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Methodenartikel

Mess DNA-Schädigung und -Reparatur in Maus-Splenozyten nach chronischer

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DOI:

10.3791/52912

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3. Juli 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Radiological Protection Research and Instrumentation, Canadian Nuclear Laboratories

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Ein Protokoll zur Bewertung von Veränderungen des DNA-Schadensniveaus und der DNA-Reparaturkapazität, die durch chronische in vivo Niedrigdosis-Bestrahlung in Milz-Lymphozyten von Mäusen induziert werden können, durch Messung von phosphoryliertem Histon H2AX, einem Marker für DNA-Doppelstrangbrüche, mittels Durchflusszytometrie wird vorgestellt.

Zusammenfassung

Niedrig dosierte Strahlenbelastung kann eine Vielzahl von biologischen Wirkungen, die in Menge und Qualität von den durch hohe Strahlendosen hergestellt Effekte unterschiedlich sind zu produzieren. Auf Fragen zu Umwelt-, Arbeits- und Gesundheitssicherheit in der richtigen und wissenschaftlich fundierte Weise bezogen in hohem Maße von der Fähigkeit, die biologischen Effekte von niedrig dosiertem Schadstoffe wie ionisierende Strahlung und chemische Substanzen genau zu messen. DNA Schädigung und Reparatur sind die wichtigsten Frühindikatoren für Gesundheitsrisiken aufgrund ihrer potentiellen langfristigen Folgen, wie zum Beispiel Krebs. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um die Auswirkungen von chronischen in vivo Exposition gegenüber niedrigen Dosen von γ- und β-Strahlung auf DNA-Schädigung und Reparatur in Mäusemilzzellen studieren. Verwendung eines allgemein akzeptierten Marker der DNA-Doppelstrangbrüche, phosphoryliert Histon H2AX genannt γH2AX zeigen wir, wie es verwendet werden kann, um nicht nur das Niveau der DNA-Schädigung zu beurteilen, sondern auch Änderungenin der DNA-Reparatur-Kapazität möglicherweise durch geringe Dosis in vivo Aufnahmen produziert. Durchflusszytometrie ermöglicht eine schnelle, genaue und zuverlässige Messung der immunofluorescently markierten γH2AX in einer großen Anzahl von Proben. DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur kann, indem extrahierte Milzzellen zu einer Herausforderung Dosis von 2 Gy, eine ausreichende Anzahl von DNA-Brüche zu erzeugen, um die Reparatur auslösen und durch Messung der induzierten (1 h nach der Bestrahlung) und Rest DNA-Schäden (ausgewertet werden 24 Stunden nach der Bestrahlung). Rest-DNA Schaden würde auf unvollständige Reparatur und die Gefahr von Langzeit genomische Instabilität und Krebs. In Kombination mit anderen Assays und Endpunkte, die sich leicht in solchen Untersuchungen in vivo (beispielsweise Chromosomenaberrationen, Mikronuclei Frequenzen im Knochenmark von Retikulozyten, Genexpression, etc.) gemessen werden können, ermöglicht diese Vorgehensweise eine genaue und Kontext Evaluierung der biologischen Wirkungen von Stressoren niedrigen Niveau.

Einleitung

Signifikante Kontroverse über die möglichen schädlichen Auswirkungen von entweder niedrigen oder sehr niedrigen Dosen ionisierender Strahlung und die Angst vor Strahlung Öffentlichkeit, durch Bilder der Hiroshima und Nagasaki Atombombenabwürfe und seltener AKW Unfälle angetrieben (verschärft durch Massenmedien), hat zu sehr strengen Strahlenschutzverordnung und Normen, die möglicherweise wissenschaftlich begründet sind es nicht. In den letzten drei Jahrzehnten wurden zahlreiche Berichte sowohl das Fehlen von schädlichen und das Vorhandensein von potenziell positiven biologischen Effekte von niedrig dosiertem Strahlen 1-4 induzierte dokumentiert. Der Hauptstrahlungsgesundheitsrisikofaktor ist die Wahrscheinlichkeit von Krebs, basierend auf epidemiologische Studien von Überlebenden der Atombomben Empfangen hohen oder mittleren Dosen von Strahlung geschätzt. Lineare Extrapolation dieser Daten (so genannte lineare-no-Schwelle oder LNT-Modell) verwendet wird, um Risiken von Krebs bei niedrigen Dosen zu schätzen. Allerdings hat dieser Ansatz nicht weltweiten wissenschaftlichen Akzeptanz erhaltenund ist stark umstritten 5.

Es ist offensichtlich, dass weitere Studien erforderlich sind, um diese Frage zu klären und möglicherweise Strahlenschutznormen zu verbessern. Solche Studien sollten chronische Behandlungen (beste Angleichung der Umwelt- und Arbeitspositionen), in vivo-Tiermodellen (am besten für die Extrapolation Wirkungen auf die menschliche) und solchen Endpunkten als DNA-Schäden Tarife, DNA-Reparatur und Mutagenese beinhalten. Es ist bekannt, dass die DNA das primäre Ziel für Beschädigung Strahlungseffekte und unvollständige oder fehlerhafte Reparatur kann zum Mutagenese und Krebsentwicklung 6 führen.

DNA-Doppelstrangbrüche (DSB) sind eines der schädlichsten Arten von DNA-Läsionen und können den Zelltod der Tumorgenese und 7 führen. Es ist daher wichtig, dass das Niveau des DSB nach Exposition gegenüber niedrigen Strahlungsdosis und / oder anderen Stressfaktoren, wie zum Beispiel chemische Schadstoffe sicher und genau zu messen. Eine der sensitiven und spezifischen MarkernDNA-DSB phosphoryliert Histon H2AX, genannt γH2AX 8 noch weitere Marker und Methoden wurden vorgeschlagen 9,10. Es wird geschätzt, dass Tausende von H2AX Moleküle in der Nähe eines induzierten DSB, sind bei der Bildung von γH2AX was den Nachweis einzelner DSB durch Immunmarkierung mit einem Anti-Antikörper γH2AX und Fluoreszenzmikroskopie 11 beteiligt. Die Antwort ist sehr schnell und erreichte ihr Maximum zwischen 30 und 60 min. Beweise vorliegen, dass γH2AX erleichtert Reparatur von DNA-DSB durch die Gewinnung von anderen Reparaturfaktoren zu den Orten der Brüche und durch Modifikation der Chromatinstruktur zu gebrochenen DNA-Enden zu verankern und den Zugang für andere Reparaturproteine ​​(in 12 überprüft). Nach Abschluss der Reparatur von DNA-DSB, γH2AX wird dephosphoryliert und / oder durchläuft Abbau und neu synthetisierten H2AX Moleküle zu ersetzen γH2AX in den betroffenen Bereichen des Chromatins 10. Überwachung Bildung und Verlust der γH2AX können,liefern daher eine genaue Schätzung der DNA-DSB-Reparatur-Kinetik. Dieser Ansatz wurde verwendet, um die Reparatur von DSB in verschiedenen menschlichen Tumorzelllinien mit hohen Dosen von Strahlung und deren Geschwindigkeit und Rest DSB Niveaus bestrahlt wurde gezeigt, dass mit radiosensitivity 13-15 korrelieren studieren.

Modifizierten wir dieses experimentellen Ansatzes und wendeten sie auf eine in vivo-Maus-Studie die Wirkung von niedrigen Dosen von chronischen γ- und β-Bestrahlung auf DNA-DSB-Reparatur-Ebenen und (1) zu untersuchen. Erstens, zeigen wir ein Verfahren, um einen langfristigen chronischen Exposition von Mäusen durchgeführt, um β-Strahlung entweder durch Tritium emittierte (Wasserstoff-3) in Form von tritiiertem Wasser (HTO) oder organisch gebundenem Tritium (OBT) gelöst im Trinkwasser . Die beiden Formen werden voraussichtlich zu akkumulieren und / oder anders im Körper und somit zu verteilen, erzeugen unterschiedliche biologische Wirkungen. Beide Formen sind potentielle Gefahren in der Nuklearindustrie. Diese Behandlungdurch chronische Einwirkung von γ-Strahlung in einer äquivalenten Dosis Rate parallel um einen korrekten Vergleich der beiden Strahlungsarten, die entscheidend für die Bewertung der relativen biologischen Wirksamkeit zu ermöglichen. Beta-Strahlung von Elektronen zusammengesetzt ist, so dass es sehr verschieden von der γ-Strahlung, Hochenergiephotonen. Aufgrund dieses Unterschieds Β-Strahlung stellt hauptsächlich Innen Gefahr für die Gesundheit und können unterschiedliche biologische Wirkungen im Vergleich zu γ-Strahlung zu erzeugen. Diese Komplikation zu erheblichen Kontroversen über die Regulierung der Einwirkung von β-Strahlung, die von HTO emittiert. So Regulierungsebenen HTO im Trinkwasser für die Öffentlichkeit variieren von 100 Bq / L in Europa zu 75.000 Bq / L in Australien. Es ist daher wichtig für die biologische Wirkung von HTO um äquivalente Dosen von γ-Strahlung zu vergleichen. Zweitens, die Rate der DNA-DSB wird in isolierten Splenozyten nach Beendigung der chronischen Exposition mit immunofluorescently markierten γH2AX erkennen gemessendurch Durchflusszytometrie ed. Dies erlaubt die Bewertung des Ausmaßes der DNA-Schädigung durch die in vivo Exposition zugefügt. Allerdings ist es sinnvoll, zu erwarten, dass solche eine niedrige Belastung möglicherweise nicht produzieren keine nachweisbaren Raten von DNA-DSB; statt, einige versteckte Änderungen / Reaktionen zu erwarten, dass die Fähigkeit der Zellen auf DNA-Schäden reparieren beeinflussen würde. Diese Veränderungen, falls vorhanden, kann entweder stimulierend (Herstellung eines nützlichen Effekt) oder inhibierende (Herstellung eines schädlichen Effekt). Das vorgeschlagene Protokoll erlaubt, bei der diese Änderungen durch die Herausforderung der entnommenen Milzzellen mit einer hohen Dosis an Strahlung, die eine erhebliche Menge an Schaden entsteht (zB 2 Gy Herstellung etwa 50 DNA-DSB pro Zelle oder eine. 3 - 5-fachen Zunahme der Gesamt γH2AX Ebene) . Anschließend wird die Bildung und den Verlust der γH2AX, was die Initiierung und Abschluss der DSB-Reparatur wird mittels Durchflusszytometrie kontrolliert. Auf diese Weise kann nicht nur die basale und Behandlung induzierten Niveaus von DNA-DSB gemessen werden, sondernauch ihre potenziellen Auswirkungen auf die Fähigkeit der Zellen zu reagieren und Reparatur DNA-Schäden, die durch viel höhere Stressniveaus induziert.

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Protokoll

Alle Maus-Handling und Behandlungsverfahren sollten Regeln her durch den Gesetzgeber und / oder Tierpflegeprogramme eingestellt und von einem lokalen Tierschutzkommission genehmigt einzuhalten. Alle in diesem Protokoll beschriebenen Methoden wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care mit Zustimmung des örtlichen Tierpflege Ausschuss durchgeführt.

ACHTUNG: Alle Arbeiten mit Radioaktivität (einschließlich, aber nicht, um die Handhabung von Tritium, externen γ-Bestrahlung beschränkt, Umgang mit radioaktiven tierischen Geweben, Bettwäsche Abfälle) sollten Regeln her durch den Gesetzgeber und / oder Strahlenschutzbehörden setzen haften und durch autorisierte durchgeführt werden, Personal in einem zertifizierten Labor und / oder Einrichtung.

1. Tier Arbeit

  1. Tier Grouping
    1. Wenn Mäuse werden von einer externen Organisation Ankunft zu akklimatisieren Tiere für mindestens 10 Tage in der Tierhaltung. Wenn die Studie enthält mehrere Behandlungsgruppen, zu gewährleisten, dass das Tier Lieferant al sendenl Tieren als eine einzige Partie.
    2. Mäuse nach dem Zufallsprinzip zuweisen, um den Behandlungsgruppen von 10 Mäusen pro Gruppe. Bei Verwendung von männlichen Mäusen des C57BL / 6-Stamm, die Tier Lieferanten vor, arrangieren Randomisierung von sehr jungen C57BL / 6 Männern in ihrer Einrichtung zu Aggression Probleme zu mildern.
  2. Chronische Exposition von Mäusen auf Internal β-Strahlung
    1. Bereiten Sie Arbeitskonzentrationen von Tritium (10 kBq / L und 1 MBq / L) in der Maus Trinkwasser durch Verdünnen der ursprünglichen Bestand von HTO und OBT (einer Mischung aus tritiierten Prolin, Alanin und Glycin Aminosäuren) Lösungen.
    2. Validierung der Endkonzentrationen von Tritium im Trinkwasser durch Messung der Radioaktivität unter Verwendung eines Flüssigszintillationszählers. Einzustellen Konzentrationen, falls erforderlich.
    3. Behandlung von Tieren für einen Monat durch den Zugang ad libitum an die Tritiumwasser. Wenn Wasser während der Behandlung Zeitraum von zwei Wochen zur Neige geht, fügen Sie mehr Wasser. Andernfalls ändern Flaschen auf zwei Wochen.
    4. Treat schein-bestrahlten KontrollMäusen identisch. Halten Sie sie in einem separaten Raum "sauber" oder auf einem separaten "sauber" Rack unter Luftüberdruck, um Tritium Kreuzkontamination aus der Luft zu vermeiden.
  3. Chronische Exposition von Mäusen auf externe γ-Strahlung
    Hinweis: γ-Bestrahlungsanlage / Geräte werden je nach Standort variieren.
  4. Verwenden von verfügbaren Methoden der Dosimetrie, bestimmen die Abstände von einem γ-Strahlungsquelle, Strahlungsfeldern die gewünschten Dosisleistungen haben. Stellen Sie sicher, Homogenität der Strahlungsfelder in den Bereichen Abdeckung der Tierkäfige.
    Anmerkung: 1,7 μGy / h entspricht einer Dosisrate von 1 MBq / L Tritium im Körper produziert.
  5. Expose Mäusen, indem Mäusekäfige an den in Schritt 1.3.1 für einen Monat festgelegt Distanzen. Minimieren tägliche Unterbrechung γ-Bestrahlung 30 min. Verwenden Thermolumineszenz-Dosimeter zur Gesamtenergiedosen zu messen.

2. Opfer und Sampling

  1. Bereiten Sie sterile chirurgische Instrumente, 60 mm Petrischalen mit eingelegter 70-Mikrometer-Zelle Siebe, 15 ml und 1,5 ml Röhrchen, RPMI-Medium mit 5% fötalem Rinderserum (FBS) und Ort, die alle innerhalb einer biologischen Sicherheitswerkbank ergänzt. Gewährleistung der Sterilität der Arbeit ist von entscheidender Bedeutung.
  2. Verzichtet werden 5 ml RPMI-Medium in jede 60 mm-Petrischale.
  3. Opfern Mäusen mit Hilfe eines von der lokalen Tierschutzkommission genehmigt Verfahren. Genickbruch ist eine gute Wahl für die in diesem Protokoll beschriebenen Splenozyten-Arbeit. Wenn jedoch Blutproben für weitere Assays (beispielsweise für die MFISH, Cytochalasin Block Mikronucleus oder ein anderer gemeinsamer genetoxicity Assays) benötigt werden, verwenden intrakardiale Punktion nach der Narkose mit Isofluran.
  4. Legen Sie das Tier in Rückenlage, mit dem Kopf nach von Ihnen entfernt. Sprühen Sie die Maus nach unten mit 70% Ethanol. Mit einer Pinzette greifen die Haut nach vorne in die Harnröhrenöffnung und machen einen kleinen Schnitt mit der Schere in der Dammregion.
    1. Von diesem Schnitt, entlang der ventralen Mittellinie, um den Brustraum abgeschnitten, wobei darauf geachtet, um die Muskelwand nur unter schneiden Sie die Haut und nicht. Präparieren Sie die Haut weg von der Mittellinie.
    2. Fassen Sie die Bauchwand mit einer Pinzette und entlang der Mittelachse der Muskelwand zu öffnen, die Bauchhöhle geschnitten.
  5. Auszuschneiden die Milz durch leichtes Greifen sie mit einer sterilen Pinzette und leichtes Ziehen an sie, während gleichzeitig Wegschneiden des Bindegewebes mit einer Schere.
  6. Schneiden Sie ein kleines Stück von der Milz (etwa 1/10 der Milz) und in ein 1,5-ml-Tube. Schnellfrost in flüssigem Stickstoff für eine anschließende Lagerung bei -80 ° C für Ergänzungstests.
  7. Platzieren des Restes der Milz in eine Zelle Sieb innerhalb einer 60 mm Petrischale mit 5 ml vorge verzichtet RPMI Medium.
  8. Gehen Sie zum nächsten Maus.
    Hinweis: Extrahiert Milz kann in 60 mm-Schalen mit Medien gehalten werden (für bis zu 2 Stunden), während der Rest der Mäuse sind sacrificed. Abhängig von der Zahl der Teilnehmer, zwischen 5 und 15 Mäuse in einem Tag verarbeitet.

3. Herstellung von Splenozyten-Kulturen

  1. Homogenisierung der Milz durch Zerkleinern in einer Zelle Sieb mit einer sterilen Pinzette mit einer gebogenen Ende.
  2. Entfernen Sie die Zelle Sieb und Sammeln des gefilterten Zellsuspension aus der 60-mm-Schale in einen 15-ml-Tube.
  3. Spülen Zellsieb mit 5 ml Medium, um den Rest der Zellen zu sammeln.
  4. Zentrifugenröhrchen bei 300 g für 5 min bei RT.
  5. Dekantieren und resuspendieren Pellet in 10 ml RPMI.
  6. Zentrifugenröhrchen bei 300 g für 5 min bei RT.
  7. Dekantieren und resuspendieren Pellet in 5 ml RPMI.
  8. 4 ml der Zellsuspension in eine 25 ml Gewebekulturflasche, und einem CO 2 -Inkubator entfernen (37 ° C, 5% CO 2, 80% Luftfeuchtigkeit)

4. Anspruchs Bestrahlung und Befestigung

  1. Übertragen Sie dierestlichen 1 ml Zellsuspension aus Schritt 3.8 in ein 1,5-ml-Röhrchen auf Eis und Zentrifugieren bei 300 xg für 5 Minuten bei 4 ° C. DNA-Schäden in dieser Probe gemessen wird sowohl die Behandlung induzierte Schäden und t = 0 Datenpunkt für den Aufbau einer DNA-Reparatur-Kurve darstellen.
  2. Vorsichtig den Überstand aspirieren mit einer Vakuumpumpe. Vorsichtig resuspendieren Pellet in 1 ml TBS-Puffer (20 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 2,7 mM KCl).
  3. Zentrifugenröhrchen bei 300 g für 5 min bei 4 ° C. Vorsichtig den Überstand aspirieren mit einer Vakuumpumpe. Vorsichtig resuspendieren Pellet in 300 ul TBS.
  4. Unter Mischen auf einem Vortex bei niedriger Geschwindigkeit, fügen 700 ul von -20 ° C 100% Ethanol. Schließen Sie den Deckel und schwenken, um zu mischen.
  5. Lagern die Proben bei -20 ° C. Splenozyten in Ethanol fixiert werden bei -20 ° C für mindestens 12 Monate lang ohne nennenswerten Verlust in der γH2AX Signal gespeichert werden.
  6. Bestrahlen die Splenozyten-Kulturen von Schritt 3.8 mit einem herausfordernden γ-rad iation Dosis von 2 Gy in einer Dosisrate ≥ 200 mGy / min unter Verwendung verfügbarer Bestrahlungseinrichtung.
    Anmerkung: Der Zweck dieser Bestrahlung zu DNA-DSB-Reparatur zu induzieren, um die Maschinen herauszufordern. Röntgenstrahlung kann auch für diesen Zweck verwendet werden.
  7. Die Kulturen sofort zu einem CO 2 Inkubator zurück.
  8. 1 Stunde nach der anspruchsvollen 2 Gy Bestrahlung, entfernen Sie die Kulturen aus dem Inkubator zu einem biologischen Sicherheitsschrank. Um eine repräsentative Probe aliquoten sammeln, sanft resuspendieren Zellen mit einer Pipette und 1 ml der Zellsuspension in ein 1,5 ml Röhrchen auf Eis. Rückgabe der Zellkulturen zu einem CO 2 -Inkubator.
  9. Zentrifugenröhrchen bei 300 g für 5 min bei 4 ° C. Vorsichtig den Überstand aspirieren mit einer Vakuumpumpe. Vorsichtig resuspendieren Pellet in 1 ml TBS.
  10. Wiederholen Sie die Schritte 4,3-4,5.
  11. 24 Stunden nach der Herausforderung 2 Gy γ-Bestrahlung, Ernte und beheben bei = 24 Stunden Probe, wie in Schritt 4.8 beschrieben - 4.10.
tle "> 5. Immunfluoreszenz-Markierung mit Anti-γH2AX Antikörper

Hinweis: In der Regel 15 - können 30 Proben pro Tag immunofluorescently markiert und mittels Durchflusszytometrie in einem einzigen Durchlauf getestet werden. Um einen genauen Vergleich zwischen den Behandlungsgruppen zu gewährleisten, sind Probe (n) aus jeder Gruppe. Siehe auch Referenz 16 für weitere Details.

  1. Bereiten Sie eine markierte Satz von Rohren für die Anzahl der zu verarbeitenden Proben und auf Eis. Verwenden Sie 12 x 75 mm nicht begrenzten Glasröhren. Sterilität wird nicht für diese Arbeit erforderlich. Fügen Sie eine weitere historische Kontrollprobe für die Kennzeichnung mit sekundärem Antikörper nur ("nur 2. Ab"). Verwenden Sie diese historische Kontrollprobe in jeder Durchflusszytometrie innerhalb einer Studie laufen.
  2. 0,5 ml eiskaltem TBS in jedes Röhrchen.
  3. Entfernen Sie feste Splenozyten von -20 ° C, Wirbel für 5 Sekunden und übertragen ein 0,5-ml-Aliquot auf vorbereiteten Röhrchen mit TBS. Setzen Sie den Rest der Proben zurück in -20 ° C Lagerung undhalten als Backup-Probe.
  4. Zentrifuge Splenozyten bei 300 g für 5 min bei 4 ° C. Dekantieren und sanft resuspendieren Pellet in 1 ml eiskaltem TBS mit 1% FBS
  5. Zentrifuge Zellen bei 300 g für 5 min bei 4 ° C. Den Überstand abgießen und vorsichtig resuspendieren Pellet in 1 ml TST-Puffer (0,05% Triton X-100, 2% FBS in TBS). Inkubieren für 20 Minuten auf Eis.
  6. Zentrifuge Zellen bei 300 g für 5 min bei 4 ° C. Den Überstand abgießen und vorsichtig resuspendieren Pellet in 200 ul des primären Anti γH2AX Antikörper verdünnt 1: 150 in TST-Puffer. Verwenden Sie 200 ul von TST für die "2nd Ab nur" Kontrollprobe.
  7. Position Röhrchen auf einer rotierenden Schüttelmaschine bei einem Winkel von 45 - 60 ° C und Schütteln für 1,5 h bei 300 · g bei RT.
  8. Während Rohre Inkubieren, bereiten ein ausreichendes Volumen (200 ul / Probe) der Ziege-anti-Maus Sekundär-Antikörper mit Alexa-488 bei einer 1 konjugiert: 200-Verdünnung in TST-Puffer.
    Hinweis: Alle Arbeiten, die mit Alexa-488konjugierten Antikörper (Schritte 5,10-5,16 unten) sollte unter Schwachlicht-Bedingungen durchgeführt werden und markierten Proben sollten vor Licht durch Umwickeln Rohre in Aluminiumfolie geschützt werden.
  9. Sobald die 1,5 h Inkubation abgeschlossen ist, wird mit 1 ml eiskaltem TBS, enthaltend 2% FBS in jedes Röhrchen und Zentrifugieren bei 300 xg für 5 Minuten bei 4 ° C. Den Überstand abgießen und vorsichtig resuspendieren Pellet in 1 ml TBS, enthaltend 2% FBS.
  10. Zentrifuge bei 300 × g für 5 min bei 4 ° C. Dekantieren und vorsichtig resuspendieren Pellet in 200 & mgr; l des sekundären Antikörpers aus Schritt 5.8.
  11. Der Proben auf einem Schütteltisch 1 h inkubieren, wie in 5.7.
  12. 1 ml eiskaltem TBS mit 1% FBS.
  13. Zentrifuge bei 300 × g für 5 min bei 4 ° C. Dekantieren und sanft resuspendieren Pellet in 1 ml eiskaltem TBS.
  14. Zentrifuge bei 300 × g für 5 min bei 4 ° C. Den Überstand abgießen und vorsichtig resuspendieren Pellet in 0,5 ml TBS, enthaltend 50 & mgr; g / mlPropidiumiodid.
  15. Inkubation für 5 Minuten bei Raumtemperatur vor Licht geschützt.
  16. Analyse Proben auf einem Durchflusszytometer mit gerätespezifischen Protokollen 16. Lesen Sie mindestens 10.000 Zellen pro Probe.

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Ergebnisse

Abbildung 2 zeigt Beispiele für die Durchflusszytometrie Graphen für Splenozyten erwartet unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren hergestellt. Die Zellen werden zunächst auf Basis des Streudiagramm gated (2A und 2D; elektronische Band ist gleichbedeutend mit Vorwärtsstreuung). FL3 / Propidiumiodid Histogramme (2B und 2E) bestätigen normalen Zellzyklus-Verteilung. Bedeuten γH2AX S...

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Diskussion

Die hier vorgestellte Protokoll ist nützlich für die Durchführung von Groß Maus in vivo Studien der Prüfung der genotoxischen Wirkungen von geringen Mengen von verschiedenen chemischen und physikalischen Mitteln, einschließlich ionisierender Strahlung. Unsere einzigartige spezifischen pathogenfreien Tierhaltung mit einer GammaBeam 150 Bestrahlungs ausgestattet und eine 30 Meter lange Bestrahlungshalle ermöglicht die Durchführung lebenslangen Studien mit niedrigen oder sehr niedrigen Dosisrate Bestrahlungen auf ...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bekannt sind.

Danksagungen

Die Autoren möchten sich für den Beitrag unserer Kollegen Sandrine Roch-Lefevre und Eric Gregoire vom Institut für Strahlenschutz und nukleare Sicherheit (Paris, Frankreich) bedanken. Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Wissenschafts- und Technologieprogramm der kanadischen Regierung an den Canadian Nuclear Laboratories (Chalk River, Ontario, Kanada), die CANDU Owners Group (Toronto, Ontario, Kanada), die Canadian Nuclear Safety Commission und das Institute of Radioprotection and Nuclear Safety (Paris, Frankreich).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
HTO: tritiiertes Wasser, [3H]lokal aus einem Kernreaktor gewonnen Lageraktivität 3,7 GBq/mL;  substituierbar mit HTO von Perkin Elmer
OBT: Alanin, L-[3-3H]: organisch gebundenes Tritium (OBT)Perkin ElmerNET348005MC1 mCi/ml (185 MBq)
OBT: Glycin, [2-3H]: organisch gebundenes TritiumPerkin ElmerNET004005MC1 mCi/ml (185 MBq)
OBT: Prolin, L-[2,3-3H]: organisch gebundenes Tritium (OBT)Perkin ElmerNET323005MC1 mCi/ml (185 MBq)
tritiiertes Wasser, [3H] (HTO)Perkin ElmerNET001B005MCErsatz für HTO lokalen Ursprungs   
GammaBeam 150 BestrahlungsgerätAtomic Energy of Canada Limitedkann durch eine andere g-Strahlungsquelle mit ausreichend geringer Aktivität ersetzt werden 
Tween-20Sigma AldrichP1379-500ML
RPMIFisher ScientificSH3025501Hyclone RPMI 1640 mit L-Glutamin und HEPES 500 ml
fötales RinderserumSigma AldrichF1051-100ML
Anti-gH2AX-Antikörper, Klon JBW301Millipore05-636
Alexa Fluor-488 Ziegen-Anti-Maus-AntikörperLife Technologies (ehemals Invitrogen)A21121
PropidiumjodSigma AldrichP4864-10ML1 mg/ml
EthanolKommerzielle AlkoholeP006-EAAN500 ml Flaschen Absolutes Ethanol
1,5 ml RöhrchenFisher Scientific2682550Mikrozentrifugenröhrchen
15 ml RöhrchenFisher Scientific05-539-5sterile Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen
flüssiger StickstoffLindeP110403
12 x 75 mm unverschlossene GlasröhrchenFisher ScientificK60B1496126Einweg-Borosilikatglasröhrchen mit glattem Ende
T25 KolbenVWRCA15708-120nunc tisue culture 25ml Kolben (Lieferanten-Nr. 156340)
SchereFine Science Tools14068-12Wagner Schere 12 cm scharf/scharfe
Pinzette, gerade Fine Science Tools11008-13Semken Pinzette 13 cm, gerade
Pinzette, gebogenFine Science Tools11003-12Narrow Pattern Pinzette 12 cm, gebogen
60 mm PetrischalenVWRCA25382-100BD Falcon Gewebekulturschale 60 x 15 mm
Zellsiebe, 70 mmFisher Scientific08-771-2Falcon Zellsiebe 50/Karton
PBS-Rezept: 1 Tablette in 200 ml entionisiertem Wasser gelöst, pH-Wert bei Bedarf auf 7,4 einstellen.Sigma AldrichP4417-100TABPhosphat gepufferte Kochsalztabletten
TBS Rezept: zur Herstellung von 10x Vorrat
30 g TRIS HClSigma AldrichT3253-1KGTrizma Hydrochlorid
88 g NaClFisher ScientificS271-500Natriumchlorid
2 g KClFisher ScientificP217-500Kaliumchlorid
In 1 l entionisiertem Wasser auflösen, pH-Wert auf 7,4
einstellen

Referenzen

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