Ein Protokoll zur Bewertung von Veränderungen des DNA-Schadensniveaus und der DNA-Reparaturkapazität, die durch chronische in vivo Niedrigdosis-Bestrahlung in Milz-Lymphozyten von Mäusen induziert werden können, durch Messung von phosphoryliertem Histon H2AX, einem Marker für DNA-Doppelstrangbrüche, mittels Durchflusszytometrie wird vorgestellt.
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Methodenartikel
Mess DNA-Schädigung und -Reparatur in Maus-Splenozyten nach chronischer
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Niedrig dosierte Strahlenbelastung kann eine Vielzahl von biologischen Wirkungen, die in Menge und Qualität von den durch hohe Strahlendosen hergestellt Effekte unterschiedlich sind zu produzieren. Auf Fragen zu Umwelt-, Arbeits- und Gesundheitssicherheit in der richtigen und wissenschaftlich fundierte Weise bezogen in hohem Maße von der Fähigkeit, die biologischen Effekte von niedrig dosiertem Schadstoffe wie ionisierende Strahlung und chemische Substanzen genau zu messen. DNA Schädigung und Reparatur sind die wichtigsten Frühindikatoren für Gesundheitsrisiken aufgrund ihrer potentiellen langfristigen Folgen, wie zum Beispiel Krebs. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um die Auswirkungen von chronischen in vivo Exposition gegenüber niedrigen Dosen von γ- und β-Strahlung auf DNA-Schädigung und Reparatur in Mäusemilzzellen studieren. Verwendung eines allgemein akzeptierten Marker der DNA-Doppelstrangbrüche, phosphoryliert Histon H2AX genannt γH2AX zeigen wir, wie es verwendet werden kann, um nicht nur das Niveau der DNA-Schädigung zu beurteilen, sondern auch Änderungenin der DNA-Reparatur-Kapazität möglicherweise durch geringe Dosis in vivo Aufnahmen produziert. Durchflusszytometrie ermöglicht eine schnelle, genaue und zuverlässige Messung der immunofluorescently markierten γH2AX in einer großen Anzahl von Proben. DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur kann, indem extrahierte Milzzellen zu einer Herausforderung Dosis von 2 Gy, eine ausreichende Anzahl von DNA-Brüche zu erzeugen, um die Reparatur auslösen und durch Messung der induzierten (1 h nach der Bestrahlung) und Rest DNA-Schäden (ausgewertet werden 24 Stunden nach der Bestrahlung). Rest-DNA Schaden würde auf unvollständige Reparatur und die Gefahr von Langzeit genomische Instabilität und Krebs. In Kombination mit anderen Assays und Endpunkte, die sich leicht in solchen Untersuchungen in vivo (beispielsweise Chromosomenaberrationen, Mikronuclei Frequenzen im Knochenmark von Retikulozyten, Genexpression, etc.) gemessen werden können, ermöglicht diese Vorgehensweise eine genaue und Kontext Evaluierung der biologischen Wirkungen von Stressoren niedrigen Niveau.
Einleitung
Signifikante Kontroverse über die möglichen schädlichen Auswirkungen von entweder niedrigen oder sehr niedrigen Dosen ionisierender Strahlung und die Angst vor Strahlung Öffentlichkeit, durch Bilder der Hiroshima und Nagasaki Atombombenabwürfe und seltener AKW Unfälle angetrieben (verschärft durch Massenmedien), hat zu sehr strengen Strahlenschutzverordnung und Normen, die möglicherweise wissenschaftlich begründet sind es nicht. In den letzten drei Jahrzehnten wurden zahlreiche Berichte sowohl das Fehlen von schädlichen und das Vorhandensein von potenziell positiven biologischen Effekte von niedrig dosiertem Strahlen 1-4 induzierte dokumentiert. Der Haupts....
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Protokoll
Alle Maus-Handling und Behandlungsverfahren sollten Regeln her durch den Gesetzgeber und / oder Tierpflegeprogramme eingestellt und von einem lokalen Tierschutzkommission genehmigt einzuhalten. Alle in diesem Protokoll beschriebenen Methoden wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care mit Zustimmung des örtlichen Tierpflege Ausschuss durchgeführt.
ACHTUNG: Alle Arbeiten mit Radioaktivität (einschließlich, aber nicht, um die Handhabung von Tritium, externen γ-Bestrahlung beschränkt, Umgang mit radioaktiven tierischen Geweben, Bettwäsche Abfälle) sollten Regeln her durch den Gesetzgeber und / oder Strahlenschutzbehörden setzen haften und durch ....
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Ergebnisse
Abbildung 2 zeigt Beispiele für die Durchflusszytometrie Graphen für Splenozyten erwartet unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren hergestellt. Die Zellen werden zunächst auf Basis des Streudiagramm gated (2A und 2D; elektronische Band ist gleichbedeutend mit Vorwärtsstreuung). FL3 / Propidiumiodid Histogramme (2B und 2E) bestätigen normalen Zellzyklus-Verteilung. Bedeuten γH2AX S.......
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Diskussion
Die hier vorgestellte Protokoll ist nützlich für die Durchführung von Groß Maus in vivo Studien der Prüfung der genotoxischen Wirkungen von geringen Mengen von verschiedenen chemischen und physikalischen Mitteln, einschließlich ionisierender Strahlung. Unsere einzigartige spezifischen pathogenfreien Tierhaltung mit einer GammaBeam 150 Bestrahlungs ausgestattet und eine 30 Meter lange Bestrahlungshalle ermöglicht die Durchführung lebenslangen Studien mit niedrigen oder sehr niedrigen Dosisrate Bestrahlungen auf .......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bekannt sind.
Danksagungen
Die Autoren möchten sich für den Beitrag unserer Kollegen Sandrine Roch-Lefevre und Eric Gregoire vom Institut für Strahlenschutz und nukleare Sicherheit (Paris, Frankreich) bedanken. Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Wissenschafts- und Technologieprogramm der kanadischen Regierung an den Canadian Nuclear Laboratories (Chalk River, Ontario, Kanada), die CANDU Owners Group (Toronto, Ontario, Kanada), die Canadian Nuclear Safety Commission und das Institute of Radioprotection and Nuclear Safety (Paris, Frankreich).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| HTO: tritiiertes Wasser, [3H] | lokal aus einem Kernreaktor gewonnen | Lageraktivität 3,7 GBq/mL; substituierbar mit HTO von Perkin Elmer | |
| OBT: Alanin, L-[3-3H]: organisch gebundenes Tritium (OBT) | Perkin Elmer | NET348005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| OBT: Glycin, [2-3H]: organisch gebundenes Tritium | Perkin Elmer | NET004005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| OBT: Prolin, L-[2,3-3H]: organisch gebundenes Tritium (OBT) | Perkin Elmer | NET323005MC | 1 mCi/ml (185 MBq) |
| tritiiertes Wasser, [3H] (HTO) | Perkin Elmer | NET001B005MC | Ersatz für HTO lokalen Ursprungs |
| GammaBeam 150 Bestrahlungsgerät | Atomic Energy of Canada Limited | kann durch eine andere g-Strahlungsquelle mit ausreichend geringer Aktivität ersetzt werden | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379-500ML | |
| RPMI | Fisher Scientific | SH3025501 | Hyclone RPMI 1640 mit L-Glutamin und HEPES 500 ml |
| fötales Rinderserum | Sigma Aldrich | F1051-100ML | |
| Anti-gH2AX-Antikörper, Klon JBW301 | Millipore | 05-636 | |
| Alexa Fluor-488 Ziegen-Anti-Maus-Antikörper | Life Technologies (ehemals Invitrogen) | A21121 | |
| Propidiumjod | Sigma Aldrich | P4864-10ML | 1 mg/ml |
| Ethanol | Kommerzielle Alkohole | P006-EAAN | 500 ml Flaschen Absolutes Ethanol |
| 1,5 ml Röhrchen | Fisher Scientific | 2682550 | Mikrozentrifugenröhrchen |
| 15 ml Röhrchen | Fisher Scientific | 05-539-5 | sterile Zentrifugenröhrchen aus Polypropylen |
| flüssiger Stickstoff | Linde | P110403 | |
| 12 x 75 mm unverschlossene Glasröhrchen | Fisher Scientific | K60B1496126 | Einweg-Borosilikatglasröhrchen mit glattem Ende |
| T25 Kolben | VWR | CA15708-120 | nunc tisue culture 25ml Kolben (Lieferanten-Nr. 156340) |
| Schere | Fine Science Tools | 14068-12 | Wagner Schere 12 cm scharf/scharfe |
| Pinzette, | gerade Fine Science Tools | 11008-13 | Semken Pinzette 13 cm, gerade |
| Pinzette, gebogen | Fine Science Tools | 11003-12 | Narrow Pattern Pinzette 12 cm, gebogen |
| 60 mm Petrischalen | VWR | CA25382-100 | BD Falcon Gewebekulturschale 60 x 15 mm |
| Zellsiebe, 70 mm | Fisher Scientific | 08-771-2 | Falcon Zellsiebe 50/Karton |
| PBS-Rezept: 1 Tablette in 200 ml entionisiertem Wasser gelöst, pH-Wert bei Bedarf auf 7,4 einstellen. | Sigma Aldrich | P4417-100TAB | Phosphat gepufferte Kochsalztabletten |
| TBS Rezept: zur Herstellung von 10x Vorrat | |||
| 30 g TRIS HCl | Sigma Aldrich | T3253-1KG | Trizma Hydrochlorid |
| 88 g NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | Natriumchlorid |
| 2 g KCl | Fisher Scientific | P217-500 | Kaliumchlorid |
| In 1 l entionisiertem Wasser auflösen, pH-Wert auf 7,4 |
Referenzen
- Mitchel, R. E., Jackson, J. S., McCann, R. A., Boreham, D. R. The adaptive response modifies latency for radiation-induced myeloid leukemia in CBA/H mice. Radiat Res. 152 (3), 273-279 (1999).
- Shadley, J. D. Chromosomal adaptive response in human lymphocytes. Radiat Res<....
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Nachdrucke und Genehmigungen
