Die vaskulären Endothelzellen spielen eine bedeutende Rolle bei vielen wichtigen Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Dieser Artikel beschreibt eine einfache Methode, um Endothelzellen aus der Aorta der Maus zu isolieren und zu erweitern, ohne spezielle Geräte zu verwenden. Unser Protokoll bietet ein wirksames Mittel zur Identifizierung von Mechanismen in der Physiopathologie von Endothelzellen.
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Methodenartikel
Isolation und Primärkultur von Maus Aortic Endothelial Cells
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Das vaskuläre Endothel ist essentiell für die normale vaskuläre Homöostase. Seine Funktionsstörung ist an verschiedenen Herz-Kreislauf-Erkrankungen beteiligt. Die Maus ist ein wichtiges Modell für die Erforschung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Diese Studie demonstriert eine einfache Methode, um Endothelzellen aus der Aorta der Maus ohne spezielle Ausrüstung zu isolieren und zu kultivieren. Um Endothelzellen zu isolieren, wird die thorakale Aorta schnell aus dem Mauskörper entfernt und das anhaftende Fettgewebe und Bindegewebe aus der Aorta entfernt. Die Aorta wird in 1 mm dicke Ringe geschnitten. Jeder Aortenring wird geöffnet und mit dem Endothel nach unten auf eine wachstumsfaktorreduzierte Matrix ausgesät. Die Segmente werden für etwa 4 Tage in Endothelzellwachstumsmedium kultiviert. Die Endothelkeimung beginnt bereits am 2. Tag. Anschließend werden die Segmente entfernt und die Zellen kontinuierlich kultiviert, bis sie die Konfluenz erreichen. Die Endothelzellen werden mit neutraler Proteinase geerntet und für zwei weitere Passagen in Endothelzellwachstumsmedium kultiviert, bevor sie für Experimente verwendet werden. Die Immunfluoreszenzfärbung zeigte, dass nach der zweiten Passage die Mehrzahl der Zellen doppelt positiv für die Dil-ac-LDL-Aufnahme, die Lektinbindung und die CD31-Färbung war, die typischen Eigenschaften von Endothelzellen. Es wird vermutet, dass Zellen an der zweiten bis dritten Passage für in vitro und in vivo Experimente zur Untersuchung der Endothelbiologie geeignet sind. Unser Protokoll bietet ein wirksames Mittel zur Identifizierung spezifischer zellulärer und molekularer Mechanismen in der Physiopathologie von Endothelzellen.
Einleitung
Das vaskuläre Endothel nicht nur eine Barriereschicht ist , die Blut und Gewebe trennt, wird eine große endokrine Drüse betrachtet , die mit einer Oberfläche von 400 Quadratmetern 1 über den gesamten Gefäßbaum erstreckt. Das Wohlbefinden des Endothels ist wesentlich für vaskuläre Homöostase. Die dysfunktionalen Endothels beteiligt sich an verschiedenen kardiovaskulären Erkrankungen wie Atherosklerose, Vaskulitis und Ischämie / Reperfusion Verletzungen, usw. 2-4. Bis heute sind die spezifischen zellulären und molekularen Mechanismen in dieser Krankheitseinstellungen beteiligt sind nicht gut verstanden durch die diffuses anatomischen Natu....
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Protokoll
1. Isolierung von Aorta von Mäusen
Alle hier beschriebenen Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee von der Wayne State University genehmigt.
- Setzen Sie die Maus in die Induktionskammer der Anästhesiemaschine. Stellen Sie die Isofluran - Flow auf 4% in Verbindung mit 25% Frischluft und 75% O 2. Anesthetize die Maus durch Inhalation von Isofluran (4% für die Induktion, ± 1,0% für die Wartung) in Verbindung mit 25% Frischluft und 75% O 2 über Induktionskammer durch einen eigenen Bugnase gefolgt. HINWEIS: Anästhesie mit Isofluran kann in 75% Sauerstoff / 25% Luft oder 100%....
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Ergebnisse
Endothelzell Sprießen
Spontane Endothelzellen aus einem Maus-Aorta-Segment gestartet sprießen. Die Maus-Aorta-Segment wurde für 4 Tage auf einem Wachstumsfaktor-reduzierte Matrix dann in endothelialen Zellwachstumsmedium wachsen gelassen. Die Endothelzellen Austrieb erscheint in der Regel innerhalb von 2 - 4 Tage. Photomikrographien wurden am Tag 4 (Figur 1) aufgenommen. Wie in den Abbildungen gezeigt, wandern zahlreiche Endothelzellen aus dem Segment entfer.......
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Diskussion
Diese Studie zeigt, ein einfaches Verfahren zur Isolierung und Kultur Endothelzellen von einer Maus Aorta ohne spezielle Ausrüstung. Die Immunfluoreszenzfärbung zeigte, daß die Mehrzahl der Zellen Endothelzellen nach dem zweiten Durchgang waren. Es wird vorgeschlagen , dass die Zellen am zweiten in den dritten Durchgang geeignet sind , in vitro und in vivo Experimenten endothelial biology zu studieren.
Die EVP - ED aus dem Protokoll
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Diese Studie wird unterstützt durch den American Heart Association Scientist Development Grant 13SDG16930098 und den National Science Foundation of China Youth Award 81300240 (PI: Wang). Wir danken Roberto Mendez von der Wayne State University für die Unterstützung bei der Erstellung des Manuskripts.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 4 oder 6 Wochen alte Mäuse | Jackson Laboratory | #000664 | |
| Steril 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | Gibco | #10010-023 | |
| Steril 1x PBS mit 1.000 U/ml Heparin | Sigma Aldrich | H3149 | |
| Endothelzell-Wachstumsmedium (Dulbeccos' Modifizierter Adler" s Medium [DMEM] mit 25 mM HEPES [Gibco, #12320-032], ergänzt mit 100 μ g/mL Nahrungsergänzungsmittel für das Wachstum von Endothelzellen aus rinderischem Nervengewebe [EKGS, Sigma, #2759], 10% fötales Rinderserum [FBS, Gibco, #10082-147], 1.000 U/mL Heparin [Sigma Aldrich, H3149], 10.000 U/mL Penicillin und 10 mg/ml Streptomycin [Gibco, #15140-122]) | |||
| Wachstumsfaktor reduzierte Matrix | BD Biosciences | 356231 | |
| Neutrale Proteinase (Dispase, 1 U/mL, Fisher Scientific, #CB-40235) und D-Val Medium (D-Valin, 0,034 g/L, Sigma, #1255), in Dulbeccos' Modifizierter Adler" s Mittel, niedriger Glukosegehalt (Gibco, #12320-032) | |||
| 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindo-Carbocyanin-perchlorat-markiertes acetyliertes LDL (Dil-ac-LDL) | Life Technologies | L3484 | |
| FITC-markiertes Ulex europaeusAgglutinin (Ulex-Lectin) | Sigma | L9006 | |
| Anti-Maus-CD31-FITC-konjugierter Antikörper | BD Biosciences | 553372 | |
| Anti-Maus vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 Antikörper | Cell Signaling | 9698 | |
| Anti-Maus endotheliale Stickstoffmonoxid-Synthase | Abcam | ab5589 | |
| Anti-Maus vaskuläres Endothel-Cadherin | Abcam | 33168 | |
| Anti-Maus Calponin | Abcam | 700 | |
| FITC-konjugiertes Anti-Kaninchen-IgG | Sigma | F6005 | |
| 1-ml-Spritze mit 25-G-Nadel | Fisher Scientific | 50-900-04222 | |
| 100 mm Perischalen | Fisher Scientific | 07-202-516 | |
| Sechs-Well-Zellkulturplatten | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| T12.5 Kulturflasche | Fisher Scientific | 50-202-076 | |
| Scheren, Pinzetten, Mikrodissektionsscheren und -zangen, Skalpellklinge | Fine Science Tools, Inc. | ||
| Anästhesiegerät mit Isofluran | Webster Veterianary Supply | 07-806-3204 | |
| Heizlampe | |||
| Zentrifugengerät | |||
| Inverses Phasenkontrastmikroskop | |||
| Inverses Fluoreszenzmikroskop |
Referenzen
- Simionescu, M. Implications of early structural-functional changes in the endothelium for vascular disease. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 27, 266-274 (2007).
- Cid, M. C., Segarra, M., Garcia-Martinez, A., Hernandez-Rodriguez, J.
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Nachdrucke und Genehmigungen
