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Methodenartikel

In-situ-Mapping der mechanischen Eigenschaften von Biofilmen durch Partikel-Tracking Mikrorheologie

9.1K Ansichten

DOI:

10.3791/53093

4. Dezember 2015

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die partikelnachfolgende Mikrorheologie untersucht die Viskoelastizität von Materialien. Hier wird die Technik verwendet, um die Viskoelastizität, die Kriechnachgiebigkeit und die effektive Vernetzungsrolle verschiedener Matrixkomponenten eines bakteriellen Biofilms zu bestimmen. Die Matrix besteht aus polymeren Substanzen, die von den Bakterien sezerniert werden, und ihre Bestandteile bestimmen die Struktur des Biofilms und die mechanischen Eigenschaften.

Zusammenfassung

Bakterienzellen sind in der Lage, oberflächengebundene Biofilmgemeinschaften zu bilden, die als Biofilme bekannt sind, indem sie sich in extrazelluläre polymere Substanzen (EPS) einhüllen. Das EPS dient als physikalisches und schützendes Gerüst, das die Bakterienzellen beherbergt und aus einer Vielzahl von Materialien besteht, darunter Proteine, Exopolysaccharide und DNA. Die Zusammensetzung des EPS kann sich ändern, wodurch die mechanischen Eigenschaften des Biofilms umgestaltet werden, um alternative Biofilmstrukturen, wie z. B. Streamer, als Reaktion auf Umwelteinflüsse weiterzuentwickeln oder zu unterstützen. Trotzdem gibt es nur wenige quantitative Beschreibungen darüber, wie EPS-Komponenten zu den mechanischen Eigenschaften und der Funktion von Biofilmen beitragen. Die Rheologie, die Lehre von der Stoffströmung, ist für Biofilme von besonderer Bedeutung, da viele Biofilme unter Strömungsbedingungen wachsen und ständig Scherspannungen ausgesetzt sind. Es bietet auch Messungen und Einblicke in die Ausbreitung des Biofilms auf einer Oberfläche. Hier wird die partikelverfolgende Mikrorheologie eingesetzt, um die Viskoelastizität und die effektive Vernetzungsrolle verschiedener Matrixkomponenten in verschiedenen Teilen des Biofilms während der Entwicklung zu untersuchen. Dieser Ansatz ermöglicht es den Forschern, die mechanischen Eigenschaften von Biofilmen auf der Mikroskala zu messen, was nützliche Informationen für die Kontrolle und Konstruktion von Biofilmen liefern könnte.

Einleitung

Die meisten Bakterienzellen sind in der Lage, sowohl planktonischen (frei lebende) und oberflächengebundenen (sessile) Modi des Wachstum 1 einzusetzen. In der Oberfläche gebundenen Modus des Wachstums von Bakterienzellen zu sekretieren und umhüllen sich in großen Mengen von extrazellulären polymeren Substanzen (EPS), Biofilme bilden. Die EPS besteht hauptsächlich aus Proteinen, Exopolysaccharid, extrazelluläre DNA und ist wichtig, um die Biofilmbildung 2. Sie dient als physikalische Gerüst durch die Bakterien nutzen können, um räumlich unterscheiden und schützt die Bakterien vor schädlichen Umweltbedingungen und Wirtsreaktionen. Verschiedenen Be....

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Protokoll

1. Biofilm Anbau

  1. Zubereitung von Bakterienstämmen
    1. 1 Tag vor Biofilm Anbau, vorzubereiten planktonischen Bakterienkulturen durch Inokulation von 2 ml geeigneten Wachstumsmedium aus gefrorenem Bakterienkultur. Verwenden Luria-Broth-Medium (10 g L -1 NaCl, 10 g L -1 Hefeextrakt und 10 g L -1 Trypton) zum mucoid P. aeruginosa und dessen Δ pel und Δ psl Defektmutanten. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C und 200 rpm schütteln Bedingungen. Verdünnte-Nacht-Kulturen auf eine OD600 von 0,40 unter Verwendung eines Spektrophotometers.
    2. Montieren Flusszelle Setup, die zuvor beschrieb....

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Ergebnisse

Die lokalen viskoelastischen Eigenschaften des Biofilms in verschiedenen Regionen des Biofilms, der die Hohlräume (mittel über dem Biofilm), Ebenen (undifferenzierte flachen Schicht von Zellen) und Mikrokolonien (siehe Etiketten in 2A) aufgenommen wurden untersucht. Die zeitlichen Änderungen der viskoelastischen Eigenschaften des Biofilms während der Reifung von den Tagen 3 bis 5 wurden ebenfalls bestimmt. Der MSD der Partikel in den Hohlräumen wurde als Kontrolle und vergleichbar mit dem MSD von Partik.......

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Diskussion

Mikrorheologie ist ein nützliches Instrument für die lokale rheologischen Messungen in heterogenen Systemen, wie mikrobielle Biofilmen. Es ist eine zerstörungsfreie Technik, so dass der Echtzeit-Überwachung der rheologischen Veränderungen innerhalb der gleichen biologischen Probe über mehrere Zeitpunkte. In diesem Protokoll wurde partikel Tracking Mikrorheologie um Pel und Psl Exopolysaccharid Mutanten in Reihenfolge angewendet, um zu untersuchen, wie sie die Elastizität und die effektive Vernetzung des Biofilmmatrix be.......

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Forschung wird von der National Research Foundation und Bildungsministerium Singapur unter seinem Forschungszentrum der Excellence-Programm unterstützt, das Start-up Grants (M4330002.C70) aus Nanyang Technological University und ACRF Tier 2 (MOE2014-T2-2-172) vom Ministerium für Bildung, Singapur. Die Autoren danken Joey Yam Kuok Hoong für die Teilnahme an der Demonstration dieses Protokolls.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
FluorsphärenInvitrogenF-88211.0 μ m rot fluoreszierende (580/605) Mikrosphären mit Carboxylatmodifikation
Zeiss Axio Imager M1Carl ZeissEpifluoreszenzmikroskop
Masterflex L/S Digital Drive 07523-80Cole-ParmerEW-07523-80Peristaltische Pumpe
DurchflusszellenkammernTechnische Universität Dänemark
Bubble TrapTechnische Universität Dänemark
SilikonschlauchDow Corning3 mm Außendurchmesser, 1  mm Innendurchmesser
Durchsichtige Polypropylen-Kunststoffverbinder Cole Parmer06365-831/16 Zoll (1.588 mm)
BindeklammernZum Klemmen von Schläuchen
DeckgläserThermo Scientific™ Nunc&Handel;50 x 24 mm
Spritze 3 mlTerumo
27   G NadelTerumo
2   L Lager-/MedienflaschenVWR®
Wagenzum Halten des Biofilm-Setups

Referenzen

  1. Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M. Microbial biofilms. Annu Rev Microbiol. 49, 711-745 (1995).
  2. Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 8, 623-633 (2010).
  3. Yang, L., et al.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

Mechanische Eigenschaften von Biofilmenextrazellul re polymere Substanzenfluoreszierende Mikrosph renmittlere quadratische VerschiebungViskoelastizit tsanalyseFlow Cell KulturFiji ImageJMATLAB AnalyseKriechdehnung