pellet Bits in eiskaltem autoklaviert destilliertem Wasser (50 mg / ml) unter kräftigem Rühren O / N bei 4 ° C unter Verwendung eines magnetischen Rührstab und Teller. Das Pellet sollte vollständig aufgelöst werden.
5. Die Schritte 5.2 bis 5.4 für weitere drei bis fünf Mal, um eine höhere Reinheit des Proteins zu erhalten.
6. Nach dem letzten Reinigungszyklus, entsalzen der Proteinlösung durch Dialyse gegen destilliertes Wasser bei 4 ° C. Dialysiere Proteinlösung gegen Wasser für 2-3 Tage mit Veränderungen der Wasser alle 4h oder 8 h für O / N. Sparen Sie 20 ul des gereinigten Proteins für SDS-PAGE und lyophilisieren den Rest des gereinigten Proteins und bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung.

6. Charakterisierung von aECM Proteinen mit SDS-PAGE-Elektrophorese

1. Vorbereitung eines 12% SDS-PAGE-Gel (wenn das Molekulargewicht groß ist, nutzen 8% SDS-PAGE-Gele für eine bessere Trennung). Hinzuzufügen 2x SDS-Ladepuffer zu jeder Probe, Erwärmen der Proben für 10 min bei 100 ° C einstellen und Auftragung auf das Gel 1 h lang bei 100 V, bis das Protein Leiter entsprechend dem Molekulargewicht des Proteins aECM der Mitte der erreicht Gel.
2. Abrufen des Gels aus dem SDS-PAGE einzurichten und fügen Coomassie Brilliant Blue-Färbung (Tabelle 2) mit einem Volumen, das Gel für 1 Stunde in einer Petrischale eintauchen. Rinse Gel in einer Entfärbelösung (Tabelle 2) für 5 min auf einer Wippe. Ändern Sie die Entfärbelösung, und weiter, um das Gel mit Schaukel bis dem Hintergrund t entfärbener gel deutlich. Proteinbanden muss deutlich sichtbar sein.
3. Vergleichen der Position des Zielproteins gegen das Protein Leiter um das Molekulargewicht des Zielproteins zu bestimmen.
4. Um die Anwesenheit des Target-Proteins weiter zu bestätigen, führen Western Blotting, wie in Schritt 7.

7. Charakterisierung von Proteinen mit aECM Western Blotting

1. Führen Sie die Proben auf einem 12% SDS-PAGE-Gel, wie in Kapitel 6 ohne Färbung.
2. Geschnitten Nitrocellulosemembran auf eine Größe geringfügig größer als die SDS-PAGE-Gel. Schneiden 4 Stück Filterpapier in der gleichen Größe.
3. Wet einem Stück Filterpapier mit westlichen Transferpuffer (20% v / v Methanol, 25 mM Tris, 190 mM Glycin, pH 8,3), legen Sie die SDS-PAGE-Gel auf dem Filterpapier, gefolgt von einem weiteren Stück Filterpapier , dann die Nitrocellulosemembran und einem abschließenden beiden anderen Stücke von Filterpapier. Stellen Sie sicher, das ganze Set-up wird mit ausreichend westlichen Transferpuffer eingetaucht.
   ANMERKUNG: Das Gel und die Membran nicht in Kontakt zu diesem Zeitpunkt, wie Proteine ​​könnten an die Membran bei Kontakt zu binden.
4. Übertragen Sie die Proteine ​​auf der Nitrocellulosemembran, indem zwei Filterpapiere in einen westlichen halbtrockenen Transfereinheit, gefolgt von der Nitrocellulosemembran und vorsichtig die SDS-PAGE-Gel in und an der Membran, schließlich legen Sie die letzten zwei feuchtem Filterpapier auf Die SDS-PAGE-Gel. Führen Sie den westlichen Übertragung bei 45 mA, 30 min. In Puffer, wenn die Spannung höher als 30 V.
   HINWEIS: vorzugsweise die SDS-PAGE-Gel auf die Membran bei einem Versuch und vermeiden Verschieben des Gels unnötig auf der Membran als Proteine ​​könnten an die Membran bei Kontakt zu binden.
5. Abrufen und blockieren die Nitrocellulose-Membran mit Blockierungslösung (5% fettfreier Milch in PBS, pH 7,4, mit Filterpapier filtriert) für 2 h bei RT. Entsorgen Blockierungspuffer und fügen PBS spülen.
   HINWEIS: Wechseln Sie neue Handschuhe zu vermeiden Kontamination der Membran mit unerwünschten proteIns.
6. Inkubieren primären anti-His Antikörper mit Verdünnung in PBS auf 1: 1000 bei RT für 1 h unter Schütteln. Vorbereitung einer Mischung mit einem Volumen, das die gesamte Membran eintauchen könnte, beispielsweise mit Verdünnungsverhältnis 1: 1.000, fügen 1 ul Antikörper (Stammkonzentration: 1 mg / ml) zu 999 & mgr; l PBS für eine 1 ml Gesamtmischung.
7. Spülen der Membran mit 5 ml PBST (PBS mit 0,1% Tween 20).
8. Inkubieren mit sekundärem Antikörper bei 1, konjugiert an Meerrettich-Peroxidase (HRP) mit Verdünnung in PBS: 5000 bei RT für 1 h unter Schütteln. Vorbereitung einer Mischung mit einem Volumen, das die gesamte Membran eintauchen könnte, beispielsweise mit Verdünnungsverhältnis 1: 5.000, fügen 1 ul Antikörper (Stammkonzentration: 1 mg / ml) bis 4,999 & mgr; l PBS für eine 5 ml Gesamtmischung.
9. Waschen Sie die Membran mit 5 ml PBST und zweimal wiederholen.
10. Übernehmen Sie die Chemilumineszenzsubstrat an die Membran mit einem Volumen, um die Membran abdecken und inkubieren indem Sie die Anweisungen für das verwendete Substrat.
    HINWEIS: Die Empfindlichkeit der Substrat zur Proteinnachweis können variieren, empfehlen wir ein Substrat mit maximaler Empfindlichkeit für sehr niedrige Signale bei steigender Antikörperkonzentration keine Signale zu erhöhen.
11. Erfassen Sie die chemolumineszierende Signale unter Verwendung einer CCD-Kamera auf Basis Imager. Stellen Sie die primären und sekundären Antikörperverdünnungsverhältnis, wenn Signale schwach und nicht-spezifisch sind. Länger inkubieren in Blockierungslösung, wenn Hintergrundsignal hoch ist.

Ergebnisse

Bei der Konstruktion von Fusionsproteinen enthalten, Elastin-ähnlichen Wiederholungen, ist es wichtig, eine Gesamt Elastingehalt, groß genug Anteil des Fusionsproteins ¹⁸ aufrechtzuerhalten. Dies soll sicherstellen, dass das Fusionsproteinkonstrukt behält seine Elastin ähnlichen Eigenschaften, um die ITC zur Aufreinigung verwenden. Die aECM Proteine ​​Design und in diesem Abschnitt beschriebenen Sequenzen wurden speziell von der Arbeit von Tjin et al. ¹⁴ genommen. In dieser Arbeit...

Diskussion

Recombinant Protein-Engineering ist eine vielseitige Technik, um neue Proteinmaterialien unter Verwendung eines Bottom-up-Ansatz zu schaffen. Die Materialien auf Proteinbasis kann je nach Anwendungsfall von Interesse konstruiert werden, um mehrere Funktionalitäten aufweisen, zugeschnitten. Aufgrund der zunehmenden Fortschritt in der Klonierung und Proteinexpression Technologien ist es relativ einfach (und kostengünstiger) zu werden, um eine Vielzahl von künstlichen Proteine ​​auf eine reproduzierbare und skalierbare Wei...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
pET22b (+)	Novagen	69744	T7-Expressionsvektoren mit Resistenz gegen Ampicillin
BL21(DE3)pLysS	Invitrogen	C6060-03	zusätzliche Antibiotika - Chloramphenicol
Isopropyl-beta-D-thiogalactosid (IPTG)	Gold Biotechnology	I2481C	1 M Stammlösung mit autoklaviertem Wasser, vor der Induktion frisch machen.
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106	Plasmid-Isolationskit
T4-Ligase	New England Biolabs	M0202S
Ampicillin	Affymetrix	11259
Chloramphenicol	Affymetrix	23660
Zymoclean&trade-Gel DNA-Wiederherstellungskit	Zymo Research	D4001
XL10-Gold-Stamm	Agilent Technologies	200315