Oberfläche Verbreitung und Immunfärbung von Hefechromosomen

Zusammenfassung

Eine Methode zur Oberflächenspreizung von Chromosomen aus knospenden Hefen wird vorgestellt. Diese Methode leitet sich von einer Methode ab, die zuvor von Loidl und Klein beschrieben wurde. Darüber hinaus demonstrieren wir ein Verfahren zur Immunfärbung von Spreizchromosomen.

Zusammenfassung

Die geringe Größe der Zellkerne der knospenden Hefe Saccharomyces cerevisiae schränkt den Nutzen der Lichtmikroskopie für die Analyse der subnuklearen Verteilung von Chromatin-gebundenen Proteinen ein. Die Oberflächenspreizung der Hefekerne führt zu einer Expansion des Chromatins ohne Verlust gebundener Proteine. Eine Methode zum Oberflächenspreizen gleicht die Fixierung von DNA-gebundenen Proteinen mit einer Waschmittelbehandlung aus. Die demonstrierte Methode ist gegenüber der von Josef Loidl und Franz Klein beschriebenen Methode leicht modifiziert^1,2. Die Methode wurde verwendet, um die Lokalisation vieler chromatingebundener Proteine in verschiedenen Stadien des mitotischen Zellzyklus zu charakterisieren, ist aber besonders nützlich für die Untersuchung meiotischer Chromosomenstrukturen wie meiotischer Rekombininosomen und des synaptonemalen Komplexes. Wir beschreiben auch eine Modifikation, die keine Verwendung von Lipsol erfordert, einem proprietären Waschmittel, das im ursprünglichen Verfahren gefordert wurde, aber nicht mehr im Handel erhältlich ist. Ein Immunfärbeprotokoll, das mit der Chromosomenspreizmethode kompatibel ist, wird ebenfalls beschrieben.

Einleitung

Die Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae bietet viele Vorteile für die Untersuchung der molekularen Mechanismen der biologischen Prozesse, einschließlich der Untersuchung von Proteinen, die Chromosom-Funktion steuern. Zwar gibt es die bekannten Vorteile von Bäckerhefe für genetische, molekularen und biochemischen Studien wird zytologische Untersuchungen der Verteilung der Proteine ​​in den Zellkern durch seine geringe Größe kompliziert. Die typische Hefenukleus hat einen Durchmesser von weniger als einem Mikrometer, die nur etwa das 5fache der Auflösungsgrenze des sichtbaren Lichts ist. Somit wird die Menge von Informationen über die Verteilung von Kernproteinen, die von herkömmlichen Immunfärbung oder durch Verwendung von fluoreszierenden Protein-Tags, wie zum Beispiel das grün fluoreszierende Protein (GFP) erhalten werden können, ist begrenzt. Ein nützlicher Ansatz zur Charakterisierung der subnuclear Verteilung von Proteinen ist Chromosom Oberfläche ausbreitet. Dieser Ansatz beinhaltet die Entfernung der Zellwand, stören und Zellkernmembranen und einellowing Die unlöslichen Bestandteile des Kerns, um auf die Oberfläche eines Objektträgers zu regeln. Diese unlöslichen Bestandteile sind die Kernmatrix und die Chromosomen. Darüber hinaus ermöglicht die Entfernung der löslichen Kerninhalte, die die Fähigkeit zur Chromatin gebundene Proteine ​​erkennen erhöht, das Chromosom Spreizverfahren zu einer wesentlichen Dekompression von Chromosomen, so dass die Ausbreitung Kernen haben einen Durchmesser von etwa 3 bis 5 um (z diploiden meiotischen Kerne) und 2 bis 3 um für diploide mitotischen Kernen. Diese Dekompression ermöglicht den Nachweis von Kernstruktur, die relativ schwierig oder unmöglich, in intakten Zellkernen zu beheben ist.

Ein offensichtlicher Nachteil auf Chromosom Verbreitung ist die Möglichkeit, dass die Ausbreitung Verfahren kann teilweise oder vollständig die Struktur von Interesse stören. Von besonderem Interesse ist, dass einem bestimmten Chromosom gebundene Protein wurde, infolge des Streuverfahren verloren. Diese mögliche Komplikation should bei der Interpretation Daten gehalten werden. Ein Beispiel eines Proteins, das empfindlich auf den Spreizvorgang ist beta-Tubulin. Unter bestimmten Bedingungen kann sich die Spindel, die im Wesentlichen von Tubulin umfaßte, wird beim Aufspreizen ³ erhalten. Visualisierung der Spindel ist oft nützlich, um Kerne von Interesse Stufe. , Visualisierung Tubulin erfordert jedoch eine Behandlung mit einer hohen Konzentration Haarfestiger; Spindeln sind unter den nachstehend beschriebenen Standardbedingungen verloren. Dieses Beispiel zeigt, dass bei der Analyse der Verteilung von einem zuvor nicht charakterisiertes Protein, ist es wichtig, die Konzentration an Fixiermittel, um zu bestimmen, wie empfindlich das Protein an eine solche Variation variieren. Trotz der Bedenken in Bezug auf die Auswirkungen der Verbreitung Bedingungen auf Chromosomenstruktur hat die Nützlichkeit und Leistung des Verteilungsmethode in vielen Zusammenhängen gezeigt und hat breite Anwendung in der mitotischen und Charakterisierung, insbesondere meiotischen Zellen ^4-7.

Two Verbreitung Methoden ausgiebig genutzt. Die erste dieser Methoden, die von Dresser and Giroux ⁸ entwickelt, vermeidet die Verwendung von Reinigungsmittel und Verbreitung Zubereitungen, die relativ gut erhaltene Chromosomen-Morphologie, wenn für die DNA-spezifische Farbstoff DAPI gefärbt zu haben scheinen zu ergeben. Allerdings ist dieses Verfahren relativ schwierig zu vervollkommnen und die Qualität der Ausbreitung Kerne variiert stark, wenn eine Region eines Schiebers zu anderen Regionen verglichen. Dieses Problem kann man quantitative Ansätze, die die Abbildung viele nicht ausgewählten Kerne von einer Folie zur Datenerfassung Verzerrungen zu vermeiden beinhalten erschweren. Die zweite Chromosomenverteilungsmethode, die von Loidl und Klein ¹ entwickelt, beinhaltet Ausgleichs Fixierung durch Paraformaldehyd, mit Lyse und Chromatin Dekompression durch eine Reinigungslösung gefördert. Wenn sie richtig durchgeführt wird, gibt diese Methode sehr reproduzierbare Ergebnisse mit weniger Region zu Region Variation im Vergleich zum Dresser and Giroux Verfahren. Diese Präsentation konzentriert sich auf eine Modified Version des Verfahrens von Loidl und Klein, wegen ihrer Zuverlässigkeit und Einfachheit.

Chromosom Verbreitung ist nicht kompliziert oder zeitraubende; bis zu 100 Objektträger für Immunfärbung an einem Tag hergestellt werden. Darüber hinaus können die Ausbreitung Vorbereitungen in der Tiefkühltruhe für die Jahre vor Immunfärbung gespeichert werden und damit Labore können ein Repository von gefrorenem Chromosomen-Spreads, die verwendet werden können, wenn neue biologische Fragen stellen oder neue Nachweisreagenzien zur Verfügung zu entwickeln.

Das Chromosom verbreiten Verfahren wird am häufigsten in Kombination mit Immunfärbung und Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie verwendet, aber es ist auch möglich, Objektträger für die Super-Resolution-lichtmikroskopische Methoden wie Stimulated Emission Depletion (STED) Mikroskopie vorzubereiten.

Protokoll

HINWEIS: Einige Schritte des Protokolls erfordern unter Arbeiten in einem sauberen Abzug. Außerdem erfordert das Verfahren eine Hefe Tetrade Präpariermikroskop mit einem 10X großen Arbeitsabstand Ziel ausgestattet Spheroplasting überwachen. Das Mikroskop sollte in der Haube vor der Zeit eingestellt werden. Entfernen Sie den Mikromanipulator Arm und Plattenhalter aus dem Anwendungsbereich und setzen diese Elemente in einem sicheren Ort weg vom Arbeitsbereich.

1. Herstellung von Sphäroplasten

1. Wachsen Hefe unter gewünschten Bedingungen. Gebrauch über 2 x 10 ⁸ Zellen für jede Probe, beispielsweise 4 ml einer Kultur bei 1,4 OD600 = 5 x 10 ⁷ Zellen / ml. Obwohl sofortige Verarbeitung von Proben kann in einigen Fällen bevorzugt sein, für die meisten Anwendungen, Zell Aliquots auf Eis für bis zu 8 Stunden vor der Verarbeitung gelagert werden.
2. Übertragen Zellsuspension in ein 15 ml Zentrifugenrohr und Spin in einer klinischen Zentrifuge bei Einstellung 5 (2345 rpm / 857,5 × g) für 3 min, um die Zellen zu pelletieren.
3. Dekantieren Sie das Medium dabei nicht zu Zellen aus dem Pellet zu verlieren. Vorsichtig resuspendieren Zellen in 1 ml Puffer ZK und fügen Sie 40 ul 1 M Dithiothreitol (DTT). Inkubieren Sie 2 min unter leichtem Mischen. Pellet-Zellen wie zuvor (siehe Schritt 1.2).
4. Resuspendieren Pellets in 1 ml Puffer ZK. Werden 5 ul einer frisch hergestellten Lösung von Zymolyase 100T, die gründlich gemischt wurde. Inkubieren für 20-30 min bei 30 ° C, um die Zellwand zu entfernen und Sphäroplasten.
5. Assay Eine 10 ul Tropfen der Zellsuspension auf einen Objektträger zu bestimmen, ob Spheroplasting abgeschlossen ist. Zellen unter dem Dissektionsmikroskop ohne Deckglas betrachtet. Die Zellen sind aufgedunsen und runde anstatt etwas länglich erscheinen und sollte nach der Zugabe von 20 & mgr; l Wasser zu lysieren. Wenn Zellen nicht zur Lyse, Rückkehr der Probe auf 30 ° C und re-Assay alle 10 Minuten, bis das Wasser induzierte Lyse leicht zu beobachten ist. Pellet-Zellen wie zuvor (siehe Schritt 1.2).
6. Vorsichtig resuspendieren und waschen Zellpellet in 2,5 ml kaltem MES / Sorbit-Puffer. Pellet-Zellen wie zuvor (siehe Schritt 1.2). Vorsichtig resuspendieren Zellpellet in 300 bis 400 & mgr; l kaltem MES / Sorbit-Puffer. Zellen auf Eis in dieser Phase für mehrere Stunden gehalten werden.

2. Chromosome Verbreitung

HINWEIS: Die Glasflächen, auf denen Chromosomen verteilt, entweder werden Folien oder Deck-sollte vor der Zeit vorbereitet werden. Jeder Objektträger oder Deckglas sollte in Wasser getaucht werden, dann EtOH, dann trocknen gelassen, und poliert mit Objektiv Papier. Wenn Chromosomen auf Deckgläsern verteilt werden, sollte das Deckglas auf einem Objektträger mit Scotch Klebeband oder Gummizement befestigt werden. Soweit nicht anders erwähnt, wird der Rest des Protokolls beschreiben Ausbreitung entweder auf einem Objektträger oder Deckglas

1. Verwendung einer P20-Pipette Pipette 20 ul Zellsuspension auf die Oberfläche einer sauberen Folie.
2. Verwendung eines P200 Pipette 40 ul 3% PFA / Saccharose-Lösung und vorsichtig mischen die solution durch "wirbelnden" die Folie mit der Hand, bis Schlieren Linien verschwinden. Den Objektträger unter dem Mikroskop, und bestätigen Sie, dass Zellen im Fokus. Die PFA-Lösung sollte im Abzug am Tag der Verwendung frisch zubereitet.
   Hinweis: Wenn das Protein von Interesse wurde durch das Verfahren nicht zuvor geprüft worden sind, ist es ratsam, zusätzliche Folien unter Verwendung von Lösungen, die 2 bis 4% PFA enthalten, um festzustellen, ob Retention des Proteins ist empfindlich gegen Fixierbedingungen vorzubereiten. A 4% PFA / Saccharose-Lösung wird in Fällen, in denen es wünschenswert ist, assoziiert Tubulin Mikrotubuli Visualisierung verwendet. Der Nachteil der höheren Fixiermittel Konzentration, dass die Chromosomen werden "underspread", 2% PFA neigt auch dazu, "underspread" Chromosomen zu ergeben.
3. Verwendung eines P200 Pipette 80 ul 1% LIPSOL, wirbeln wie zuvor, um Lösungen möglichst vollständig zu mischen, starten Sie einen Timer. Wenn LIPSOL nicht verfügbar ist, können 80 & mgr; l 1% NP40 oder 80 & mgr; l dH ₂ O werdensubstituierten (siehe Repräsentative Ergebnisse, Abbildung 2).
4. Beobachten Sie die Zellen vorsichtig und sanft wirbeln den Schiebe alle 15 sec. Bei etwa 80% der Zellen lysiert (verschwunden) stoppen Sie den Timer, ziehen Sie sofort den Schlitten aus dem Mikroskop, fügen Sie 80 ul PFA / Saccharose-Lösung, und Schwenken vermischen. Lyse sollte aus zwischen 30 und 90 sec nach dem Start des Zeitgebers auftreten.
   HINWEIS: Wenn mehrere Folien zeigen Lyse etwa zur gleichen Zeit, kann man schließlich mikroskopische Beobachtung für den Rest der Folien weglassen und einfach nur vorsichtig Mal, wenn die Zeit zwischen Zugabe von LIPSOL und Zugabe der letzten Aliquot Fixiermittel. Allerdings ist diese Abkürzung nur zuverlässig bei der Herstellung mehrere Folien aus der gleichen Probe. Am besten ist es, um die Lyse von jeder Probe mikroskopisch zu überwachen, wenn verschiedene Folien werden aus Proben zu verschiedenen Zeiten aufgenommen oder aus verschiedenen Kulturen vorbereitet.
5. Legen Sie die Folie auf eine ebene Fläche und die Ausbreitung der Flüssigkeit über die gesamte unfrosted surface des Schiebers mit der Seite eines sauberen Einwegpipette Weide unterhalb des Meniskus des "puddle", aber über der Oberfläche der Folie selbst, dh statt. nicht "Rake" der Oberfläche des Objektträgers mit der Pipette. Pipette auf verschiedenen Folien nicht wiederverwenden, um eine Kontamination der Proben zu vermeiden.
6. Lassen Sie die Objektträger über Nacht im Abzug trocknen. Unlöslichen Kernkomponenten wird auf die Gleitfläche zu regeln und zu binden. Für große Experimente, ist die Planung der Nutzung des Weltraums für die Trocknungsstufe wichtig.
7. Einmal getrocknet werden optimale Resultate erzielt, indem der in die Immunfärbung Stufe am gleichen Tag erhalten. Das getrocknete Saccharose-Lösung bettet jedoch die Ausbreitung Chromosomen in einer "Honig", das Einfrieren von Proben erlaubt: Folien können auf eine Kunststoffschieber-Box überführt und bei -20 ° C über Jahre gelagert werden.

3. Immunfärbung

1. Dip Slides in 0,2% Foto-Flo 30 Sek. um Honig zu entfernen. Lean gleitet aufeine Kante, wobei die Kante auf einem Papiertuch ruht, um restliche Photo-Flo entfernen.
2. Dip Slides in 1x TBS für 5 min waschen. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit durch gelehnt gleitet auf einer Kante, aber sie nicht austrocknen lassen.
3. Legen Sie Folien mattiert Seite nach oben, Pipette 300 ul TBS / BSA auf den Objektträger über die unfrosted Teil der Folie.
4. Inkubieren in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur für 15 min. (Große Plastikbehälter mit Wasser gesättigt Papierhandtücher unter einem Lochblech oder Kunststoffschieber Feld gesäumt von gesättigten Papierhandtücher).
5. Ablassen gleitet durch eine kurze Ruhe Rand des Objektträgers auf einem Papiertuch und lehnte den Schieber gegen einen geeigneten Träger (zB einem Reagenzglas Rack). Erlauben keine Oberfläche zu trocknen.
6. 80 ul TBS / BSA-Puffer, der die entsprechende Verdünnung des primären Antikörpers unmittelbar gelten. Wenn Antikörper Begrenzung, verwenden 40 ul und einem 22 x 22 mm Deckglas. Für grobe Kaninchenserum, das ist in der Regel zwischen einem und 1/50 1/500 Verdünnung.
   HINWEIS:Führen Titrationen für neue Antikörperpräparate. Die verdünnte Präparat, das High-Signal über dem Hintergrund ergibt gewählt wird. Um das Niveau der Hintergrundfärbung zu kontrollieren, sollte Kerne aus dem entsprechenden Deletionsmutante Stamm und / oder doppelte Trägern hergestellt sollte mit Präimmunserum gefärbt werden.
7. Legen Sie eine polierte 22 x 50 mm Deckglas auf der Folie zu vermeiden Blasen. Tun Sie dies, indem Sie die Deckglas zwischen dem Daumen und Zeigefinger an der langen Kante an Positionen in der Nähe von einem der kurzen Kante. Halten des Deckplättchens in einem 30 ° Winkel relativ zu gleiten, die kurze Kante der am weitesten von den Fingern wird abgesenkt, bis sie auf der Folie gerade innerhalb der Kante des "puddle" in der Nähe des bereiften Bereich des Schiebers ruht. Anschließend langsam das Deckglas in einer fließenden Bewegung, bis die Finger, die die Folie berühren die Bank, und dann los. Versuchen Sie nicht, die Position des Deckglases einzustellen, sobald sie landet.
   HINWEIS: Wenn Chromosomenspreads wurden vorbereitetklebten Deckgläser (anstatt direkt auf der Oberfläche der Folien), wird diese Probe Deckglas auf dem Objektträger in den Färbe- und Waschschritte fixiert zu bleiben. Eine zusätzliche Deck wird auf der Oberseite des Deckglases Probe gleichmäßig zu verteilen, der Antikörperlösung während der Färbung und anschließend verworfen platziert werden.
8. Die Objektträger in einer feuchten Kammer abgedichtet und Inkubation über Nacht bei 4 ° C.
9. Halten Sie die mattierte Rand Die Objektträger in einen Objektträger Färbebank und tauchen in Küvette enthält TBS.
10. Tauchen Sie vorsichtig die Folie nach oben und unten, um das Deckglas zu entfernen. Versuchen, nicht zu viel Kraft zu verwenden, um dies zu tun. Waschen Sie die Objektträger 2x 10 Minuten durch Eintauchen in TBS. Objektträger aus Rack und Drain überschüssige Flüssigkeit durch Berührung Kante zu Papiertuch. Lassen Sie nicht die Oberfläche trocken.
11. Arbeiten unter gedämpftem Licht, sofort hinzufügen 80 ul TBS / BSA, das eine 1/1000-fachen Verdünnung von Fluorochrom konjugierten Sekundärantikörper (oder 40 & mgr; l mit einer 22 x 22 mm Deckglas). Anzeiged Deck wie zuvor, und Inkubieren bei 4 ° C für 2 Stunden in der feuchten Kammer im Dunkeln.
12. Deckgläser zu entfernen, wie zuvor, abtropfen Folien und ermöglichen Oberfläche an der Luft trocknen für 1 bis 2 Stunden in der Dunkelheit. Lean Folien auf Papierhandtüchern wie zuvor.
    HINWEIS: Wenn die Verbreitung auf einem Deckglas montiert geführt wird, nehmen Sie das Deckglas aus der Folie vor dem Trocknen. Deckgläser werden dann wie für Dias in dem vorherigen Schritt beschrieben getrocknet.
13. Arbeiten unter gedämpftem Licht, fügen Sie etwa 30 & mgr; l Medium, das Montage DAPI (drei 10 ul Tröpfchen) und dann vorsichtig senken Deckglas auflegen. Wenn die Spreads auf Deckgläsern, legen Sie die Tropfen Eindeckmedium auf einen sauberen Objektträger und Deckglas, Chromosom Seite nach unten auf die Folie.
14. Noch unter gedämpftem Licht, warten Sie 2 Minuten für Deck sich niederzulassen und zu versiegeln Kanten der Deckglas mit klarem Nagellack. Die Objektträger in eine flache Schiebeschachtel.
    HINWEIS: Bei der STED-Mikroskopie, Halterung mit ProLong Gold. Verwenden Sie 30 ul ProLong Gold-ohne DAPI und über Nacht heilen. Abdichtung mit Nagellack ist nicht notwendig.
15. Blick gleitet von Weitfeld-Epifluoreszenzmikroskopie mit einem 40 oder 100x Objektiv mit einem Filtersatz passend für DAPI zu konzentrieren. Gegebenenfalls Speicherung des Objektträgers in der Dunkelheit bei 4 ° C für mehrere Wochen. Nicht einfrieren.

Ergebnisse

Das Aussehen der Ausbreitung Kerne kritisch, hängt von der Balance zwischen Chromosom Fixierung und de-Verdichtung. Selbst wenn die Reagenzien korrekt ausgeglichen werden, kann die Variation in dem Grad der Chromosom de Verdichten in den verschiedenen Regionen der gleichen Folie und / oder zwischen verschiedenen Folien auftreten. Somit sollte die Qualität der Aufstriche in einer bestimmten Region eines Schiebers beurteilt werden, bevor Bilder interpretiert werden.

Die Wirkungen der "Übe...

Diskussion

Das Auftreten von Spreizkeimen hängt entscheidend von der Balance zwischen Fixierung und Lyse-/Detergenzienbehandlung ab. Wie oben diskutiert, erfordert die Erhaltung unterschiedlicher zellulärer Strukturen die Verwendung unterschiedlicher PFA-Konzentrationen. Für die meisten Proteine sind 3 % PFA optimal. Für die Konservierung der Spindeln ist jedoch die Verwendung von 4 % PFA erforderlich. Selbst mit einem einzigen Satz von Reagenzien kann auch der Zeitpunkt der Lyse im Verhältnis zur Fixierung die Qualität der ausge...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Zymolyase	US Biologisch	Z1004	Bereiten Sie eine Lösung von 20 mg/ml in 50 mM Tris pH 7,5 zu, ergänzt mit 2 % Glukose. Jedes Experiment frisch zubereiten und bei 4° lagern; C bis zur Gebrauchsbereitstellung.
Lipsol	L.I.P. Ltd	nicht mehr im Handel erhältlich	1%ige (v/v) Lösung in Wasser herstellen. Auf Eis lagern.
NP-40	USB	19628	1%ige (v/v) Lösung in Wasser herstellen. Auf Eis lagern.
Tween 20	Sigma	P2287
Objektträger	Corning	2948-75x25
Standard	Deckglas Fisher	12-544-E oder 12-540-B
Hochauflösende Deckgläser	Fisher	12-542-B
Photo-Flo 200 Lösung	Kodak	P-7417	0,2%ige (v/v) Lösung in Wasser herstellen.
TBS			137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 24,7 mM Tris, pH 8
BSA	Sigma	A2153	Bereiten Sie eine 1%ige (w/v) Lösung in TBS vor. Lagerung bei 4°; C für bis zu einem Monat.
Primärer Antikörper
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Kaninchen	Invitrogen	A-21206
IgG (H+L) Antikörper
Vectashield Einhängemedium mit DAPI	Vector Laboratories	H-1200
ProLong Gold	Invitrogen	P36930
Kunststoff-Objektträgerbox	Fisher	03-448-1	Objektträger mit getrockneten Aufstrichen in Schlitzen bei -20 °C aufbewahren. Auch als Nasskammer verwenden.
Objektträgerschachtel	aus Karton Fisher	12-587-10	Zum bequemen Transport von fleckigen/versiegelten Objektträgern oder zur Lagerung bei 4°C.
Coplin	Dose Fisher	08-816	Verwendung als Waschbecken für Objektträger.