Oberfläche Verbreitung und Immunfärbung von Hefechromosomen

Zusammenfassung

Eine Methode zur Oberflächenspreizung von Chromosomen aus knospenden Hefen wird vorgestellt. Diese Methode leitet sich von einer Methode ab, die zuvor von Loidl und Klein beschrieben wurde. Darüber hinaus demonstrieren wir ein Verfahren zur Immunfärbung von Spreizchromosomen.

Zusammenfassung

Die geringe Größe der Zellkerne der knospenden Hefe Saccharomyces cerevisiae schränkt den Nutzen der Lichtmikroskopie für die Analyse der subnuklearen Verteilung von Chromatin-gebundenen Proteinen ein. Die Oberflächenspreizung der Hefekerne führt zu einer Expansion des Chromatins ohne Verlust gebundener Proteine. Eine Methode zum Oberflächenspreizen gleicht die Fixierung von DNA-gebundenen Proteinen mit einer Waschmittelbehandlung aus. Die demonstrierte Methode ist gegenüber der von Josef Loidl und Franz Klein beschriebenen Methode leicht modifiziert^1,2. Die Methode wurde verwendet, um die Lokalisation vieler chromatingebundener Proteine in verschiedenen Stadien des mitotischen Zellzyklus zu charakterisieren, ist aber besonders nützlich für die Untersuchung meiotischer Chromosomenstrukturen wie meiotischer Rekombininosomen und des synaptonemalen Komplexes. Wir beschreiben auch eine Modifikation, die keine Verwendung von Lipsol erfordert, einem proprietären Waschmittel, das im ursprünglichen Verfahren gefordert wurde, aber nicht mehr im Handel erhältlich ist. Ein Immunfärbeprotokoll, das mit der Chromosomenspreizmethode kompatibel ist, wird ebenfalls beschrieben.

Einleitung

Die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae bietet viele Vorteile für die Untersuchung der molekularen Mechanismen der biologischen Prozesse, einschließlich der Untersuchung von Proteinen, die Chromosom-Funktion steuern. Zwar gibt es die bekannten Vorteile von Bäckerhefe für genetische, molekularen und biochemischen Studien wird zytologische Untersuchungen der Verteilung der Proteine ​​in den Zellkern durch seine geringe Größe kompliziert. Die typische Hefenukleus hat einen Durchmesser von weniger als einem Mikrometer, die nur etwa das 5fache der Auflösungsgrenze des sichtbaren Lichts ist. Somit wird die Menge von Informationen über die Verteilung von Kernprotei....

Protokoll

HINWEIS: Einige Schritte des Protokolls erfordern unter Arbeiten in einem sauberen Abzug. Außerdem erfordert das Verfahren eine Hefe Tetrade Präpariermikroskop mit einem 10X großen Arbeitsabstand Ziel ausgestattet Spheroplasting überwachen. Das Mikroskop sollte in der Haube vor der Zeit eingestellt werden. Entfernen Sie den Mikromanipulator Arm und Plattenhalter aus dem Anwendungsbereich und setzen diese Elemente in einem sicheren Ort weg vom Arbeitsbereich.

1. Herstellung von Sphäroplasten

1. Wachsen Hefe unter gewünschten Bedingungen. Gebrauch über 2 x 10 ⁸ Zellen für jede Probe, beispielsweise 4 ml einer Kultur bei 1....

Ergebnisse

Das Aussehen der Ausbreitung Kerne kritisch, hängt von der Balance zwischen Chromosom Fixierung und de-Verdichtung. Selbst wenn die Reagenzien korrekt ausgeglichen werden, kann die Variation in dem Grad der Chromosom de Verdichten in den verschiedenen Regionen der gleichen Folie und / oder zwischen verschiedenen Folien auftreten. Somit sollte die Qualität der Aufstriche in einer bestimmten Region eines Schiebers beurteilt werden, bevor Bilder interpretiert werden.

Die Wirkungen der "Übe.......

Diskussion

Das Auftreten von Spreizkeimen hängt entscheidend von der Balance zwischen Fixierung und Lyse-/Detergenzienbehandlung ab. Wie oben diskutiert, erfordert die Erhaltung unterschiedlicher zellulärer Strukturen die Verwendung unterschiedlicher PFA-Konzentrationen. Für die meisten Proteine sind 3 % PFA optimal. Für die Konservierung der Spindeln ist jedoch die Verwendung von 4 % PFA erforderlich. Selbst mit einem einzigen Satz von Reagenzien kann auch der Zeitpunkt der Lyse im Verhältnis zur Fixierung die Qualität der ausge.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Zymolyase	US Biologisch	Z1004	Bereiten Sie eine Lösung von 20 mg/ml in 50 mM Tris pH 7,5 zu, ergänzt mit 2 % Glukose. Jedes Experiment frisch zubereiten und bei 4° lagern; C bis zur Gebrauchsbereitstellung.
Lipsol	L.I.P. Ltd	nicht mehr im Handel erhältlich	1%ige (v/v) Lösung in Wasser herstellen. Auf Eis lagern.
NP-40	USB	19628	1%ige (v/v) Lösung in Wasser herstellen. Auf Eis lagern.
Tween 20	Sigma	P2287
Objektträger	Corning	2948-75x25
Standard	Deckglas Fisher	12-544-E oder 12-540-B
Hochauflösende Deckgläser	Fisher	12-542-B
Photo-Flo 200 Lösung	Kodak	P-7417	0,2%ige (v/v) Lösung in Wasser herstellen.
TBS			137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 24,7 mM Tris, pH 8
BSA	Sigma	A2153	Bereiten Sie eine 1%ige (w/v) Lösung in TBS vor. Lagerung bei 4°; C für bis zu einem Monat.
Primärer Antikörper
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Kaninchen	Invitrogen	A-21206
IgG (H+L) Antikörper
Vectashield Einhängemedium mit DAPI	Vector Laboratories	H-1200
ProLong Gold	Invitrogen	P36930
Kunststoff-Objektträgerbox	Fisher	03-448-1	Objektträger mit getrockneten Aufstrichen in Schlitzen bei -20 °C aufbewahren. Auch als Nasskammer verwenden.
Objektträgerschachtel	aus Karton Fisher	12-587-10	Zum bequemen Transport von fleckigen/versiegelten Objektträgern oder zur Lagerung bei 4°C.
Coplin	Dose Fisher	08-816	Verwendung als Waschbecken für Objektträger.