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Methodenartikel

Aufbau und Charakterisierung von UTI und CAUTI in einem Mausmodell

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DOI:

10.3791/52892

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23. Juni 2015

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1Department of Molecular Microbiology and Center for Women's Infectious Disease Research, Washington University School of Medicine

In diesem Artikel

Erratum-Hinweis

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Zusammenfassung

Die Fähigkeit, Harnwegsinfektionen (HWI) zu modellieren, ist entscheidend, um die bakterielle Pathogenese verstehen und die Entwicklung neuartiger Therapeutika vorantreiben zu können. Das Ziel dieser Arbeit ist es, Mausmodelle für experimentelle Harnwegsinfektionen und katheterassoziierte Harnwegsinfektionen zu demonstrieren, die die beim Menschen beobachteten Ergebnisse rekapitulieren und vorhersagen.

Zusammenfassung

Harnwegsinfektionen (HWI) sind weit verbreitet, eine wesentliche Ursache für Morbidität und werden zunehmend resistent gegen die Behandlung mit Antibiotika. Frauen sind überproportional von UTI betroffen: 50% der Frauen eine UTI in ihrem Leben haben. Zusätzlich 20-40% dieser Frauen, die eine anfängliche UTI wird eine Wiederholung mit einigen Leiden häufigen Rezidiven mit schwerwiegenden Verschlechterung der Lebensqualität, Schmerzen und Beschwerden, Unterbrechung der täglichen Arbeit zu leiden haben, erhöht Kosten für das Gesundheitswesen, und nur wenige Behandlungsmöglichkeiten andere als langfristige Antibiotikaprophylaxe. Uropathogenen Escherichia coli (UPEC) ist der wichtigste Erreger der ambulant erworbenen UTI. Katheter-assoziierten Harnwegsinfektionen (CAUTI) ist die häufigste Krankenhausinfektion Anteil von einer Million Ereignissen in den USA jährlich und dramatischen Kosten für das Gesundheitswesen. Während UPEC ist auch die Hauptursache für CAUTI sind der gestiegenen Bedeutung einschließlich Enterococcus andere Erregerfaecalis. Hier nutzen wir zwei etablierte Mausmodelle, die viele der klinischen Merkmale dieser Krankheiten beim Menschen zu rekapitulieren. Für UTI, rekapituliert ein C3H / HeN Modell viele der Merkmale von UPEC die Virulenz beim Menschen, einschließlich Wirtsreaktionen, IBC Bildung und Filamentierung beobachtet. Für CAUTI ein Modell mit C57BL / 6-Mäuse, die Blasenkatheter Implantate zu erhalten, hat sich gezeigt, anfällig zu sein E. faecalis Blasenentzündung. Diese repräsentative Modelle werden verwendet, um markante neue Einblicke in die Pathogenese der Krankheit UTI, die zur Entwicklung neuer Therapeutika und Management oder Präventionsstrategien führen wird gewinnen.

Einleitung

Harnwegsinfektionen (HWI) sind eine der häufigsten bakteriellen Infektionen und kann in zwei Kategorien auf der Basis des Mechanismus der Übernahme, Gemeinschaft und nosokomiale erworben UTI aufgeteilt werden. Ambulant erworbenen Harnwegsinfekte häufig bei ansonsten gesunden Frauen und Studien auftreten, haben gezeigt, dass etwa 50% der Frauen mindestens eine UTI in ihrer Lebenszeit 1 haben. Zusätzlich ist Rezidiv ein großes Problem. Eine Frau, die einen anfänglichen akuten Infektion hat hat eine 25-40% ige Chance, mit einer zweiten Infektion innerhalb von sechs Monaten trotz entsprechender Behandlung mit Antibiotika und viele Frauen weiterhin häufigen Rezidiven 2 haben. Die Bakterien, die diese Infektionen verursachen, sind ebenfalls immer Antibiotika-resistente weitere verwirrende Behandlungsprotokolle 3-6. UTI betreffen Millionen von Menschen jedes Jahr kostet etwa 2,5 Milliarden US-Dollar in der Gesundheitsversorgung Aufwendungen in den USA und unterstreicht die Wirkung und die Verbreitung der Krankheit1,7 .Nosocomial erworbenen Harnwegsinfekte werden hauptsächlich mit der Anwesenheit von Fremdkörpern wie Dauerkatheter verbunden. Katheter-assoziierten Harnwegsinfektionen (CAUTI) bleiben die häufigste nosokomiale erworben UTI Anteil von ~ 70-80% solcher Infektionen 8. Darüber hinaus wird CAUTI mit erhöhter Morbidität und Mortalität verbunden und es ist die häufigste Ursache für sekundäre Infektionen Blutkreislauf 9 ist.

UPEC assoziiert ambulant erworbenen HWI werden gedacht, um durch die Einführung von Bakterien in die Blase aus Stauseen im Gastrointestinaltrakt durch mechanische Manipulation während des Geschlechtsverkehrs, mangelnde Hygiene oder andere mikrobielle Populationsdynamik zwischen verschiedenen Host verursacht werden Nischen 10. Einmal in der Blase, UPEC beschäftigen zahlreiche Virulenzfaktoren einschließlich Kapsel, Eisen Erfassungssysteme, Toxine, eine Virulenzplasmid, tRNAs, Pathogenitätsinseln und Kolonisierung Faktoren, die gezeigt haben, um eine Rolle in der Pathogenese spielen 11-14. Entscheidend für die Einrichtung von UPEC Kolonisation, UPEC auch kodieren mehrere Arten von Klebe Chaperon Platzanweiser Weg (CUP) Pili, die stereochemische Rezeptoren mit Spezifität 15 zu erkennen. Typ 1-Pili, die FimH Adhäsin gekippt wird, werden durch UPEC exprimiert und BIND mannosylierten uroplakins 16 und α-1, β-3-Integrine 17, die auf der luminalen Oberfläche der menschlichen und Maus-Blasen 18 exprimiert werden. Diese FimH-vermittelte Wechselwirkungen erleichtern die bakterielle Besiedelung und Invasion der oberflächlichen Epithelzellen 19,20. Einmal in der Zelle, kann UPEC ins Cytoplasma entkommen, wo ein einzelnes Bakterium kann rasch zu teilen, um eine intrazelluläre Bakteriengesellschaft (IBC), die bei der Reifung kann ~ 10 4 Bakterien enthalten 21 bilden. IBC Formation in mindestens sechs verschiedenen Mausstämmen nachgewiesen, C3H / Hen C3H / HeJ, C57BL / 6, CBA, FVB / NJ und BALB / c, und mit einer Vielzahl von verschiedenen UPEC-Stämme und andere Enterobacteriaceae 22-24. Jedoch zeitlichen und räumlichen Differenzen IBC Bildung kann in Abhängigkeit von der Maus Hintergrund und dem infizierenden UPEC Stamm variieren. In C3H / HeN-Mäusen mit dem prototypischen UPEC infiziert Stämme UTI89 oder CFT073, IBC Bildung kann so klein Biomassen von Bakterien so früh wie 3 hpi (h nach Infektion) visualisiert werden. Diese Gemeinschaft expandiert weiter und erreicht einen "Mittelpunkt" der Entwicklung ca. 6 hpi, wenn die stabförmigen Bakterien nehmen einen großen Prozentsatz der Cytoplasmaraum terminal differenzierter oberflächlichen Schirmzellen diese frühen IBCs Form in relativ synchron mit der Mehrheit die ähnliche Abmessungen und Morphologien. ~ 8 hpi die Bakterien in der IBC Wechsel von einem Bazillen zu Morphologie Kokken. IBCs sind vorübergehender Natur. So IBC Reifung von 12 bis 18 hpi Ergebnisse in die weitere Expansion der Bakterienpopulation, die durch ihre Filamentierung und Verbreitung folgte aus der Zelle with anschließende Ausbreitung auf benachbarte Zellen 23. So erlaubt zum schnellen Bakterienwachstum in einer Umgebung von Wirtsimmunantworten und Antibiotika 25 geschützt IBC Nische. Die unterschiedlichen Stufen der UPEC Infektion, bei Mäusen sind auch beim Menschen, wie beispielsweise IBC und Filamentierung beobachtet, die Unterstützung der Mausmodell der UTI als nützliches Werkzeug, das verwendet werden kann, um UTI bei Menschen 22,26-28 modellieren.

Während eine Mehrheit der Frauen erleben eine UTI in ihrer Lebenszeit, kann das Ergebnis dieser Infektionen von einer akuten Infektion selbstlimitierend ohne Wiederkehr liegen, häufig wiederkehrenden Blasenentzündungen. Weitere Studien haben eine starke familiäre Auftreten von UTI gezeigt, was auf eine genetische Komponente UTI Anfälligkeit 29 trägt. Wir haben festgestellt, dass die unterschiedlichen Ergebnisse UTI in Kliniken gesehen kann durch die unterschiedlichen Ergebnisse der experimentellen UPEC Infektion unter Inzucht-Mäusestämmen 30 gespiegelt werden. Zum Beispiel C3H / Hen CBASind DBA und C3H / HeOuJ Mäuse anfällig, in einer infektiösen Dosis-abhängigen Weise, lang anhaltende, chronische Zystitis, die durch anhalt, hohe Titer Bakterien (> 10 4 koloniebildenden Einheiten (CFU) / ml), hohe Titer Bakterien Blase Belastungen an Opfer> 4 Wochen nach der Infektion (WPI), chronische Entzündungen und urothelial Nekrose. Diese Mäuse zeigen auch erhöhte Serumspiegel von IL-6, G-CSF, KC, und IL-5 innerhalb der ersten 24 hpi, die als Biomarker für die Entwicklung chronischer Zystitis dienen. Dies kann genau den natürlichen Verlauf der UTI stellen in einigen Frauen, als Placebo-Studien haben gezeigt, dass ein großer Prozentsatz der Frauen mit UTI wird ein hohes Maß an Bakterien im Urin für einige Wochen nach der ersten Symptome der Zystitis zu behalten, wenn keine Behandlung mit Antibiotika 31 gegeben , 32. Ferner wurde unter Verwendung C3H / HeN-Mäusen, fanden wir, dass eine Geschichte der chronischen Zystitis ist ein signifikanter Risikofaktor für die spätere schwere wiederkehrenden Infektionen. Wiederkehrende UTI ist die significant klinische Manifestation der UTI und der C3H / HeN Maus ist derzeit das einzige Modell untersucht, die eine erhöhte Veranlagung nach vorheriger Exposition rekapituliert. Eine zweite UTI Ergebnis ist in C57BL / 6 Mäusen rekapituliert, wo akute UPEC-Infektion ist selbstlimitierend, mit einer Auflösung von Blasenentzündung und Bakteriurie innerhalb von etwa einer Woche. Interessant ist, dass in diesem Modell, UPEC bilden leicht Ruheintrazellulären Lagerstätten innerhalb der Blase Gewebe, aus dem UPEC in der Lage sind, die aus einem Ruhezustand, um eine aktive UTI reinitiate möglicherweise Erläuterung eines Mechanismus für die gleiche Belastung rezidivierenden HWI bei Menschen 33, 34.

Zusätzlich zu genetischen Einflüsse auf UTI Suszeptibilität, die Einführung eines Katheters in die Blase erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass eine Infektion als auch die Erhöhung der Reihe von Bakterien in der Lage, eine Infektion zu verursachen. Es wurde gezeigt, daß menschliche Blasenkatheterisierung bewirkt histologischen undimmunologische Veränderungen in der Blase durch mechanische Beanspruchung, die in einem robusten Entzündungsreaktion führt, Peeling, Ödeme der Lamina propria und submucusa, urothelial Ausdünnung und Schleimhautveränderung des Urothel und Nieren 35,36. Zusätzlich liefert der Katheter eine Oberfläche für bakterielle Befestigungs wodurch eine von mehreren Arten verwendet werden, um CAUTI verursachen Umgebung schaffen. Während UPEC sind immer noch ein wesentlicher Faktor, Enterococcus faecalis Konten für 15% dieser CAUTI 37. E. faecalis wird zunehmend resistent gegen Antibiotika mit Vancomycinresistenz Entstehung, die ein ernstes Gesundheitsproblem 38. E. faecalis besitzen zahlreiche Virulenzfaktoren einschließlich Toxinen und Adhäsine zur Befestigung sowohl des Katheters und des Epithels 38 notwendig. Während Blasenkatheterisierung, ist der Host anfällig für mikrobielle Adhäsion, die Vermehrung und Verbreitung in den Harnwegen 39,40. E. FAECAlis bildet einen Biofilm auf dem Katheter als Teil eines Mechanismus, der in der Blase bestehen und zu verbreiten, die Nieren, die in einem Maus-Modell CAUTI 41 wiedergegeben ist. Seit kurzem ist es während Blasenkatheterisierung gezeigt wird Fibrinogen (Fg) in die Blase als Teil der Entzündungsreaktion freigesetzt. FG akkumuliert in der Blase, Mäntel der Katheter und ist essentiell für E. faecalis Biofilmbildung, die als Anhang Schafott. In einer C57BL / 6-Mausmodell CAUTI entdeckten wir, dass E. faecalis Biofilmbildung auf den Katheter und somit die Persistenz in der Blase, war abhängig von der Ebp Pilus, insbesondere seine Spitze Adhäsin EBPA. Wir fanden, dass die N-terminale Domäne von EBPA spezifisch an FG Beschichten des Katheters. Zusätzlich wurde gefunden, dass E. faecalis nutzt Fg als Metabolit Quelle während der Infektion und somit eine Verbesserung der Biofilmbildung 42.

Mausmodelle kritisch unders bewährttanding sowie die Vorhersage klinischen Manifestationen der UTI und CAUTI 41. In diesem Artikel zeigen wir, Inokulumzubereitung der Zystitis UPEC isolieren UTI89 und transurethrale Inokulation von C3H / HeN Mäusen. Ein Protokoll für das Einführen des Katheters in C57BL / 6 Mäusen und Inokulation des E. Außerdem zeigen wir, faecalis OG1RF Belastung. Beide Verfahren führen zu einheitlichen und zuverlässigen UTI oder CAUTI bei Mäusen. Wir zeigen Ihnen auch Techniken zur IBC Formation während akute Blasenentzündung und Urinentnahme für die Analyse der chronischen oder rezidivierenden Blasenentzündungen zu beobachten. C3H / HeN Mäuse verwendet worden, um Aspekte der UPEC Pathogenese einschließlich anfängliche bakterielle Invasion, IBC Bildung, Filamentierung und die Entwicklung chronischer Blasenentzündung 23,33,43 studieren. Diese Parameter wurden auch die Virulenz in einer Vielzahl von anderen Maushinter 22,33 sucht. Für CAUTI ermöglicht der C57BL / 6-Modell für Fremdkörperimplantation in die Blase und anschließenden bakteriellen CoIonisation, die 7 Tage lang aufrechterhalten werden kann nach der Infektion 41. Diese Modelle waren nützlich für die Bewertung der bakteriellen Virulenz-Mechanismen, Host antwortet UTI und Mechanismen zur Wirtsreaktionen, von denen viele in der Folge rekapituliert wurden oder in klinischen Humanpopulationen beobachtet zu untergraben.

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Protokoll

Ethics Statement: Die Washington University Animal Studies Committee genehmigt alle Maus-Infektionen und Verfahren als Teil der Protokollnummer 20120216, die 2013.01.11 genehmigt wurde, und endet 2016.01.11. Insgesamt Pflege der Tiere war konsistent mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren von der National Research Council und der USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasie-Verfahren sind im Einklang mit den "AVMA Richtlinien für die Euthanasie von Tieren Ausgabe 2013".

1. UPEC UTI Protocol, Impfnadel Vorbereitung (Abbildung S1)

  1. Entfernen Sie die Kappe des 30 G Nadel. Faden ungefähr 1 Zoll von PE10 Schlauch auf dem Schaft der Nadel. UV die Nadelanordnungen über Nacht zu sterilisieren. Katheterisiert Nadeln können auf unbestimmte Zeit in sterile Petrischalen gelagert werden.

2. UPEC Bakterieninokulum Vorbereitung

  1. Bereiten UTI89 Inokulum (Start 72 Stunden vor der Inokulation Tag)
    1. Streak UTI89 auf eine LB (Luria-Bertani) Agar-Platte aus einem gefrorenen Vorrat. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C. Wählen Sie eine Kolonie und impfen ihn in 10 ml LB in einen 125-ml-Kolben. Bei 37 ° C während 24 Stunden, statisch.
    2. Inokulieren 10 ul Übernachtkultur in 10 ml LB in einem neuen 125 ml Kolben für weitere 24 h bei 37 ° C statisch.
    3. Transfer 3 ml sterile 1,5-ml-Röhrchen und zentrifugieren (wird am Stamm und gewünschte Inokulumgröße variieren) bei 7.000 × g für 3 min und das Pellet in 1x PBS und zentrifugieren ein zweites Mal. Resuspendieren Bakterienpellet in 1 ml 1x PBS.
  2. Messen bakterielle optische Dichte und passen auf die gewünschte Konzentration Inokulumdichte. Die Standard-Konzentration des Inokulums beträgt 10 7 Bakterien; dies kann jedoch variieren aufgrund der Gestaltung der Studie.

3. Bakterieninokulation

  1. Reinigen Sie die Workstation mit 70% Ethanol und cüber Bereich mit saugfähigem Papier (oder verwenden Sie sterile Flow-Haube).
  2. Draw bis 0,9 ml der vorbereiteten Bakterienimpfmaterial in eine 1 ml (TB) Spritze (Luftblasen zu entfernen). Bringen Sie einen bereit sterile Impfnadel mit PE10 Schlauch, auf die Spritze mit dem Impfstoff, dann steril die Polyethylenschlauch trimmen.
    Hinweis: lassen 1 mm Schlauch oberhalb der Spitze der Nadel zu vermeiden Stechen der Blase.
  3. Schneiden Sie ein 1-Zoll-Quadrat Stück Parafilm und legte einen Klecks chirurgische Schmiermittel (ungefähr die Größe eines Cent) oben.
  4. Betäuben weiblichen C3H / HeN-Mäusen, indem man sie in einem 32 Unzen Glas, die ein Tee-Ei Ball mit Wattebällchen mit 3 ml Isofluran oder Verdampferkammer eingeweicht (folgende fertigt Protokoll) bis bewusstlos, aber immer noch normal atmen (1 Atemzug / sec) .
    Hinweis: Einige IACUC Ausschüsse nicht die Verwendung eines Glases oder Verdampfer zu genehmigen. Bitte folgen Sie dem Hinweis auf die IACUC Ausschuss Ihrer Institution.
    HINWEIS: Wenn Glasmit Tee-Kugel und / oder Nasenkonus mit Isofluran-soakd Watte verwendet werden, müssen das Tier genau zu beachten, um Überdosis Narkosemittel und Tod zu vermeiden. Der Vorteil der Verwendung eines Verdampfers und Anästhesiekammer ist, daß sie gesteuert Isofluran Verabreichung dass versehentliche Überdosierung vermieden. ACHTUNG: Isofluran ist ein Inhalationsanästhetikum. Verwenden Sie in einem gut belüfteten Ort und minimieren Einatmen.
  5. Entfernen Sie die Maus aus dem Glas / Verdampfer und legen Sie sie auf dem Rücken auf einem Papiertuch und breitete die Beine.
  6. Bedecken Nase der Maus mit einem Nasenkegel (ein Rohr mit dem Verdampfer, die eine kontrollierte isoflurance Dosis, die bei einigen Verdampfereinheiten ausgestattet kommt bereitstellt) oder 50 ml konischen Röhrchen mit einem Wattebausch, das eine geringe Menge (etwa 1-2 ml ) von Isofluran.
  7. Klopfen Sie vorsichtig die Blase beim Wasserlassen zu induzieren und sorgen für eine mit Hohlräumen versehene Blase. Wischen Sie die periurethralen Bereich mit 100% Ethanol abwischen. Dab die Impfung Nadel / Spritze, zeigen erste, in derchirurgische Gleitmittel.
  8. Inokulieren jeder Maus mit 50 ul der Bakterienlösung durch Einführen der Impfnadel transurethral, ​​ungefähr 12 mm, und Niederdrücken des Spritzenstempels vorsichtig, um das Inokulum in die Blase sanft (10 & mgr; l / sec) zu verzichten. Entfernen Sie die Impfung Nadel aus der Maus.
    HINWEIS: Sofortige Rückkehr Inokulum an der Harnröhrenöffnung, wenn zu Beginn zu impfen zeigt falsche oder unvollständige Einführung der Nadel.
  9. Entfernen Sie die Maus vom Nasenkonus und wieder in seinem Käfig. Wiederholen Sie die Schritte 3,3-3,8 für jede Maus. Wenn / wenn Schalt Inokulum Bedingungen / Stämme, entsorgen Sie die Spritze und Impfung Nadel in einem zugelassenen Entsorgungsboxen und beginnen Sie erneut mit Schritt 3.2.
    HINWEIS: Die Impfung mit uropathogenen Organismen in der Regel nicht starken Schmerzen Symptome verursachen. Doch in seltenen Fällen die Verabreichung hoher Dosen von Krankheitserregern kann Fieber, Verminderung der Futter- und Wasseraufnahme und Verhaltensstörungen verursachen. EINnimal Gesundheit sollte während des gesamten Experiments überwacht. Wenn offene Schmerzsymptome sind Vorankündigung, ein Analgetikum, wie Buprenorphin (0,05 bis 0,1 mg / kg subkutan), angewendet werden. Verfahren sollten gemäß dem IACUC jeder Institution.

4. Bestimmung der Bakterienlasten

  1. Bereiten separaten 5-ml-Röhrchen für jede Blase und Nieren Paar, geerntet werden. 1 ml 1x PBS / Rohr / Blasemaus In den geerntet werden. In 0,8 ml 1x PBS / Rohr / Paar Maus Nieren, geerntet werden. Beschriften Sie jedes Rohr, um auf eine Maus entsprechen. Bereiten Sie eine Platte mit 96 Vertiefungen mit 180 ul 1x PBS in jede Vertiefung für 01.10 Verdünnungsreihen.
  2. Reinigen Sie den Arbeitsbereich mit 70% Ethanol und decken den Bereich mit einem saugfähigen Abdeckung oder Papiertuch.
  3. Betäuben die Maus mit Isofluran (siehe Schritt 3.4), bis die Maus aufhört zu atmen für ca. 1 min, dann legen Sie sie auf dem absorbierenden Abdeckung oder Papiertuch. Andere Verfahren der euthanasia werden auch von IACUC Ausschüsse, wie Kohlendioxid akzeptiert und kann zum Überdosis Isofluran ersetzt werden.
  4. Opfern Sie die Maus durch schnelle Genickbruch, die der Zurückhalten des Halses an der Basis des Kopfes und ziehen den Schwanz horizontal vom Körper weg, bis Dislokation auftritt besteht.
    HINWEIS: Die meisten IACUC Ausschüsse erfordern ein zweites Mittel zur Euthanasie und Genickbruch ist eine gängige Methode. Jedoch können auch andere Verfahren verwendet werden, wenn durch die IACUC Ausschuss genehmigt werden.
  5. Legen Sie die tote Maus auf dem Rücken und Spray 70% Ethanol auf dem Bauch. Zerlegen der Maus, Ernte der Nieren und Blase, die in dieser Reihenfolge, um eine mögliche Kontamination aus dem Blut nach der Nieren Dissektion minimieren. Legen Sie die Organe unabhängig voneinander in die vorbereiteten Röhrchen mit 5 ml 1x PBS (siehe Schritt 4.1).
    HINWEIS: Verwenden Sie verschiedene Scheren für die externe Präparation und für den Organraub, um eine Kontamination zu minimieren.
  6. Tippen Sie auf das Rohr, um sicherzustellen, dass die Organe sind in ter 1x PBS. Wiederholen Sie die Schritte 4,3-4,5 für jede Maus. Sauberen Schere und Pinzette in 70% Ethanol nach jeder Maus.

5. Bakterielle Wieder

  1. Homogenisieren geernteten Harnblase und Nieren in den 5-ml-Röhrchen mit einer Gewebe-Homogenisator 15 sec pro Niere und 30 Sekunden pro Blasen. Homogenisator sequentiell Spülung in 1 × PBS, 70% Ethanol und 1x PBS zwischen den Proben.
  2. Stellen Sie serielle Verdünnungen 1.10 out bis 10 -8 und Schild Jede Verdünnung für CFU (koloniebildende Einheiten) auf LB-Agarplatten. Die Platten bei 37 ° C Inkubieren über Nacht und zählen Kolonien am nächsten Tag.

6. IBC Enumeration

  1. Aseptisch entfernen Sie die Blase und legen Sie sie in 1x PBS in einer 6-Lochplatte mit einem Silikon-Unterseite. Die Platten können mit einem Silikonelastomer-Kit und Gießen ca. 1 cm aus Silikon in jeder gut vorbereitet sein, siehe Herstelleranweisungen. Schneiden Sie die Blase in der Mitte mit einer Schere.
  2. Mit kleinen Metallnadeln leicht spreizen die bladder so dass die Blasenlumen nach oben weist. Achten Sie darauf, die Stifte an den äußersten Rändern der Blase Abschnitte setzen, um sicherzustellen, die maximale Menge an Urothel ausgesetzt ist.
  3. Nach dem Spreizen, vorsichtig waschen die Blase einmal mit 1x PBS. Entfernen Sie die 1x PBS mit einer Pipette. Befestigen Sie die Blase durch Zugabe von 3% Paraformaldehyd genug, um den gesamten gespreizten Blase abzudecken. ACHTUNG: Paraformaldehyd ist krebserregend. Geeignete Schutzausrüstung, einschließlich der Handschuhe, sind jederzeit getragen werden. Entsorgung muss Institutionsrichtlinien zu folgen.
  4. Inkubieren bei Raumtemperatur für 1 Stunde. Entfernen Paraformaldehydlösung. Einmal mit 1x PBS waschen.
  5. LacZ mit Waschlösung (2 mM MgCl 2, 0,01% Natriumdesoxycholat und 0,02% Nonidet-p40in 1x PBS) dreimal für 5 Minuten pro Waschgang waschen.
  6. Entfernen der Waschlösung und füge ausreichend LacZ-Färbung (9,5 ml LacZ Waschlösung, 0,4 ml 25 mg / ml X-gal und 0,1 ml 100 mM K-Ferrocyanid / K-Ferricyanid), um die Blasen zu bedecken. Inkubieren bei 30 ° C overnight vor Licht geschützt.
  7. Entfernen gespreizt Blasen von Inkubator und beobachten IBCs, die als mit einem Binokular, 40-60X Vergrößerung sichtbar gemacht, wie blau puncta angezeigt.
    HINWEIS: Manchmal kann eine Maus vor der Platzierung des Rohrs unter der Harnröhre urinieren. In diesem Fall warten Sie 15-20 Minuten bevor Sie versuchen, Urin wieder zu sammeln.

7. Urinentnahme für Bakteriurie CFU Enumeration (gilt nicht für CAUTI)

  1. Um Urin vorge sammeln oder nach der Infektion sanft zurückhalten die Maus, indem Sie den Schwanz und stellen Sie es auf eine ebene erhöhten Fläche (oben auf der Maus Käfig).
  2. Halten Sie eine sterile 1,5 ml-Röhrchen unter der Maus Urethra. Drücken Sie vorsichtig auf die Rückseite der Maus in der Nähe des Schwanzes, um Druck auf die Blase anzuwenden. Fangen Sie den Urin in der 1,5-ml-Tube.
  3. Stellen Sie serielle Verdünnungen 1.10 out bis 10 -7 und Platte jeder Verdünnung auf entsprechende LB. Die Platten bei 37 ° C Inkubieren über Nacht und zählen Kolonien am nächsten Tag.

8. CAUTI Modell Protocol, Katheter-Nadel Vorbereitung CAUTI Modell (Abbildung S2)

  1. Entfernen Sie die Kappe des 30 G Nadel. Schneiden Sie ein 7 mm Stück PE10 Schlauch und 5 mm Stück Silikonschlauch wie RenaSIL. Fädeln Sie die Nadel mit PE10 Schlauch, bis die Schläuche der Basis der Nadel berührt.
  2. Dann füttern die 5 mm Stück auf den PE10 haltigen Nadel. UV die Nadeln Baugruppen über Nacht zu sterilisieren.
    HINWEIS: Beim Laden der Silikonschlauch, lassen Sie etwa 1 mm des Schlauchs an der Nadelspitze erstreckt.

9. E. faecalis OG1RF Bakterieninokulum Vorbereitung

  1. Vorbereitung OG1RF Inokulum beginnend 48 Stunden vor der Inokulation Tag. Streak OG1RF auf eine BHI (Brain Heart Infusion) Platte aus einem gefrorenen Vorrat.
  2. Wählen eine Kolonie und inokulieren es in 10 ml BHI und wachsen sie statisch 18 h bei 37 ° C. Zentrifugieren Sie die Kultur und das Waschen des Pellets (3 mal) in 1 ml Volumina sterile 1x PBS.
  3. Resuspendieren Bakterienpellet in 1x PBS. Messen Sie bakterielle optische Dichte und stellen Sie die Konzentration auf die gewünschte Inokulumgröße. Die Standard-Konzentration des Inokulums beträgt 10 7; jedoch kann dieser aufgrund der Gestaltung der Studie variieren

10. Katheter Implantation

  1. Reinigen Sie die Workstation mit 70% Ethanol und decken den Bereich mit einem saugfähigen Abdeckung (oder verwenden Sie sterile Flow-Haube).
  2. Bringen Katheter-Nadel in eine leere 1 ml (TB) Spritze. Schneiden Sie ein 1-Zoll-Quadrat Stück Parafilm und legte einen Klecks chirurgische Schmiermittel (ungefähr die Größe eines Cent) oben.
    Anmerkung: Zwei verschiedene Nadeln für die Abscheidung des Katheters und ein Inokulum minimiert zufälligen Inokulation aufgrund der mechanischen Manipulation zur Katheterimplantation notwendig ist. Dies ermöglicht auch die Bequemlichkeit der Herstellung weniger Impfnadeln.
  3. Betäuben C57BL / 6 Mäusen, indem man sie in einem 32 Unzen Glas, die ein Tee--infuser Ball mit Watte in 3 ml Isofluran oder Verdampferkammer eingeweicht (folgende fertigt Protokoll) bis bewusstlos, aber immer noch normal atmen (1 Atemzug / sec).
  4. Dann legen Sie die Maus auf dem Rücken auf einem Papiertuch und breitete die Beine. Decken Sie die Nase der Maus mit einem Nasenkonus oder 50 ml konischen Röhrchen mit Watte mit einer geringen Menge (etwa 1-2 ml) von Isofluran.
    ACHTUNG: Isofluran ist ein Inhalationsanästhetikum. Verwenden Sie in einem gut belüfteten Bereich und Einatmen minimieren, indem Forscher.
  5. Klopfen Sie vorsichtig die Blase beim Wasserlassen zu induzieren und sorgen für eine mit Hohlräumen versehene Blase. Wisch periurethralen Bereich mit 100% Ethanol zu wischen.
  6. Desinfizieren Sie die periurethralen Bereich mit 10% Povidon-Iod-Lösung mit einem Baumwollspitze Applikator. Dab die Inokulation Nadel / Spritze, zeigen erste, in das Operations Schmiermittel.
    HINWEIS: Povidin-Jod ist für Katheter-Implantation, die eine stärkere aseptische Lösung als Alkohol verwendet wird. Katheter Implantation benötigtWeitere mechanische Manipulation, um den Katheter und somit ein größeres Potential für die Kontamination einzufügen.
  7. Stecken Sie den Katheter in die Harnröhrenöffnung. Einmal in, mit Hilfe einer Pinzette, um den (7 mm PE10) langes Stück in Richtung auf die Blase drücken, damit Drücken der (5 mm Silikon) kleinen Katheter und Ablegen in die Blase. Entfernen Sie die Nadel, mit der 7 mm Schlauch noch angebracht, sofort.

11. Bakterieninokulation

  1. Folgen Sie dem Bakterieninokulation Protokoll in Abschnitt 3, unter Verwendung der hergestellten Inokulum aus Abschnitt 9. Entfernen Sie die Maus vom Nasenkonus und senden es an seinem Käfig

12. Zu jedem Zeitpunkt der Opferung

  1. Bereiten Sie 5 ml Röhrchen für Blase und Niere (Für Organe folgen Schritt 4.1) und 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen für Katheter. 1 ml 1x PBS in 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen für Katheterproben
  2. Führen Sie die Schritte 4,3-4,5. Präparieren Sie die Maus, der Ernte der Blase, Nieren und Katheter, placing die Gewebe unabhängig voneinander in 5 ml Röhrchen mit 1x PBS und der Katheter in die 1,5-ml-Eppendorf (siehe Schritt 12.1).
    HINWEIS: Verwenden Sie verschiedene Scheren für die externe Präparation und für den Organraub und Retrieval-Katheter, um eine Kontamination zu minimieren
  3. Dann folgen Sie Schritt 4.6.

13. Bakterielle Wieder

  1. Für Organe, führen Sie die Schritte 5.1 und 5.2. Für bakterielle Erholung von Kathetern, Vortex bei maximaler Geschwindigkeit für 30 Sekunden beschallt der Katheter Proben für 5 min mit einem Ultraschallbad und anschließend Wirbel bei maximaler Geschwindigkeit für weitere 30 Sek.
  2. Stellen Sie serielle Verdünnungen 1.10 out bis 10 -8 und Schild Jede Verdünnung für CFU-Enumeration auf BHI-Platten. Die Platten bei 37 ºC über Nacht inkubieren und zählen Kolonien am nächsten Tag.

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Ergebnisse

Die intravesikale Modelle unkompliziert und Katheter assoziierten UTI bieten flexible Plattformen für die Aufklärung der molekularen Mechanismen der bakteriellen Pathogenese, die Auswirkungen dieser Krankheiten auf Wirtsgewebe, und die Entwicklung und Erprobung neuer Ansätze, um diese gemeinsame und teure Infektionen zu verwalten. In Abhängigkeit von der Mausstamm und Krankheitserreger können intravesical Impfung verwendet werden, um Wirt-Pathogen-Interaktionen zu untersuchen, um Faktoren für die Initiierung oder akute ...

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Diskussion

Unkompliziert ambulant erworbenen UTI ist eine häufige und teure Infektion entfallen mehrere Millionen Grundversorgung Besucher jedes Jahr 46. Darüber hinaus sind Cautis eine gemeinsame Gesundheits erworbenen Infektionen gewordenen extrem teuer Gesundheitsdienstleister wie die Centers of Medicare und Medicaid Services nicht mehr erstattet Anbieter für die zusätzlichen Kosten für die Behandlung von im Krankenhaus erworbenen CAUTI 45 ergibt. Die Maus-Modellen der UTI, sowohl unkomplizierten Zystitis ...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Danksagungen

Die Finanzierung für diese Arbeit wurde von ORWH SCOR P50 DK064540 vorgesehen, RO1 DK 051406, RO1 AI 108749-01, F32 DK 101.171 und F32 DK 104516-01.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Material für die Katheter- und Nadelvorbereitung:
30 G NadelnBD Precision Glide30510630 G x ½ (0,3 mm x 13 mm)
PE10 Polyethylen-SchlauchBD427400Innendurchmesser -0,011 Zoll (0,28 mm); Außendurchmesser – 0,024 Zoll (0,61 mm)
RenaSIL 025 platingehärteter SilikonschlauchBraintree Scientific, IncSIL 025Innendurchmesser -0,012 x Außendurchmesser 0,025, 25 ft Spule
Material für Infektionen:
Isofluoran – IsothesiaButler Schein29405250 ml
Klarglas mit gerademGlas Kimble Chase5413289V 21
Edelstahl-Tee-Eiaus Edelstahl Schefs-AmazonPremium Loses Blatt Tee-Ei von Schefs - Edelstahl - Große Kapazität -
Nicht sterile WattebällchenFisherbrand22-456-880
50 ml Falcon TubenVWR89039-660
Isotec 3 -VaporizerOhmeda1224478
OhrlocherFisher Scientific13-812-201(falls erforderlich)
Betadin-LösungBetadin-Lösung Betadin-Lösung10% Povidie-Jod topische Lösung
WattestäbchenFisher Scientific22-037-9246 Zoll
Windeln für BankFisherbrand14206 63Saugfähige Unterlage (20" X36"
Chirurgisches GleitmittelSurgilube0281-0205-36
PräparierschereFine Science Werkzeuge, INC14084-08
Micro-Adson PinzetteFine Science Werkzeuge, INC11018-12
1 ml SpritzeBD309659Tuberkulin Slip Tip
ParafilmBemisPM9964 Zoll x 125 FT
Eppendorf RackFisherbrand05-541-1
Eppendorf RöhrchenMIDSCIAVX-T-17-C
Entnahme von Kathetern, Blasen und Nieren:
HomogenisatorPRO Scientific INCBio-Gen Pro 200
5 ml Polypropylen-RundbodenröhrchenBD352063für die Organhomogenisierung
PapiertuchGeorgia-Pacific
EthanolPharmco-AAPER11100020S200 Proof
Costar&Trade; Klare Polystyrol-96-Well-PlattenCorning3788
1x Phosphat-Natrium-KochsalzlösungSigma-AldrichP3813
BRANSONIC Ultraschallreiniger 1210Branson Ultrasonics Corporation1210<
6-Well-Gewebekultur-TestplatteTechno Plastic Products92006
PinsFine Science Tools26002-20
Sylgard 184Dow Corning3097358-1004Silikonelastomer Kit
X-gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-b-D-galactosid)Invitrogen15520-034Ultrareines
N, N-DimethylformamidSigma AldrichD4551
MgCl2 (Magnesiumchlorid)Sigma AldrichM8266
NatriumdesoxycholatSigma AldrichD6750
Nonidet-P40Roche11754599001Octylphenolpoly(ethylenglykolether)n
Kaliumhexacyanoferrat(II)-trihydrat (K-ferrOcyanid)Sigma AldrichP3289
Kaliumhexacyanoferrat(III) (K-ferrIcyanid)Sigma Aldrich60299
td colspan="4">IBC-Materialien:

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

Erratum


Formal Correction: Erratum: Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model
Posted by JoVE Editors on 8/18/2017. Citeable Link.

An erratum was issued for: Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. The Protocol section has been updated.

The ethics statement has been updated from:

Ethics statement: The Washington University Animal Studies Committee approved all mouse infections and procedures as part of protocol number 20120216, which was approved 01/11/2013 and expires 01/11/2016. Overall care of the animals was consistent with The guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the National Research Council and the USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasia procedures are consistent with the “AVMA guidelines for the Euthanasia of Animals 2013 edition.”

to:

Ethics statement: The Washington University Animal Studies Committee approved all mouse infections and procedures as part of protocol number 20150226, which expires 12/10/2018. Overall care of the animals was consistent with The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals from the National Research Council and the USDA Animal Care Resource Guide. Euthanasia procedures are consistent with the “AVMA guidelines for the Euthanasia of Animals 2013 edition.”

Step 3 has been updated from:

3. Bacterial Inoculation

  1. Clean the workstation with 70% ethanol and cover area with absorbent paper (or use sterile flow hood).
  2. Draw up to 0.9 ml of the prepared bacterial inoculum into a 1 ml (TB) syringe (remove air bubbles). Attach a prepared sterile inoculation needle with PE10 tubing, onto the syringe containing the inoculum, then sterilely trim the polyethylene tubing.
    NOTE: Leave 1 mm of tubing above the tip of the needle to avoid puncturing the bladder.
  3. Cut a 1 inch square piece of parafilm and put a dab of surgical lubricant (approximately the size of a dime) on top.
  4. Anesthetize female C3H/HeN mice by putting them in a 32 ounce glass jar containing a tea-infuser ball with cotton balls soaked with 3 ml of isoflurane or vaporizer chamber (following manufactures protocol) until unconscious but still breathing normally (1 breath/sec).
    NOTE: Some IACUC committees do not approve the use of a jar or vaporizer. Please follow the indication of the IACUC committee of your institution.
    NOTE: If glass jar with tea-ball and/or nose cone with isoflurane-soakd cotton balls are used, the animal must be carefully observed to avoid anesthetic overdose and death. The advantage of using a vaporizer and anesthesia chamber is that it provides controlled isoflurane administration that avoids accidental overdoses. CAUTION: Isoflurane is an inhalation anesthetic. Use in a well-ventilated area and minimize inhalation.
  5. Remove the mouse from the jar/vaporizer and place it on its back on a paper towel and spread the legs.
  6. Cover the nose of the mouse with a nose cone (a tube connected to the vaporizer that provides a controlled isoflurance dose that comes equipped on some vaporizer units) or 50 ml conical tube with a cotton ball containing a small amount (approximately 1-2 ml) of isoflurane.
  7. Gently palpitate the bladder to induce urination and ensure a voided bladder. Wipe the periurethral area with 100% ethanol wipe. Dab the inoculation needle/syringe, point first, into the surgical lubricant.
  8. Inoculate each mouse with 50 µl of the bacteria solution by inserting the inoculation needle transurethrally, approximately 12 mm, and pressing down on the syringe plunger gently to dispense the inoculum into the bladder gently (10 µl/sec). Remove the inoculation needle from the mouse.
    NOTE: Immediate return of inoculum at the urethral opening when beginning to inoculate indicates improper or incomplete insertion of the needle.
  9. Remove the mouse from nose cone and return it to its cage. Repeat steps 3.3-3.8 for each mouse. When/if switching inoculum conditions/strains, dispose of the syringe and inoculation needle in an approved sharps container and start again step 3.2.  
    NOTE: Inoculation with uropathogenic organisms generally does not cause severe pain symptoms. However, in rare instances, administering large doses of pathogens may cause fever, reduction in food and water intake and abnormal behavior. Animal health should be monitored throughout the experiment. If overt pain symptoms are notice, an analgesic, such as Buprenorphine (0.05−0.1 mg/kg given subcutaneously), can be applied. Procedures should be in accordance with each institution’s IACUC.

to:

3. Bacterial Inoculation

  1. Clean the workstation with 70% ethanol and cover area with absorbent paper (or use sterile flow hood).
  2. Draw up to 0.9 ml of the prepared bacterial inoculum into a 1 ml (TB) syringe (remove air bubbles). Attach a prepared sterile inoculation needle with PE10 tubing, onto the syringe containing the inoculum, then sterilely trim the polyethylene tubing.
    NOTE: Leave 1 mm of tubing above the tip of the needle to avoid puncturing the bladder.
  3. Cut a 1 inch square piece of parafilm and put a dab of surgical lubricant (approximately the size of a dime) on top.
  4. Anesthetize female C3H/HeN mice by putting them in a vaporizer chamber (following manufactures protocol) until unconscious but still breathing normally (1 breath/sec).
    NOTE: Some IACUC committees do not approve the use of a vaporizer. Please follow the indication of the IACUC committee of your institution.
    CAUTION: Isoflurane is an inhalation anesthetic. Use in a well-ventilated area and minimize inhalation.
  5. Remove the mouse from the vaporizer and place it on its back on a paper towel and spread the legs.
  6. Cover the nose of the mouse with a nose cone (a tube connected to the vaporizer that provides a controlled isoflurance dose that comes equipped on some vaporizer units) to maintain anesthetization.
  7. Gently palpitate the bladder to induce urination and ensure a voided bladder. Wipe the periurethral area with 100% ethanol wipe. Dab the inoculation needle/syringe, point first, into the surgical lubricant.
  8. Inoculate each mouse with 50 µl of the bacteria solution by inserting the inoculation needle transurethrally, approximately 12 mm, and pressing down on the syringe plunger gently to dispense the inoculum into the bladder gently (10 µl/sec). Remove the inoculation needle from the mouse.
    NOTE: Immediate return of inoculum at the urethral opening when beginning to inoculate indicates improper or incomplete insertion of the needle.
  9. Remove the mouse from nose cone and return it to its cage. Repeat steps 3.3-3.8 for each mouse. When/if switching inoculum conditions/strains, dispose of the syringe and inoculation needle in an approved sharps container and start again step 3.2.  
    NOTE: Inoculation with uropathogenic organisms generally does not cause severe pain symptoms. However, in rare instances, administering large doses of pathogens may cause fever, reduction in food and water intake and abnormal behavior. Animal health should be monitored throughout the experiment. If overt pain symptoms are notice, an analgesic, such as Buprenorphine (0.05−0.1 mg/kg given subcutaneously), can be applied. Procedures should be in accordance with each institution’s IACUC.

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