Verfahren für Dezellularisierung von Rattenlebern in einer oszillierenden Druck Perfusionsvorrichtung

Zusammenfassung

Die vorgestellten Techniken zur Leberentnahme, Kanülierung und Perfusion unter Verwendung unseres proprietären Geräts ermöglichen ausgefeilte Perfusionsaufbauten, um Dezellularisierungs- und Rezellularisierungsexperimente in Rattenlebern zu verbessern.

Zusammenfassung

Dezellularisierung und Rezellularisierung von parenchymalen Organen könnten die Erzeugung von funktionsfähigen Organen in vitro ermöglichen, und mehrere Protokolle zur Dezellularisierung der Leber von Nagetieren wurden bereits veröffentlicht. Unser Ziel war es, den Dezellularisierungsprozess durch die Konstruktion eines proprietären Perfusionsgeräts zu verbessern, das eine selektive Perfusion über die Pfortader und/oder die Leberarterie ermöglicht. Darüber hinaus haben wir versucht, eine Perfusion unter oszillierenden Umgebungsdruckbedingungen durchzuführen, um die Homogenität der Dezellularisierung zu verbessern. Die Homogenität der Perfusionsdezellularisierung war bisher ein unterschätzter Faktor. Während der Dezellularisierung können Bereiche innerhalb des Organs, die schlecht durchblutet sind, noch Zellen enthalten, während die extrazelluläre Matrix (ECM) in gut durchbluteten Bereichen bereits von alkalischen Detergenzien betroffen sein kann. Oszillierende Druckänderungen können die intraabdominalen Druckänderungen nachahmen, die während der Atmung auftreten, um die Mikroperfusion in der Leber zu optimieren. In der hier vorgestellten Studie wurden dezellularisierte Rattenlebermatrizen durch histologische Färbung, DNA-Gehaltsanalyse und Korrosionsguss analysiert. Die Perfusion über die Leberarterie zeigte homogenere Ergebnisse als die portalvenöse Perfusion. Die Anwendung oszillierender Druckbedingungen verbesserte die Wirksamkeit der Perfusionsdezellularisierung. Lebern, die über die Leberarterie und unter oszillierenden Druckbedingungen perfundiert wurden, zeigten die besten Ergebnisse. Die vorgestellten Techniken zur Leberentnahme, Kanülierung und Perfusion mit unserem proprietären Gerät ermöglichen ausgefeilte Perfusionsaufbauten, um Dezellularisierungs- und Rezellularisierungsexperimente in Rattenlebern zu verbessern.

Einleitung

Dezellularisierung und Rezellularisierung kann die Erzeugung von funktionellen, transplantierbaren Organen in vitro ¹ zu ermöglichen. Durch Entfernung von Zellen und antigenes Material (z. B. DNA, Alpha-Gal Epitope) von einem Organ, das nicht oder weniger immunogen extrazellulären Matrix (ECM), erhalten werden. Diese Matrix konserviert die dreidimensionale Mikroanatomie eines Organs und kann als ideal Biomatrix zur Repopulation mit Zellen einer anderen, möglicherweise xenogenen Ursprungs ² dienen. Somit könnte eine dezellularisierte Rattenleber Matrix mit menschlichen Leberzellen wiederbesiedelt wird. Dieser humanisierte Mikro Leber könnte als Ex-vivo-Modell für die Erforschung von Krankheiten (z. B. angeborene Stoffwechselkrankheiten, Viruserkrankungen oder malignen Erkrankungen) oder für präklinische Arzneimittelprüfung ³ dienen.

Mehrere verschiedene Protokolle für die Rattenleberdurchblutung Dezellularisierung wurden bereits veröffentlicht ^13.04. In allen Protokollen decellularsierung wurde durch Perfusion von Alkali ionische oder nichtionische Detergentien über kanülierten Pfortader erreicht. Um das Beste aus unserem Wissen, wir waren die erste Gruppe, Rattenleber Dezellularisierung über die Pfortader und / oder dem Rattenleberarterie ¹⁴ zu melden durch selektive Perfusion. Aktivieren der selektiven Perfusion der verschiedenen Gefäßsysteme in der Leber besser Dezellularisierung Ergebnisse ermöglichen und darüber hinaus eine wichtige Rolle in der zellulären Wiederbesiedelung zu spielen.

In der Studie detailliert hier wurden Lebern in einem maßgeschneiderten proprietären Perfusionsvorrichtung perfundiert, wodurch die Perfusion unter oszillierenden Druckbedingungen. Diese Druckbedingungen imitieren die physiologische Atemabhängigen Perfusion der Leber: in situ hängt der Leber unter dem Copula der Membran, deren Bewegung während der Atmung hat einen direkten Einfluss auf die Leberperfusion. Inspiration führt insbesondere zu einer Verringerung der Membran und Zusammendrücken der Leber, zu optimierenLeber-venösen Abfluss, führt in der Erwägung, Ablauf, um Höhe der Leber und der Absenkung der intraabdominellen Druck portal-venösen Zufluss ¹⁵ zu optimieren.

Unser Ziel war es festzustellen, ob oszillierenden Druckbedingungen einen Einfluss auf die Homogenität der Rattenleber Perfusion Dezellularisierung durch die Nachahmung von intraabdominellen Bedingungen ex vivo haben. Die Homogenität der Dezellularisierung Prozess kann ein unterschätzter Faktor bei Perfusion Dezellularisierung sein. Alle bekannten Mittel verwendet für Leber Dezellularisierung Ursache Änderungen an der ECM. Zellen in schlecht durchbluteten Gebieten bleiben im ECM, während andere Bereiche bereits vollständig dezellularisiert. Um die restlichen Zellen zu lösen, muss der Perfusion Dauer oder Druck erhöht werden, was zu mehr Veränderungen an den gut durchbluteten Bereichen. Daher sollten Reinigungsmittel für Dezellularisierung homogen innerhalb des Organs verbreitet werden.

Protokoll

Die Tiere wurden nach der Fazilität für Experimentelle Medizin (FEM, Charité, Berlin, Deutschland) gehalten wird, und alle Versuchsprotokolle wurden überprüft und durch das Landesamt für Gesundheit und lokale Angelegenheiten (LAGeSo, Berlin, Deutschland zugelassen; Reg. No. O 0365 / 11).

1. Liver Harvesting

1. Präoperative Vorbereitung
   1. Verwenden Sie eine Korkplatte zur Fixierung. Setzen Sie ein medizinisches Tuch auf dem Teller. Mit vier Nadeln, fix eine Inhalationsmaske auf der Korkplatte zur intraoperativen Inhalationsnarkose.
2. Vorbereitung des Portalvenenkanüle
   1. Anschluss eines peripheren Venenkatheters (G 20) mit einem Dreiwegehahn. Der Katheter sollte schräg abgeschnitten werden, mit einer Länge von rd. 1,5 cm.
   2. De-Luft das System mit einem 10-ml-Spritze mit Ringer-Lösung gefüllt. Es ist sehr wichtig, sorgfältig zu entlüften, da Gasembolie kann sich negativ auf die Durchblutung Dezellularisierung.
3. Vorbereitungder Arterienkanüle
   1. Verwenden Sie ein Schmetterlingskanüle und schneiden Sie die Nadel auf eine Länge von 5 mm. Setzen Sie einen 5 cm Schlauch (ID 0,58 mm, AD 0,96 mm) auf die 5 mm Nadel setzen und mit Sekundenkleber. Legen Sie eine 2 cm lange Rohr (ID 0,28 mm, AD 0,61 mm) in das größere Rohr montieren und mit Sekundenkleber.
   2. Gleiten Sie einen anderen Schlauch über diese Konstruktion als Anschlag montieren und mit Sekundenkleber. De-Luft die Arterienkanüle mit einem 5-ml-Spritze mit Ringer-Lösung gefüllt.
4. Anästhesie und Analgesie
   1. Induzieren Narkose der Ratte im Narkoseinduktionskammer um 3,5% Isofluran in Sauerstoff bei einer Flussrate von 1,5 L / min.
   2. Um sicher zu Analgesie während des Betriebs zu gewährleisten, injizieren Metamizol (100 mg / kg Körpergewicht) und Niedrigdosis Ketamin / Medetomidin (10 mg / 0,1 mg pro kg Körpergewicht) intraperitoneal.
   3. Liefern 1,5% Isofluran in 1 l / min Sauerstoff über der Inhalationsmaske für die spätere Wartung der chirurgischen Anästhesie.
5. Präoperative Arrangements
   1. Rasieren Sie den Bauch zügig mit einer elektrischen Schermaschine. Feuchten Sie die rasierte Einschnittstelle auf dem Bauch mit 70% Ethanol zur Desinfektion.
   2. Legen Sie das Tier in Rückenlage auf dem vorbereiteten Platte, legen Sie den Kopf in die Inhalationsmaske und die Extremitäten mit medizinischem Klebeband und Stifte zu befestigen. Entfernen Sie überschüssiges Ethanol und Fell mit einem Gazekompresse.
6. Anästhesie-Bewertung
   1. Beurteilen Sie die Narkose Tiefe durch die Beobachtung der Atemfrequenz. Wenn die Betäubung scheint tief genug (40-60 Atemzüge / min), zu prüfen, ob Analgesie ist, indem Sie versuchen, um die Zehe Prise Reflex mit chirurgische Pinzette, um die Haut zwischen den Zehen beider Hinterbeine klemmen auslösen ausreichend.
7. Bauch-Ansatz
   1. Machen Sie eine Medianschnitt in die Schwanzbauchdecke über der Blase. Von diesem Punkt an beiden seitlichen Rippenbögen in einer V-förmig geschnitten. Achten Sie darauf, in die Membran geschnitten. Ziehen Sie die Bauchdecke schneiden auf der Brust.
   Befestigen Sie den Schwertfortsatz mit einem Overholt Klemme, ziehen Sie es nach kranial und fixieren Sie sie mit einem Gummiband. Verwenden nassen Wattestäbchen, um den Darm zu evakuieren. Wickeln Sie den Darm in einem feuchten Mullbinde. Darüber hinaus decken alle Bauchränder mit nassen Verband anlegen.
8. Liver Vorbereitung
   1. Präparieren Sie die Ligamentum falciforme. Verwenden Sie einen feuchten Mullbinde auf die mediale und linken Leberlappen kranial unter der Kuppel der Membran zu halten. Setzen Sie das Ligamentum hepatoduodenale und die obere omental Leberlappen.
   2. Verwenden Sie zwei microforceps und Frühjahr Schere sorgfältig sezieren das Band an der oberen omental Lappen angebracht, bis der Lappen ist mobil. Bewegen Sie den Lappen mit feuchten Wattestäbchen unter der Gazekompresse, halten die medialen und linken Lappen vorhanden.
   3. Nach Mobilisation der oberen omental Leberlappen, bewegen Sie den Bauch auf der linken Seite. Befestigen Sie den Magen mit einer Klemme und sezieren die kleinere Netz mit microforceps und den Feder Schere.
   4. Mobilisierung der unteren Omental Leberlappen, bis es ist mobil und anschließend die Lappen in seinem Hohlraum zu bewegen zurück. Benutzen Sie einen Haken, um den Backhaus Zwölffingerdarm zu behalten. Bewegen Sie den Zwölffingerdarm nach links zu dehnen und setzen den Ligamentum hepatoduodenale. Umschreiben den Gallengang in der gestreckten Ligamentum hepatoduodenale.
   5. Präparieren Sie die Gallengang aus dem Fettgewebe und Pankreasgewebe. Schneiden Sie den Gallengang 1,5 cm aus dem Gallengang Bifurkation. Präparieren Sie die Pfortader aus dem umgebenden Fettgewebe. Setzen Sie das gastro-Vene.
   6. Ligieren der gastroduodenalen Vene zweimal mit Seide 6-0 und teilen Sie die Vene zwischen 2 Ligaturen. Präparieren Sie die Zöliakie-Stamm und die gemeinsame Leberarterie aus dem umgebenden Gewebe, bis alle arteriellen rami enthüllt werden.
   7. Befreiung der gastroduodenalen Arterie aus dem umgebenden Gewebe. Binden Sie die A. gastroduodenalis zweimal mit Seide 6-0, mit den Beziehungen von einander entfernt. Präparieren Sie die gastroduodenalen Arterie zwischen 2 Ligaturen.
   8. Befreien Sie die Milzarterievon dem umgebenden Gewebe. Binden Sie die Milzarterie zweimal mit Seide 6-0, mit den Beziehungen von einander entfernt. Präparieren Sie die Milzarterie zwischen den 2 Ligaturen.
   9. Befreien Sie die A. gastrica sinistra aus dem umgebenden Gewebe. Binden Sie die A. gastrica sinistra zweimal mit Seide 6-0, mit den Beziehungen von einander entfernt. Präparieren Sie die Arterie zwischen 2 Ligaturen.
   10. Umgrenzen die Vena cava inferior zwischen der rechten Niere und der rechten seitlichen Leberlappen. Präparieren Sie die Vene aus dem Retroperitoneum. Expose der Aorta durch Befolgen des Truncus coeliacus.
   11. Präparieren Sie die retroperitonealen Fettgewebe. Injizieren 1000 IE Heparin in 1 ml Kochsalzlösung in die untere Hohlvene. Ziehen Sie die Kanüle, und schließen Sie den Schnitt mit einem Wattebausch. Warten Sie 1-2 Minuten für die systemische Wirkung von Heparin.
   12. Umschreiben die Aorta mit einer Pinzette. Präparieren Sie die Aorta und exsanguinate die Ratte. Weiterhin sezieren die untere Hohlvene sich distal von der Niere.
9. Portal Venen-Kanülen (Verwenden Sie die Kanüle in Abschnitt 1.2 zubereitet)
   1. Machen Sie eine Fisch-Mund-Schnitt in der distalen Pfortader. Öffnen Sie die Schnittführung mit einer Pinzette und kanülieren die Pfortader. Spülen Sie die Leber mit 20 ml Ringer-Lösung, bis die Leber entfärbt und befestigen Sie die Kanüle mit Ligaturen (6-0 Seide).
10. Arterien-Kanülen (Verwenden Sie die Kanüle in Abschnitt 1.3 zubereitet)
    1. Präparieren Sie die Aorta oberhalb des Truncus coeliacus. Befreien Sie die Aorta Segment aus dem Retroperitoneum. Schneiden Sie die Aorta Segment in Längsrichtung, um einen Aorten-Patch zu erzeugen. Legen Sie die selbst gebauten Kanüle in einen statischen Halter.
    2. Verwenden Sie 2 Pinzette, um die Aorta-Patch über der Kanüle gleiten. Ligieren die Leberarterie mit Seide 6-0 über die Kanüle und befestigen Sie den Patch auf den Anschlag.
11. Liver Explantation
    1. Öffnen Sie die Blende, einen Zirkelschnitt und sezieren die Leber von den umgebenden Strukturen.
12. Lagerung
    1. Store der Leber in einem sterilen 500 ml-Tank mit 350 ml Ringer-Lösung bis zur Verwendung gefüllt.

2. Waschmittellösungen

1. 10% Triton X-100-Stammlösung
   1. Füllen Sie einen 1000-ml-Flasche mit 900 ml aqua dest. und fügen Sie 100 ml Triton X-100 (99,9%). Verwenden Sie einen Rührer, die Triton X-100 zu lösen. Füllen Sie die Flasche mit Aqua dest. bis zu einem Gesamtvolumen von 1000 ml erreicht ist.
2. 1% Triton X-100
   1. 100 ml der Stammlösung (10%), um einen 1000-ml-Flasche. In 900 ml aqua dest. und zweimal schütteln Sie die Flasche. Filtern der 1% Triton X-100-Lösung durch ein Sterilfilter.
3. 10% SDS-Stammlösung
   1. Füllen Sie einen 1000-ml-Flasche mit 900 ml aqua dest. und fügen 66,99 g SDS (99,9%, Dichte 0,67). Verwenden Sie ein Rührwerk, das SDS zu lösen. Füllen Sie die Flasche mit Aqua dest. bis zu einem Gesamtvolumen von 1000 ml erreicht ist.
4. 1% SDS
   1. 100 ml der Stammlösung (10%), um einen 1000 ml bottle. In 900 ml aqua dest. und zweimal schütteln Sie die Flasche. Filtern der 1% SDS-Lösung durch ein Sterilfilter.

3. Dezellularisierung

1. Aufbau von Perfusionsvorrichtung

Abb. 1: Schematische Darstellung der Perfusion Gerät zur Tiefen Arterielle und venöse Portal Perfusion von Four Rattenlebern unter oszillierenden Druckbedingungen (. Von Struecker et al modifiziert ¹⁴⁾

1. Verknüpfen Sie die Drain mit einem Dreiwegehahn und einem Heidelberger Verlängerung, um den Füllstand zu regulieren und füllen den Reaktor mit 500 ml 0,9% NaCl.
   

Abb. 2: Schema der Perfusion Set-Up-Link-Perfusionskammer (1.400 cm ³⁾ (1) zum distalen Ende (4) der Luftfalle (5) über die Pfortader Zugriff (2) oder über die arterielle acProzess (3). Die Blasenfalle (5) ist mit einem Verschließen (4) am distalen Ende und einer Entlüftungsöffnung (6) ausgestattet sein. Schließen Sie die Blasenfalle (5) zu einer Heidelberger Verlängerung (7). Verknüpfen Sie die Heidelberger Verlängerung der Pumpstrecke (8). Darüber hinaus schließen Sie das Pumpensegment (8) zu einem anderen Heidelberger Verlängerung (9). Legen Sie die letzten Heidelberger Verlängerung (9) in die Flasche Spülmittel-Lösung (10). Verbinden das Beatmungsgerät (11) an der Perfusionskammer (oder an den Druckverteiler in dem Fall von mehreren Infusionen). In den Reaktor Flüssigkeiten ablaufen, schließen Sie den Abfluss in die Abfallflasche (12).

1. Setzen Sie die Pumpensegment in die Pumpe. Starten Sie die Pumpe, um den Zyklus mit PBS füllen, schließen Sie das distale Ende der Blasenfalle und öffnen Sie das Entlüftungs. Wenn der Boden der Blase fest mit PBS (2-3 cm) bedeckt ist, schließen Sie das Entlüftungs und öffnen Sie das distale Ende der Blasenfalle.
2. Liver Installations
   1. Verknüpfen Sie den Dreiwegehahn der Pfortader Kanüle dem Stand der Reaktorzugang. Cerbinden die Arterienkanüle mit dem arteriellen Zugang. Seien Sie vorsichtig, um sicherzustellen, dass keine Luft in die Systeme.
3. Anwendung des oszillierenden Druckbedingungen
   1. Atemschutz mit einer Frequenz von 15 Schlägen pro Minute und einer Amplitude von 26 mbar (min. 4 mbar, max. 30 mbar). Schließen Sie das Beatmungsgerät an die Druckverteilungskammer und schließen Sie die Kammer in den Reaktor. Starten Sie Druckanwendung.
4. Dezellularisierung Protocol
   1. Zuführen Perfusion Stufen mit einer Fließgeschwindigkeit von 5 ml / min. Starten Sie die Dezellularisierung mit Perfusion der Leber mit 1% Triton X-100 für 90 min. Erlauben Abfall Ausfluß über den Abfluss der Perfusionsvorrichtung bis der Flüssigkeitsstand im Inneren der Perfusionskammer konstant und über der perfundierten Leber halten. Nach 90 Minuten, ändern Sie das Reinigungsmittel auf 1% SDS.
      
      

Abbildung 3: Perfusion Protokoll für alle Versuchsgruppen.

Ergebnisse

Die Homogenität und damit die Wirksamkeit der verschiedenen Dezellularisierung Protokolle wurden durch makroskopische Beobachtung histologischen Analyse und Analyse der verbleibenden DNA-Gehalt innerhalb dezellularisierte Leber Matrizen ausgewertet. Darüber hinaus wurde Korrosionsgießtechnik geführt, um die intakte Mikroanatomie der Leber nach Dezellularisierung visualisieren.

Makros

Während Dezellularisierung, Leber geworden Lucent, was die Entfernung von Zellge...

Diskussion

Obwohl die hier beschriebene Methode zur Rattenleber Ernte und Dezellularisierung wird leicht reproduzierbar, gibt es bestimmte kritische Schritte zu berücksichtigen:

Während der Herstellung von Leber Ernte, ist es wichtig, zu schweren Blutungen zu vermeiden, da es die Blutgerinnung aktiviert und kann zu der Bildung von Blutgerinnseln in der Leber führen. Unserer Meinung nach ist es vorteilhaft, um die Bauchaorta direkt einzuschneiden vor Kanülierung der Pfortader, um den Blutzufluss über di...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Selbstgebaute arterielle Kanüle
Portex Unsteriler Polyethylenschlauch	SIMS Portex	REF 800/110/100	0,28 mm ID 0,61 mm Außendurchmesser
Portex Unsteriler Polyethylen-Schlauch	SIMS Portex	REF 800/110/200	0,58 mm ID 0,96 mm OD
Venodrop Safe Schmetterlingskatheter	Fresenius Kabi	3275851	21 G
Pfortaderkanüle
Peripherer Venenkatheter	BD	393224	BD Venflon Pro 20G
Drei-Wege-Hahn	Smiths medical	888-101RE
Chirurgie Wattestäbchen	Hecht-Assistent	4302
Wattepads	Shaoxing Zhengde Chirurgischer Verband	13H118-03
Mullbinde	Hubei Haige Medizinische Instrumente	14388
Ringer Solution	Fresenius Kabi	13 HKP022	1000 ml
10 ml Spritze	Braun	4606108V	10 ml/ Luer Solo
5 ml Spritze	Braun	4606061V	5 ml /Luer Solo
Naht (Silk 6/0)	Resorba	H1F	LOT 105001.81
medizinisches Tuch	Shaoxing Zhengde Chirurgischer Verband	D0613011
chirurgisch
Nadelhalter	für Instrumente Geuder	17570
Mikrozange	Inox-Electronic	91150-20
Mikroschere	Martin	11-740-11
Mikrozange	S& T
Klemme	Aesculap	BH111R
Schere	F S T	14501-14
chirurgische Zange	Aesculap	BD 557<
Atemschutzmaske	Resmed	14.24.11.0004	SmartAIR ST
Perfusionsgerät	Charit, Medizintechnik Labor	Sondervorrichtung	Dezellularisierungsgerät
Schlauchpumpe ismatec reglo ICC	IDEX	ISM4408	4-Kanal
Heidelberger Verlängerung 75 cm	Fresenius Kabi	2873	75 cm
MS/CA Pumpensegment	IDEX	IS 3510	MS/CA/click'n'go/POM-C
CA 2-Stopper-Röhrchen	Pharmed	BPT NSF-51
Blasenfalle		Sonderanfertigung
Luer-Lock-Schlauchverbinder	Neolab	Nr. 02-1887<
SDS-Pellets	Carl Roth	30,4 KN;	2,5 kg
Triton X-100	Carl Roth	3051.1	10 L
PBS	Gibco	14190-094	DPBS
Färbung
Eosin 1%	Morphisto	10177
Mayer Hämatoxylin	AppliChem	A4840
Gomori Färbung	Morphisto	11104
AlcainBlue-PAS Färbung	Morphisto	11388
Direct Red 80	Sigma Aldrich	365548