Maßgeschneiderte Mikrodialysesonde Entwurf

Zusammenfassung

Mikrodialyse ist eine häufig verwendete Technik in neurowissenschaftlichen Forschung. Daher kommerziellen Sonden sind in der großen demand.In diese Arbeit eine Sondenanordnung ist detailliert, um eine zuverlässige, konzentrisch, maßgeschneiderte Mikrodialysesonde bauen für weniger als $ 10 erläutert.

Zusammenfassung

Mikrodialyse ist eine häufig verwendete Technik in neurowissenschaftlichen Forschung. Daher kommerziellen Sonden sind in der großen Nachfrage auf physiologische, pharmakologische und pathologische Veränderungen im Liquor zu überwachen. Leider sind die kommerziellen Sonden teuer für Forschungsgruppen in öffentlichen Einrichtungen. In dieser Arbeit wird eine Sondenanordnung im Detail erläutert, um eine zuverlässige, konzentrisch, maßgeschneiderte Mikrodialysesonde für weniger als $ 10 zu bauen. Die Mikrodialysesonde besteht aus einer Polysulfon-Membran mit einer molekularen Trenngrenze von 30 kDa. Sonde in vitro Rückgewinnung von Substanzen mit unterschiedlichen Molekulargewicht (im Bereich von 100-1,600 Da) und verschiedene physikalisch-chemische Eigenschaften werden verglichen. Die Sonde liefert ein in vitro-Rückgewinnung von etwa 20% für die kleinen Verbindungen, Glucose, Lactat, Acetylcholin und ATP. In vitro Einziehungen für Neuropeptide mit einem Molekulargewicht zwischen 1,000-1,600 Da betragen 2-6%. Während somit die höheren Molekular wacht der Neuropeptide abgesenkt in vitro Recovery-Werte, Dialyse von Verbindungen im unteren Bereich (bis zu 500 Da) der Molekulargewichte hat keinen großen Einfluss auf die In-vitro-Rückgewinnungsrate. Das vorliegende Verfahren ermöglicht Nutzung einer Dialysemembran mit anderen cut-off-Wert und Membranmaterial. Daher hat diese maßgeschneiderte Sondenanordnung den Vorteil, dass genügend Flexibilität, um Substanzen in einem breiten Molekulargewichtsbereich dialysiert. Hier stellen wir eine Mikrodialysesonde mit einer Austauschlänge von 2 mm, die anwendbar für die Mikrodialyse in Mäuse- und Rattenhirnregionen ist. Jedoch kann Abmessungen der Sonde leicht größeren Wechsellängen angepasst, um in größeren Tieren verwendet werden können.

Einleitung

Mikrodialyse ist eine häufig verwendete Technik in neurowissenschaftlichen Forschung. Während der letzten 50 Jahre hat sich die minimal-invasive Mikrodialyse-Technik kontinuierlich verbessert, um eine gut etablierte Methode, um lokale Konzentrationen von kleinen molekularen Verbindungen in den extrazellulären Raum überwacht werden. Fast jeder interstitiellen Gewebsflüssigkeit kann in sich frei bewegenden Tieren untersucht werden.

Gaddum führte die Push-Pull-Technik, die in den 1960er Jahren. Er verändert einen Ansatz von Feldberg et al., In dem Tubocurarin wurde durch eine Kanüle endet in den lateralen Ventrikel und das Sammeln des Abwassers auch über eine Kanüle ¹ perfundiert. GADDUM entwickelte das Push-Pull-Verfahren, bei dem eine Kanüle aus zwei konzentrischen Nadeln aus Stahl wurde in verschiedenen Bereichen des Gehirns mit einer Lösung perfundiert und implantiert, während gleichzeitig das Entfernen der Neurotransmitter aus den Neuronen um die Spitze ² freigegeben. Leider Gewebe damage von der Kanüle um die Spitze verursacht beschränkt die Anwendung dieses Verfahrens. Als Weiterentwicklung dieses Verfahrens, Bito und Mitarbeitern wurde ein Dialysebeutel Verfahren, wobei die gesammelte Lösung wurde aus dem umgebenden Gewebe durch eine Dialysemembran getrennt sind. Sie implantiert eine Dialysesack in das subkutane Gewebe des Hundes Hals. Der Inhalt der Dialysebeutel proteinfrei und könnte viele Wochen später für Ionen und Aminosäuren ³ analysiert werden. Die nächste Entwicklung war die dialytrode, eine primitive Mikrodialysesonde, die ursprünglich durch Delgado 1972 ⁴ beschrieben. Schließlich Ungerstedt und Kollegen verbessert das Design der Mikrodialysesonde so, dass es kleiner und weniger Gewebe ⁵ verdrängt.

Eine konzentrische Mikrodialysesonde verhält sich ähnlich wie eine Blut Kapillare. Das System wird ständig durch eine Lösung mit der ionischen Zusammensetzung des umgebenden Gewebeflüssigkeit, während ohne die interessierenden Analyten perfundiert. The Dialysemembran an die externe Lösung oder Gewebe ausgesetzt semipermeabel. Es ermöglicht die passive Diffusion von Substanzen in die Sonde entlang ihrer Konzentrationsgradienten ^6. Die Durchlässigkeit ist abhängig von vielen Variablen, wie Molekulargewicht, Form, Ladung und pH-Wert der Verbindung ist. Es ist auch begrenzt durch die Eigenschaften des Membranmaterials, der Porengröße der Membran und Fließgeschwindigkeit ^7.

Die 1 und 2 zeigen eine konzentrische Mikrodialysesonde. Die Perfusionsflüssigkeit tritt über eine Einlassleitung in die Metallhülse, die das Quarzglas umgibt. Im Inneren der Metallhülse, Bäche es entlang der Quarzglas und überlässt es an seiner Spitze. In dem Raum zwischen der Dialysemembran und dem Polytetrafluorethylen (PTFE) -tubing (wie Teflon) fließt der Perfusionsflüssigkeit dann nach oben. Hier Diffusion von Substanzen aus dem Gewebe stattfindet, der die Membran umgibt. Das Dialysat verläßt die Sonde durch die PTFE-Schläuche, die verbunden ist, um Rohraustritt und gesammelt werden können.

Die Mikrodialysetechnik hat mehrere Vorteile im Vergleich zu anderen in vivo-Techniken. Die Sonde bildet eine physikalische Barriere mit der Folge, dass das Dialysat enthält keine Enzyme oder Zellen. Daher gibt es keine Notwendigkeit zur Reinigung des Eluats vor der Analyse und keine enzymatischen Abbau von Analyten erfolgt. Oxidative Abbau kann während des Durchgangs von Analyten in der Rohrleitung auftreten, aber das kann oft durch Zugabe eines Antioxidationsmittel (zB Ascorbinsäure) zum Perfusat verhindert werden. Alternativ oxidative Schädigung Neuropeptide, beispielsweise, wurde effizient durch Ersatz der Auslassschlauch mit einer Spitze zu dem Dialysat ⁸ sammeln drückt. Das Dialysat kann direkt mit nahezu jeder Art von Analyseverfahren untersucht und mehrere Analyten gleichzeitig gesammelt werden. Dieses System kann bei wachen Tieren verwendet werden, und fast alle Gehirnregionen könnenuntersucht. Darüber hinaus ist die Infusion von Medikamenten durch die Sonde möglich ist (Retrodialyse). Jedoch gibt es auch Grenzen der Mikrodialysetechnik. Die etwas geringer Zeitauflösung bietet keine Echtzeit-Informationen über Neurotransmitter Änderungen. Denn es ist eine invasive Technik, verursacht Sondenimplantation chirurgischen Trauma und Anästhesie, die die Neurotransmitter-Konzentration beeinflussen können, wird bei diesem Schritt ^7,9,10 erforderlich.

Die Konzentration der Verbindung im Dialysat enthält nur eine kleine Menge der tatsächlichen Wirkstoffkonzentration in der extrazellulären Flüssigkeit. Für die Berechnung der unbekannten Konzentration der Verbindung in der extrazellulären Flüssigkeit weist relativen in vitro Wiederherstellung zu berechnen. Bestimmung der individuellen relativen in vitro Rückforderungen für jede Probe und jede Verbindung ist vor Beginn der in vivo-Experiment notwendig. Zu diesem Zweck ist die Sonde in einer Lösung, die das eingetauchteAnalyten von Interesse, während der Perfusionsflüssigkeit ist die gleiche Lösung ohne den interessierenden Analyten. Nach der Bestimmung der Verbindungskonzentrationen im Dialysat, müssen diese Daten, um ihre Konzentration in der umgebenden Flüssigkeit bezeichnet werden. In vitro-Rückgewinnungsbestimmungen aus mehreren Stoffen kann gleichzeitig ⁹ implementiert werden.

Viele neurowissenschaftlichen Forschergruppen nutzen die Mikrodialyse-Technik, um Neurotransmitter und Metabolite in den extrazellulären Raum von verschiedenen Hirnarealen zu untersuchen. So sind Handels Sonden in der großen Nachfrage in der neurowissenschaftlichen Forschung Umwelt. Ein großer Vorteil der handelsüblichen Sonden ist die hohe Funktionssicherheit. Der Versuchsaufbau für kommerzielle Sonden ist gut etabliert und für viele bekannte Neurotransmitter und Metaboliten validiert. Jedoch, während die im Handel erhältlichen Mikrodialyse Ausrüstung ist teuer und hat eine geringere Flexibilität in der Anwendung ^11, thist Arbeit eine Mikrodialysesonde Montage ist im Detail vorgestellt, die für jede Anwendung angepasst werden kann, und kann für weniger als $ 10 hergestellt werden. Dieses maßgeschneiderte Sonde ist eine konzentrische Mikrodialysesonde für Untersuchungen in verschiedenen Gehirnbereichen ⁸ getestet.

In-vitro-Sonde Ausbeuten von Substanzen mit unterschiedlichen Molekulargewicht (im Bereich von 100-1,600 Da) und mit unterschiedlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften, verglichen werden. In vitro Bestimmung der Rückgewinnung von Glucose, Lactat und Acetylcholin mit einem Molekulargewicht von weniger als 200 Da, ATP mit einem Molekulargewicht von etwa 500 Da und die Angiotensin-II-Neuropeptide, die Substanz P und Somatostatin mit einem Molekulargewicht von mehr als 1.000 Da ausgeführt wird.

Protokoll

1. Vorbereiten PTFE-Schläuche

1. Kürzen Sie PTFE-Schlauch in 2,5 cm Stück. Verwenden Sie einen Maßstab Papier zu physikalischen Abmessungen zu schätzen. (Siehe Abbildung 3a)
2. Schnitt ein Ende in einem Winkel zu erleichtern Verbinden Auslassschlauch. (Siehe Abbildung 3a)
3. Aufrauen PTFE-Schlauch durch die Verwendung von Schleifpapier Anhaften des Epoxid-Kleber zu ermöglichen.

2. Vorbereitung Fused Silica

1. Verkürzen Quarzglas in 2,25 cm Stück. (Siehe Abbildung 3a)

3. Einsetzen des Fused Silica in die PTFE-Schläuche

1. Legen Sie eine 30 G Kanüle in den Hohlraum PTFE-Faser, um es in einem Abstand von 1 cm von dem flachen Ende zu durchbohren. Biegen Sie die PTFE-Schlauch, um den Prozess zu vereinfachen. (Siehe Abbildung 3b)
2. Legen Sie die Quarzglas in die PTFE-Schlauch mit der Kanüle als Anleitung. (Siehe Abbildung 3c)
3. Entfernen Sie vorsichtig die Kanüle und sichern Sie das Quarzglas. (SieheFigur 3d)
4. Das Quarzglas soll 5 mm an dem flachen Ende zu projizieren. (Siehe Abbildung 3e)
5. Kleben Sie das Quarzglas anstelle an der Einstichstelle durch Sekundenkleber und lassen Sie es über Nacht aushärten. (Siehe Abbildung 3e)

4. Vorbereitung Epoxy-Kleber (Zweikomponentenkleber)

1. In 30 Teile Härter gelb bis 70 Teile schwarz Epoxid-Kleber mit Hilfe einer feinen Nadel und mischen Sie es sanft. Es ist direkt einsatzbereit.

5. Die Anwendung der Membrane (alle weiteren Schritte müssen unter den Mikroskop durchzuführen und ein Maßstab Papier wird verwendet, um Abmessungen Schätzung)

1. Ziehen Sie die Polysulfonmembran vorsichtig über die Quarzglas, ziehen Sie dann die Membran in die PTFE-Schläuche und stellen Sie die Membran auf 5,5 mm mit einem scharfen Skalpell. (Siehe Abbildung 3f)
2. Legen Sie einen Markierungspunkt auf der Membran mit einem feinen Stift, um den Austausch Länge von 2 mm zu definierenvom Ende der Membran.
3. Eine kleine Menge des Epoxy wird die Spitze der Membran mit Hilfe einer feinen Nadel zu bedecken. (Siehe Abbildung 3 g)
4. Schließen Sie die Verbindung zwischen Dialysemembran und PTFE-Fasern durch Hilfe des gleichen feinen Nadel in Schritt 5.3 verwendet wird) mit dem Epoxid-Kleber. (Siehe Abbildung 3 g)
5. Fügen Sie genug Epoxid-Kleber auf der Membran bis zum Markierungspunkt, einen Austausch Länge von 2 mm zu gewährleisten. Lassen Sie es über Nacht aushärten. (Siehe Figur 3g) vor der Bestimmung der Austauschlänge ist die Membran 5,5 mm. Nach dem Aufbringen der Epoxy-Klebstoff auf der Membran, ist nur 2 mm von der Membran für die Diffusion zur Verfügung.

6. Die Anwendung der Metallhülse

1. Schneiden Sie eine 25 G Nadel in 1 cm Stücke Metallhülse mit Hilfe einer Biegezange.
2. Ziehen 1 cm Metallhülse (25 G) auf das verbleibende Teil der Quarzglas. Die Metallhülse ermöglicht später den Anschluss des Zulaufschlauch mit der MICRODIALyse-Sonde. (Siehe Abbildung 3 h)
3. Dichtungsverbindung zwischen Metallhülse und PTFE-Schlauch mit dem restlichen Komponenten-Kleber. Lassen Sie es für mindestens 24 Stunden aushärten lassen. (Siehe Abbildung 3i)
4. Aufbringen Heißleim auf der Gabelung der Sonde für eine zusätzliche Fixierung und Stabilisierung.
   HINWEIS: Die Einlass innere Volumen der Sonde beträgt 0,045 & mgr; l und der Auslass Innenvolumen beträgt 2,5 & mgr; l. Daher wird bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 1 ml / min, dauert es etwa 2,5 Minuten nach dem Verbinden des Einlassrohrs, um die Sammlung des Dialysats zu starten. Mit der vorliegenden Protokoll liefert die Sonde Montageverfahren Mikrodialysesonden, die 95% zuverlässig sind.

7. Durchführung von In-vitro-Recovery-Experimente

1. Tauchen die Sonde mit einem Cut-off von 30 kDa und einem Austauschlänge von 2 mm in einer Stammlösung von aCSF enthaltend 1 mM Glucose und 1 mM Lactat und, in einem getrennten Experiment bestand, in eine CSF enthaltend 100nM ATP und 100 nM Acetylcholin.
2. Perfusion der Sonden mit aCSF. Durchflussrate einstellen, um 1 & mgr; l / min und Durchführung von Experimenten bei Raumtemperatur (22 ° C). Lassen Sie die Sonden an für 1 Stunde in der Stammlösung ins Gleichgewicht, und sammeln Sie die Proben alle 30 Minuten danach und bei -80 ° C bis zur Messung.
3. Für die Berechnung der in vitro Rückforderungen, vergleichen Sie die Konzentrationen an Analyten in der Dialysate mit den bekannten Analytkonzentrationen in der Stammlösung. Express-Ergebnisse als Prozentsätze der Stoffkonzentration in Dialysat vs. Stammlösung.

Ergebnisse

Die konzentrische maßgeschneiderte Mikrodialysesonde besteht aus einer Polysulfon-Membran mit einer molekularen Trenngrenze von 30 kDa. Die Sondenanordnung wird in 3 dargestellt.

Es zeigte eine in vitro Wiederherstellung für den geringen Energie Metaboliten Glucose (180,16 Da) und Lactat (112,06 Da) von 19,10 ± 1,2% bzw. 21,2 ± 1,6%. Für die positiv geladenen Acetylcholin mit einem Molekulargewicht von 181.66 Da, zeigte dieses eine in vitro Rückbildungswert...

Diskussion

Figur 3 zeigt eine beispielhafte Sondenanordnung. Correct Innen- und Außendurchmesser Abmessungen haben eng für Schläuche beachten (OD 1,6 mm; ID 350 um), Quarzglas (OD 105 & mgr; m, ID 40 & mgr; m) und Dialysemembran (OD 245 & mgr; m; ID 210 & mgr; m). Es ist auch wichtig, um einen Raum zwischen der Membran und Quarzglas von (105 & mgr; m), und zwischen der Membran und die Schläuche (105 um) als auch zu halten. Unterscheiden sich die Werte, kann der Druck in der Sonde steigt und füh...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Epoxidharzkleber	SunChrom GmbH, Fiedrichsdorf, Deutschland
Quarzglas ID 40 & Mikro; m OD 105 &Mikro; m	Ziemer-Chromatographie, Mannheim, Deutschland Art	. Nr.: 6.040105
Polysulfonmembran (Hämodialysefilter FX Cor Diax 600)	Fresenius Medical Care AG & Co. KGaA, Bad Homburg, Deutschland	REF: F00001593
Cyanacrylat-Kleber (Pattex& reg; Sekundenkleber Kunststoff)	Henkel AG&Co. KGaA, Dü sseldorf, Deutschland
TEFLON-Schlauch 1,6 x 0,35 mm	SunChrom® GmbH, Friedberg, Deutschland	Art. Nr.: 969-195.219
Skalpell (Feder® Chirurgische Klinge Nr. 10)	pfm medical ag, Köln, Deutschland	Art.-Nr. Nr.: 07310
Mikroskop	MEIJI Techno	EMZ-8TR
Kanüle 30 G x 11" (0,3 x 25 mm) Sterican® Z	B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland	REF: 9324500
25 G x 11/2" (0,5 x 40 mm) Kanüle 100 Sterican®	B.Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland	REF: 9186166
Feiner Schreiber (Stabilo Punkt 88 fein 0,4)	Schwan-STABILO Schwanhä uß er GmbH & Co. KG	Art.-Nr. Nr.: 88/36
Heißkleber  (Klebestifte ULTRA Power x 11 mm)	Steinel® GmbH, Herzebrock-Clarholz, Deutschland	Art.-Nr. Nr.: 4007841046910
Schleifpapier P60 230 x 280	Robert Bosch GmbH, Gerlingen-Schillerhö he, Deutschland	Katalognummer: 2608605397