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Methodenartikel

Implementieren der Patch-Clamp und Live-Fluoreszenzmikroskopie, um funktionelle Eigenschaften von frisch isolierten PKD Epithel-Monitor

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DOI:

10.3791/53035

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1. September 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Medical College of Wisconsin, 2Department of Integrative Biology & Pharmacology, University of Texas Health Science Center at Houston

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Ionenkanäle in renale tubuläre Epithel ausgedrückt spielen eine bedeutende Rolle in der Pathologie der polyzystischen Nierenerkrankung. Hier beschreiben wir experimentelle Protokolle verwendet, um Patch-Clamp-Analyse und intrazellulären Calcium-Pegelmessungen in Zystenepithel frisch aus Nagetier Nieren getrennt durchzuführen.

Zusammenfassung

Zysten Initiierung und Ausdehnung während polyzystische Nierenerkrankung ist ein komplexer Prozess, gekennzeichnet durch Abnormalitäten in Rohrzellproliferation, luminale Flüssigkeitsansammlung und die extrazelluläre Matrixbildung. Aktivität von Ionenkanälen und der intrazellulären Calcium-Signalgebung sind wichtige physiologische Parameter die Funktionen der Tubulusepithel bestimmen. Wir entwickelten ein für Echtzeit-Beobachtung von Ionenkanälen Aktivität mit Patch-Clamp-Technik, und die Registrierung der intrazellulären Ca 2+ Pegel in epithelialen Mono frisch aus Nierenzysten isoliert Methode. PCK-Ratten, ein genetisches Modell der autosomal rezessive polyzystische Nierenerkrankung (ARPKD), wurden für die ex vivo Analyse der Ionenkanäle und Calciumfluss verwendet. Beschrieben wird hier eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Verfahren entwickelt, um zystische Monoschichten und nicht-dilatierten Tubuli von PCK oder normaler Sprague Dawley (SD) Ratten, zu isolieren und zu überwachen Einzelkanalaktivität und intrazelluläre Ca 2+ Dynamik.Dieses Verfahren erfordert keine enzymatische Verarbeitung und ermöglicht die Analyse in einer nativen Einstellung der frisch isolierten Epithelzellen-Monoschicht. Darüber hinaus ist diese Technik sehr empfindlich gegenüber intrazellulären Calciumänderungen und erzeugt Bilder mit hoher Auflösung für präzise Messungen. Schließlich kann isoliert Zystenepithel weiter zum Anfärben mit Antikörpern oder Farbstoffe, wurden primäre Kulturen und Reinigung für verschiedene biochemische Assays verwendet werden.

Einleitung

Ionenkanäle spielen eine wichtige Rolle bei vielen physiologischen Funktionen, einschließlich Zellwachstum und Differenzierung. Autosomal dominante und rezessive polyzystische Nierenerkrankung (ADPKD und ARPKD bezeichnet) sind genetische Störungen, die durch die Entwicklung von Nierenflüssigkeitsgefüllten Zysten des Rohr Epithelzelltumoren. ADPKD Mutationen von PKD1 oder PKD2 Gene Polyzystinen 1 und 2, Membranproteine ​​in der Regulation der Zellproliferation und -differenzierung beteiligt kodiert verursacht. PKD2 allein oder als Komplex mit PKD1 fungieren auch als Ca 2+ durchlässige Kationenkanals 1. Mutationen des PKHD1 kodierende Gen Fibrocystin (a Zilien-assoziierten Rezeptor-ähnlichen Proteins in der Tubulogenese und / oder Wartung Polarität Epithel beteiligt sind) sind die genetischen Anstoß ARPKD 2. Zystenwachstum ist ein komplexes Phänomen mit gestörter Proliferation 3,4, Angiogenese 5, Dedifferenzierung und Verlust der polaren begleitetkeit von röhrenförmigen Zellen 6-8.

Defekten Reabsorption und Sekretion in Augmented Zystenepithel tragen zu einer Flüssigkeitsansammlung in dem Lumen und Zystenexpansions 9,10. Impaired strömungsabhängige [Ca 2+] i-Signalisierung wurde auch cystogenesis während PKD 11-15 verbunden.

Hier beschreiben wir eine für Patch-Clamp-Messungen von Einzelkanal-Aktivität und der intrazellulären Ca 2+ -Spiegel bei zystischer epithelialen Monoschichten von PCK Ratten isoliert Methode. Dieses Verfahren wurde von uns erfolgreich angewendet, um der Aktivität des epithelialen Na + -Kanal (ENaC) 10 charakterisieren und [Ca 2+] i -abhängigen Prozesse durch Ca 2+ durchlässige TRPV4 und purinergen Signalkaskade 13 induziert.

In diesen Studien verwendeten wir PCK Ratten ein Modell ARPKD durch eine spontane Mutation in dem PKHD1 Gen verursacht. Die PCK-Stamm war originally von Sprague-Dawley (SD) Ratten 16 dadurch SD-Ratten werden als eine geeignete Kontrolle zum Vergleich mit dem PCK verwendete Stamm abgeleitet ist. Als Ergebnis können beide SD-Ratte nephron Segmenten und nicht-erweiterten Sammelkanäle vom selben PCK Ratten isoliert, wie zwei unterschiedliche Vergleichsgruppen für Versuche zur Zystenepithel dienen.

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Protokoll

Die nachfolgend beschriebenen experimentellen Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee am Medical College of Wisconsin und der University of Texas Health Science Center in Houston genehmigt und wurden in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Figur 1 zeigt wesentliche Schritte des Gewebes Isolierung und Verarbeitungsverfahren. Kurz gesagt, werden Nieren von PCK oder SD-Ratten für die manuelle Isolierung von Epithelzellen Monoschichten von Sammelkanäle entweder von gesunden nicht-gewählten Tubuli oder Zysten verwendet. Hier untersuchten wir die Nieren 4-16 Wochen alt PCK Ratten 10,13.

1. Isolierung von Nierenzysten und Anschließen Röhrchen (CNT) / Sammelrohr (CD) Segmente

  1. Anesthetize Versuchstier mit Isofluran (5% Induktion, 1,5 bis 2,5% Wartung) / Klasse O 2 medizinische oder einer anderen zugelassenen Methode. Die Tiere müssen ständig überwacht, um eine angemessene le zu gewährleistenvel der Anästhesie. Stabile Atemfrequenz und toe Prise Reaktion verwendet werden, um angemessene Betäubung bestätigen.
  2. Zuführen Laparotomie und bündig die Nieren mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) durch die abdominale Aorta 17.
    1. Bereiten Sie einen Polyethylenschlauch Katheter (PE50) und verbinden Sie es mit einer Spritzenpumpe mit PBS gefüllt. Schneiden Sie die Haut und Bauchwand entlang der Linea alba, dann machen Sie einen transversalen Bauchschnitt über den Bauch von Seite zu Seite und verschieben Sie die Bauchorgane mit Wattestäbchen, um Zugang zu der absteigenden Aorta mit Verzweigungen mesenterialen und Zöliakie Arterien zu erhalten. Befeuchten Sie die inneren Organe mit warmer Kochsalzlösung während der weiteren Verfahren auf ihre Trockenheit zu verhindern.
    2. Legen Sie eine Ligatur (# 1) um die mesenterialen und Zöliakie Arterien und andere Blattschraube (# 2) um die Aorta unter der Membran (nicht binden). Vorsichtig trennen ein. abdominalis von stumpf sezieren Bindegewebe um ihn herum mit dünnen Pinzette und legen Sie zwei Ligaturen ~ 3mm unterhalb der linken Nierenarterie (# 3) und oberhalb der Darmbeinarterien Bifurkation (# 4).
    3. Binden Sie Ligatur # 4 und fügen Sie eine Gefäßklemme um die Aorta zwischen dem linken Nierenarterie und Unterbindung # 3. Einen Einschnitt zwischen der Klemme und Unterbindung # 4, um die Aorta katheterisieren, verwenden Sie Unterbindung # 3 in die fest zu fixieren, den Katheter.
    4. Lösen Sie die Klemme und stellen Sie sicher, dass das Blut Puls ist in dem Katheter sichtbar, um eine ordnungsgemäße Installation sicherzustellen. Starten Perfusion mit einer Rate von 6 ml / min, binden Ligaturen # 1 und # 2, und schneiden Sie die linke Nierenvene. Weiter spülen 1-2 Minuten, bis die Organe vollständig blanchiert.
    5. Schneiden Sie renalen Blutgefäße, der Harnröhre und der umgebenden Binde- und Fettgewebe mit einer Schere, um die Nieren zu sammeln. Dann machen Sie eine kurze Riss in Nierenkapsel und ziehen die Nieren, um sie decapsulate. Legen Sie die Nieren in eiskaltem PBS. Sterbehilfe wird durch eine Thorakotomie bestätigt.
  3. Bereiten Sie 5 x 5 mm Deckglas-Chips mit Poly-L-Lysin beschichtet. Schneiden Sie ein Deckgläsernss mit einem Diamantstift und Ort etwa 20 & mgr; l 0,01% steril filtriert Poly-L-Lysin-Lösung auf jedes Glas-Chip. Bereiten Kochsalzlösung und zwei Paare von Uhrmacher Zangen für die Präparation.
  4. Schneiden die Nieren mit einer Rasierklinge entlang der Frontalebene in Scheiben von ~ 1-2 mm Dicke. Legen Sie eine der Scheiben unter einem Stereomikroskop. Isolierung von Gewebe sind in eiskalter Kochsalzlösung durchgeführt werden.
  5. Finde Zysten unter einem Stereomikroskop als Rundform Hohlräume (2A); ihre Wände enthalten oft prominente Netzwerk von vermehrten Blutgefäße. Verwenden von spitzen Pinzette sezieren die interne Epithelschicht einer Zyste so dünn wie möglich, um eine Monoschicht-Bereich zu erhalten. Verbinden Sie es mit einem Glas-Chip mit Poly-L-Lysin bedeckt. Sticky Poly-L-Lysin-Oberfläche ermöglicht dem Forscher fest positionieren Sie den internen Zyste Schicht auf Glas. Setzen Sie die Zyste mit der apikalen Seite nach oben, um den Zugang für die Pipetten (2B) bereitzustellen.
  6. Verwenden PCK oder SD-Ratten kidney zentralen Scheiben Papille zur Isolierung von nicht-dilatierten CNT / CCDsegments 18-21 enthalten.
    HINWEIS: Papillary Geweben sind haltbarer als Kortex und durch Halten papillären Rohrbänder mit einer Pinzette und Reißen entlang radialen Achse der Scheibe zu dünnen Bereichen abgespalten werden. Einzelne Tubuli sind sichtbar und können herausgezogen, um auf Deckglas-Chips platziert werden kann.
  7. Identifizieren Sie die CNT / CCD-Segmente durch Gabelungen, höhere Transparenz als proximalen Tubuli und große deutlich sichtbare Zellen (2C). Legen Sie die Abdeckung Glas-Chip mit angeschlossenem Tubuli unter einem Mikroskop mit Mikromanipulatoren für den Antrieb von Mikropipetten ausgestattet. Mit scharfen Mikropipetten Split offenen Tubuli und befestigen ihre Ränder auf das Glas der apikalen Oberfläche zugänglich zu machen (2D).

2. Einzelkanal-Patch-Clamp-Elektrophysiologie

  1. Füllen Sie den Patch-Clamp-Kammer mit Bad-Lösung und übertragen Sie das Deckglas-Chipmit isolierten Geweben in die Kammer. Stellen Sie sicher, dass die Patch-Clamp-Mikropipetten haben Widerstand von 7-10 MOhm für die zuverlässige On-Zelle (Cell-Attached) Messungen.
  2. Für die Cell-Attached-Messungen, stellen Sie den Verstärkungsfaktor-Verhältnis auf 20-fach und Tiefpass die Ströme bei 300 Hz durch einen achtpoligen Bessel-Filter. ENaC-Kanäle für die Überwachung, mit einem Badlösung in mM: 150 NaCl, 1 CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 HEPES (pH 7,4); Pipette 140 LiCl, MgCl 2 2 und 10 HEPES (pH 7,4).
  3. Durchführung einer konventionellen Patch-Clamp-Experiment in einem Cell-Attached-Modus 10. Eine Zelle in der Monoschicht epithelialer und nähern sich der Pipette in der apikalen Membran. Bilden einen hochohmigen Abdichtung zwischen einer Pipette und Zellmembran durch leichten Sog. Sobald eine high resistant Gigaohm Dichtung gebildet wird, sollte eine lückenlose Protokoll bei einem Haltepotential für die Überwachung der Aktivität des interessierenden Kanal gestartet werden.
  4. Shop spaltfreie Einzelkanal aktuellen Daten von gigaOhm-Dichtungen für die spätere Analyse. Analysieren Sie die Kanal-Ereignisse mit Hilfe eines Software-Paket in der Regel mit Patch-Clamp-Setups 18 zugeführt. Berechnung der Kanalaktivität als NPO, wo N die Anzahl der aktiven Kanäle in der Patch und P o ist durchschnittlich Öffnungswahrscheinlichkeit der Kanäle.
    HINWEIS: Verwenden Sie isolierte Zysten oder Tubuli in Patch-Clamp-Experimenten für nicht mehr als 30 Minuten.

3. Ratiometrisch Epifluoreszenz Messungen der intrazellulären Calciumkonzentration in den Epithelzellen

  1. Verwenden 5 mM Fura-2AM in DMSO gelöst. Aliquot Stammlösung in einzelne 500 ul konische Röhrchen (etwa 10 & mgr; l). Vor Licht und lagern in der Tiefkühltruhe bei -20 ° C für bis zu sechs Monate.
  2. Inkubieren isolierten Zysten und Split-offenen Tubuli 30-40 min in PSS (in mM: 145 NaCl, KCl 4,5, 2 MgCl 2, 2 CaCl 2 und 10 HEPES bei pH 7,35), das 5 uM Fura-2 AM Farbstoff und 0,05% Pluronsäure um die Dispersion der Acetoxymethylester. Dafür Ort Gewebe in der 3,5 cm Schale mit Ladecocktail, vor Licht schützen und Inkubation auf einem langsamen Schüttler bei Raumtemperatur.
  3. Ändern Fura-2 AM haltigen Medien, um nach der Inkubation reinigen PSS und legen Sie das Gewebe unter dem Mikroskop zu Epifluoreszenz-Bildgebung weiter durchzuführen.
  4. Schalten Sie CCD-Kamera und stabile Lichtquelle (Monochromator-System) mit Filterscheibe ausgestattet (jede Filterposition kann mit einer eigenen Dämpfungspegel, jedes Mal, wenn der Filter aufgerufen wird ausgewählt in Verbindung gebracht werden).
  5. Finden Sie das Gewebe im Hellfeld. Wechseln Sie zur Detektion des Fluoreszenzsignals und stellen Sie die Intensität der Lichtquelle mit Neutralfilter und Lampenleistung, um die Sättigung des Signals zu vermeiden.
  6. Überwachen Fura-2 AM-Fluoreszenz in der Gewebeprobe mit ratiometrische Anregung bei 340/380 nm mit einer Frequenz von 0.125 Hz oder höher. Verwenden Sie eine 40 × / NA 1.3 oder ähnliche Objektivlinse zum richtigen Resolution Bild.
  7. Für die Bildverarbeitung und Berechnungen importieren Sie die Bildfolge. Stellen Sie sicher, um die Kanäle aufgeteilt und mit einem Hyperstack-Graustufen-Modus. Wählen Sie mehrere Bereiche von Interesse (Einzelzystenzellen oder ausgewählte Bereiche der zystischen Gewebe) und berechnen Sie Intensitätswerte für jeden Kanal (340 und 380 nm) in die bevorzugten Datenanalyse-Software; subtrahieren Hintergrund Intensitätswerte von jedem Datenpunkt.
  8. Für jeden Zeitpunkt wird das Verhältnis der Intensitäten der Fura-2 AM 340-380 Kanälen. Plot Scatter / Linienpunkt-Zeitänderungen von Ca 2+ Transienten für jede Region und berechnen Mittelwert / SE-Werte.

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Ergebnisse

Potential ENaC Beteiligung cystogenesis durch mehrere Studien, die gestört epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) beobachtet Signalisierung in PKD Progression 22-25 und abnorme Natriumreabsorption in ARPKD Mausmodellen und Gewebekulturen 26-28 nachgewiesen. B. Veizis et al. Zeigten, dass Amilorid-sensitive Na + -Absorption in CD-Zellen aus dem nicht-ortho BPK Mausmodell ARPKD 29 verringert. Wir haben kürzlich gezeigt, dass beeinträchtigte Natrium und Wasser Rückresorption ...

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Diskussion

Wir hier beschriebenen Anwendungen von herkömmlichen Patch-Clamp-Technik und Epifluoreszenz Calcium Imaging, um zystische Epithelzellen-Monoschichten aus einem Maus-Modell der genetischen ARPKD abgeleitet. Das Protokoll besteht aus drei Schritten, von denen die meisten Aufmerksamkeit ist auf die Isolierung der Zysten (Schritt 1.5 der Protokolle Abschnitt) und an die elektrophysiologische Studien bezahlt werden. Diese Schlüssel Verfahren erfordern umfangreiche Schulungen und Geduld, und der Leser sollte nicht enttäuscht ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Die Autoren bedanken sich bei Glen Slocum (Medical College of Wisconsin) und Colleen A. Lavin (Nikon Instruments Inc.) für hervorragende technische Unterstützung bei der Mikroskopieexperimente bedanken. Diese Studie wurde von der National Institutes of Health gewährt R01 HL108880 (AS), R01 DK095029 (nach OPO) und K99 HL116603 (TSP), National Kidney Foundation IG1724 (TSP), American Heart Association 13GRNT16220002 (nach OPO) und der Ben J. Lipps-Forschungsstipendium von der American Society of Nephrology (auf DVI).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Fura-2 AMLife TechnologiesF-14185
Fluo-8AAT Bioquest21091
Poly-L-LysinSigma-AldrichP4707
PluronsäureSigma-AldrichF-68 Lösung
ShakerBoekel Scientific260350
LichtquelleSutter Instrument CoLambda XLmit integriertem Shutter-/Filterradtreiber
NeutraldichtefilterNikonND4, ND8
ObjektivNikonSFluo 40/1,3 DIC WD 0,22    Öl
KameraAndor TechnologiesZyla sCMOS
Nikon  Mikroskop (invert)NikonNikon Eclipse TE2000-S
Thermo Scientific6661B52
Diamond pencilFisher Scientific22268912
BilderfassungssoftwareNikonNikon NIS-Elements 
BildanalysesoftwareImageJhttp://imagej.nih.gov/ND Utility Plugin ermöglicht den Import von Bildern im nativen Nikon Instruments .nd2-Format
-/PerfusionskammerWarner InstrumentsRC-26
Patch Clamp VerstärkerMolecular DevicesMultiClamp 700B
DatenerfassungssystemMolekulare BauelementeDigidata 1440AAxon Digidata® System
TiefpassfilterWarnerInstruments LPF-88-polige Bessel-Kapillaren
aus BorosilikatglasWorld Precision Instruments1B150F-4
MikropipettenabzieherSutter Instrument CoP-97Flammender/Brauner Mikropipettenabzieher
MicroforgeNarishigeMF-830Japan
Motorisierter MikromanipulatorSutter Instrument CoMP-225
Inverses MikroskopNikonEclipse Ti
Mikrovibrations-IsolationstischTMCausgestattet mit Faradayscher Käfig
Mehrkanal-VentilperfusionssystemAutoMake ScientificValve Bank II
Aufnahme-/PerfusionskammerWarner InstrumentsRC-26
SoftwareMolecular DevicespClamp 10 . 2
Temperierter Operationstisch MCW-Kernfür Nagetiere
Binokulares StereomikroskopNikonSMZ745
Spritzenpumpenbasiertes PerfusionssystemHarvard Apparatus
PolyethylenschlauchSigma-AldrichPE50
Isofluoran-Anästhesiehttp://www.vetequip.com/911103
Andere BasisreagenzienSigma-Aldrich
Cover Glass Aufnahme

Referenzen

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