Klonierung und großtechnische Produktion von High-Capacity Adenovirusvektoren Auf der Grundlage des humanen Adenovirus Typ 5

Zusammenfassung

Es wird ein Protokoll zur Erzeugung von adenoviralen Vektoren mit hoher Kapazität vorgestellt, bei denen alle viralen kodierenden Sequenzen fehlen. Die Klonierung von Transgenen, die im Vektorgenom enthalten sind, basiert auf Homing-Endonukleasen. Die Virusamplifikation in Produzentenzellen, die als adhärente Zellen und in Suspension gezüchtet werden, beruht auf einem Helfervirus, das virale Gene in trans bereitstellt.

Zusammenfassung

Adenovirale Vektoren (HCAdV) mit hoher Kapazität, die keine viralen kodierenden Sequenzen enthalten, stellen aufgrund ihrer hohen Verpackungskapazität (bis zu 35 kb), ihrer geringen Immunogenität und geringen Toxizität einen der fortschrittlichsten Gentransfervektoren dar. Für viele Laboratorien wird der Einsatz von HCAdV jedoch durch das komplizierte Verfahren zur Konstruktion des Vektorgenoms und zur Virusproduktion erschwert. Hier wird ein detailliertes Protokoll zur effizienten Klonierung und Herstellung von HCAdV auf Basis des Plasmids pAdFTC beschrieben, das das HCAdV-Genom enthält. Die Konstruktion von HCAdV-Genomen basiert auf einem Klonierungsvektorsystem unter Verwendung von Homing-Endonukleasen (I-CeuI und PI-SceI). Jedes interessierende Gen von bis zu 14 kb kann in den Shuttle-Vektor pHM5 subkloniert werden, der eine multiple Klonierungsstelle enthält, die von I-CeuI und PI-SceI flankiert wird. Nach I-CeuI und PI-SceI-vermittelter Freisetzung des Transgens aus dem Shuttle-Vektor kann das Transgen in den HCAdV-Klonierungsvektor pAdFTC eingefügt werden. Aufgrund der Größe des pAdFTC-Plasmids und der langen Erkennungsstellen der verwendeten Enzyme, die mit einer starken DNA-Bindung verbunden sind, ist ein sorgfältiger Umgang mit den Klonierungsfragmenten erforderlich. Für die Virusproduktion wird das HCAdV-Genom durch denNot-I-Verdau freigesetzt und in eine HEK293-basierte Produzentenzelllinie transfiziert, die stabil Cre-Rekombinase exprimiert. Um alle adenoviralen Gene für die Adenovirus-Amplifikation bereitzustellen, ist eine Koinfektion mit einem Helfervirus erforderlich, das ein Packungssignal enthält, das von loxP-Stellen flankiert wird. Die Voramplifikation des Vektors wird in Produzentenzellen durchgeführt, die auf Oberflächen gezüchtet werden, und die großflächige Amplifikation des Vektors wird in Spinnerkolben mit Produzentenzellen durchgeführt, die in Suspension gezüchtet werden. Für die Virusaufreinigung werden zwei Ultrazentrifugationsschritte auf Basis von Cäsiumchlorid-Gradienten durchgeführt, gefolgt von einer Dialyse. Hier werden Tipps, Tricks und Abkürzungen vorgestellt, die in den letzten Jahren für die Arbeit mit diesem HCAdV-Vektorsystem entwickelt wurden.

Einleitung

Für gentherapeutische Anwendungen ist es von großer Bedeutung ist es, zytotoxische und immunogene Nebenwirkungen durch die Expression von viralen Proteinen, das Transgen selbst oder von ankommenden viralen Proteine ​​zu vermeiden. Adenovirus-Vektoren (AdV) werden häufig verwendet, um Fremd-DNA in eine Vielzahl von Zellen einzuführen, um die Auswirkungen der Expression des Transgens ^1,2 zu untersuchen. Das am weitesten fortgeschrittene Version von AdV wird durch Hochleistungs-Adenovirus-Vektoren (HCAdV) fehlen alle viralen kodierenden Sequenzen ^3,4 und damit eine Verpackungskapazität von bis zu 35 kb bei geringer Immunogenität und geringe Toxizit....

Protokoll

1. Konstruktion von rekombinanten HCAdV Genome auf der Grundlage der Plasmid pAdFTC

Hinweis: Alle Plasmide wurden zuvor ^11,12 beschrieben und sind auf Anfrage erhältlich. Das Klonierungsverfahren ist schematisch in Abbildung 1 dargestellt.

1. Klonen eines Gens von Interesse (GOI) einschließlich Promotor und Polyadenylierungssignal (PA) in das Shuttle-Plasmid PHM5, unter Verwendung einer Klonierungsstrategie der Wahl, um PHM5-GOI generieren.
   Hinweis: Da pAdFTC ist ein relativ großes Plasmid werden klassische Plasmidpräparation Protokolle empfohlen sheering der Plasmid-DNA unter Verwendung von komm....

Ergebnisse

Hier repräsentative Beispiele für die Klonierung, Amplifikation und Reinigung von HCAdV Zubereitungen gezeigt. Ein Überblick über die Klonierungsstrategie (Abbildung 1) und repräsentative Beispiele für das Klonen und die Freisetzung des HCAdV Genom durch Restriktionsenzymverdau vorgesehen sind (Figur 2). Eine typische Restriktionsmuster nach dem Lösen der GOI-Expressionskassette aus PHM5 von PI- Sce I und I Ceu ich verdauen und anschlie.......

Diskussion

Die hier vorgestellte Protokoll erlaubt die Reinigung von HCAdV Vektoren auf Basis menschlichen Adenovirus Typ 5 basierend auf zuvor beschriebene Verfahren ^4,12. Die HCAdV Genom innerhalb der pAdFTC Plasmid ist frei von allen Adenovirusgene und nur trägt die 5'- und 3'-ITR und das Verpackungssignal. In dieser Strategie die HV AdNG163R-2 ⁴ stellt alle notwendigen Gene, die für eine effiziente Virusproduktion in trans. Dies bietet eine Verpackungskapazität von bis zu 35 kb, was einde.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
I-CeuI	New England Biolabs	R0699S	Restriktionsaufschluss
PI-SceI	New England Biolabs	R0696S	Restriktionsaufschluss
T4 Ligase	New Engand Biolabs	M0202S	Ligatur
SwaI	New England Biolabs	R0604S	Restriktionsverdau
NotI	New England Biolabs	R0189S	Restriktionsverdau
Kalb Darm alkalische Phosphatase (CIP)	New England Biolabs	M0290S	Dephosphorylierung von verdauten Plasmiden
Hygromycin B	PAN Biotech	P02-015	Selektion von CRE exprimierenden 116 Zellen
DMEM	PAN Biotech	P04-03590	Hek293T Zellkulturmedium
Minimal Essential Medium (MEM) Eagle	PAN Biotech	P04-08500	116 Zellkulturmedium
Dulbecco' s Phosphatpuffer Kochsalzlösung (DPBS)	PAN Biotech	P04-36500	Waschen von Zellen, Resuspension von Zellen
250-ml-Vorratsflasche	Sigma	CLS430281-24EA	Infektion von 116 in Suspension gezüchteten Zellen
500 ml PP CentrifugeTubes	Sigma	CLS431123-36EA	Sedimentation von Zellen aus Suspensionskultur
Spinnerkolben	Bellco	1965-61030	Wachstum von 116 Zellen in Aufhängung
Ultra Clear Ultrazentrifugenröhrchen	Beckmann Coulter	344059	Dichtegradientenzentrifugation
Ultrazentrifuge	Beckmann Coulter		Dichtegradientenzentrifugation
SW-41 Rotor	Beckmann Coulter		Dichtegradientenzentrifugation
Spectrum Laboratories Spectrapor Membrane	VWR	132129	Dialyseschläuche
gebrauchsfertige Dialysekassetten	Thermo	66383	One-Shot-Dialyse-DH10B
elektrokompetentes E. coli	invitrogen	C4040-52	Transformation von Ligationsreaktionen
PureYield Plasmid Midiprep System	Promega	A2495	midiprep
peqGOLD Gewebe-DNA-Mini-Kit	Peqlab	12-3396-02	Isolierung von genomischer DNA
SuperFect Transfection Reagenz	Qiagen	301305	Transfektion von 116 Zellen
opti MEM (10% FBS)	Gibco	31985-062	Transfektion von 116 Zellen
iQ SYBR Green Supermix	BioRad	170-8882	q-PCR
CFX 96 C1000 Berührung	Biorad		qPCR-Gerät
Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol	Carl Roth	A156.1	Aufreinigung von DNA
Cäsiumchlorid	Carl Roth	8627.1	Dichtegradientenzentrifugation
Natriumacetat 99%	Carl Roth	6773.2	DNA-Fällung
LB medium	Carl Roth	X968.3	bakterielles Wachstumsmedium
Ethanol  99,8% rein	Carl Roth	9065.5	DNA-Fällung und Waschen
SDS 99,5%	Carl Roth	2326.2	Lyse  Puffer
EDTA	Carl Roth	8043.2	Lyse  Puffer
Tris-HCl 99%	Carl Roth	9090.3	Dialysepuffer/ Lyse  Puffer
Glycerin 99,5%	Carl Roth	3783.1	Dialysepuffer
MgCl2 98,5%	Carl Roth	KK36.2	Dialysepuffer
NaCl	Carl Roth	3957.1	optional Dialysepuffer
KH2PO4	Carl Roth	3904.2	optional Dialysepuffer
Saccharose	Carl Roth	9286.1	optional Dialysepuffer
Na2HPO4x2H2O	Carl Roth	4984.2	fakultativ Dialysepuffer
1,5-ml-Röhrchen	Sarstedt	72.730.005	Lagerung von Viruspräparaten bei -80 &°; C