Feste Lipidnanopartikel (SLN) für die intrazelluläre Targeting-Anwendungen

Zusammenfassung

In dieser Studie wurde eine Methode zur Synthese ultrakleiner Populationen biokompatibler Nanopartikel beschrieben, sowie mehrere in vitro Methoden, mit denen ihre zellulären Wechselwirkungen bewertet werden können.

Zusammenfassung

Nanopartikel-basierte Verabreichungsvehikel haben sich als vielversprechend für intrazelluläre Targeting-Anwendungen erwiesen und bieten einen Mechanismus, um die zelluläre Signalübertragung und Genexpression spezifisch zu verändern. In einer früheren Untersuchung wurde die Synthese von ultrakleinen festen Lipid-Nanopartikeln (SLNs) für die topische Wirkstoffverabreichung und den Biomarker-Nachweis demonstriert. SLNs sind ein gut untersuchtes Beispiel für ein Nanopartikel-Verabreichungssystem, das sich als vielversprechendes Vehikel zur Verabreichung von Medikamenten erwiesen hat. In dieser Studie wurden SLNs mit einem Fluoreszenzfarbstoff beladen und als Modell zur Untersuchung von Partikel-Zell-Wechselwirkungen verwendet. Die Phaseninversionstemperatur-Methode (PIT) wurde für die Synthese ultrakleiner Populationen biokompatibler Nanopartikel verwendet. Ein 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assay wurde verwendet, um geeignete Dosierungsniveaus vor den Nanopartikel-Zell-Interaktionsstudien festzulegen. Darüber hinaus wurden primäre humane dermale Fibroblasten und dendritische Zellen der Maus über die Zeit mit farbstoffbeladenem SLN exponiert und die Wechselwirkungen in Bezug auf Toxizität und Partikelaufnahme mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie charakterisiert. Diese Studie zeigte, dass ultrakleine SLNs als Nanopartikel-Abgabesystem für das intrazelluläre Targeting verschiedener Zelltypen geeignet sind.

Einleitung

Nanopartikel-basierten Lieferfahrzeuge haben ein großes Versprechen für die intrazelluläre Targeting-Anwendungen gezeigt, die Bereitstellung eines Mechanismus, um gezielt zu verändern zellulären Signaltransduktion und Genexpression. Diese Fahrzeuge können mit Medikamenten, Proteinen und Nukleinsäuren, einen Aufprall zellulären Reaktionen und erreichen eine gewünschte Wirkung auf Zielgewebe beladen werden. Viele Arten von Nano zu therapeutischen und diagnostischen Nutzen, einschließlich Lipide, Polymere, Silizium und magnetischen Materialien untersucht worden. Diese Systeme sind attraktiv aufgrund ihres Potentials zur lokalisierten Arzneimittelabgabe, erhöhten therapeutischen Konzentration im Zielgewebe, und eine Verringerung der systemischen Toxizität.

Feste Lipidnanopartikel (SLN) sind ein gut untersuchtes Beispiel einer Nanopartikel-Abgabesystem, das als vielversprechende Arzneimittelabgabevehikel in den letzten Jahren abzeichnet. SLNs kann leicht für mehrere Anwendungen einschließlich Bio-Sensing ^1, Kosmetika ^{2 und} t formulierenherapeutic Lieferung ^3-7. Ihr Nutzen ergibt sich aus der Tatsache, dass sie vollständig aus resorbierbaren, ungiftig Lipiden, was zu einer verbesserten Biokompatibilität. Während der Synthese können lipophile Medikamente in SLN Fahrzeuge aufgenommen werden, wodurch Arzneimittellöslichkeit und Eignung Erhöhung für die parenterale Verabreichung. SLN Fahrzeugen auch dazu beitragen, eingekapselt Therapeutika zu stabilisieren, wodurch deren Abbau und Freiraum, und die Maximierung der therapeutischen Wirkung. Diese Fahrzeuge sind vor allem für Langzeitwirkung, kontrollierte Trennöle gut geeignet aufgrund ihrer Stabilität bei Körpertemperatur ^3,4,8,9. Wichtiger ist, Verkapselung von Wirkstoffen in Lipidnanopartikel ändert die intrinsische die pharmakokinetischen Profile der Arzneimittelmoleküle. Dies bietet einen Vorteil, indem sie die kontrollierte Freisetzung von Wirkstoffen mit einem engen therapeutischen Index. Die Freisetzungsrate des SLN-einge Therapeutika kann abgestimmt basieren auf der Lipidabbaurate oder das Medikament Diffusionsgeschwindigkeit in dieLipidmatrix.

SLNs werden oft entwickelt, um in spezifischen Zielgeweben ansammeln. Beispielsweise ihre Größe (typischerweise größer als 10 nm) potenziert Retention im Blutkreislauf, wobei der Leaky-Vaskulatur Tumorgewebe erleichtert Abscheidung. Darüber hinaus hat der Weg der Verabreichung Partikel wurde gezeigt, daß die biologische Verteilung, die das Potenzial zu verändern, wie Lymphknoten ^10,11 um spezifische physiologische Zielstrukturen. Bei der Abscheidung in Zielgeweben zu erzielen geeigneten zellulären Wechselwirkungen und eventuelle Internalisierung von Nanopartikeln ist schwierig aufgrund der Fähigkeit der Zellmembranen, um den Fluss von Ionen und Molekülen in die und aus der Zelle ¹² selektiv zu steuern. Um die zelluläre Aufnahme zu erleichtern, ist es möglich, Nano mit spezifischen Liganden einschließlich Peptiden, kleine Moleküle, als auch monoklonale Antikörper ^13,14 modifizieren. Verschiedene Mechanismen, die sowohl passive Penetration und aktiven Transport von Nanopartikelnüber die Zellmembran sind zuvor beschrieben worden ^3,12,15. Im allgemeinen hat es sich gezeigt, daß zell Nanopartikel Wechselwirkungen werden durch die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Nanopartikel einschließlich der Größe, Form, Oberflächenladung und Oberflächenchemie beeinflusst neben zellspezifischen Parameter wie Zelltyp oder ^{Zellzyklus-Phase} 12.

Eine frühere Untersuchung zeigte die Synthese von Sub-10 nm SLNs zur topischen ¹⁶ und Biomarker-Erkennungsanwendungen ¹ unter Verwendung der Phaseninversionstemperatur (PIT) Verfahren ^17. Dies ist eine schonende ^{Syntheseverfahren,} wobei 2 die Zusammensetzung konstant bleibt, während die Temperatur allmählich verändert wird. Kontinuierliches Rühren der erhitzten Lösung beim Abkühlen auf Raumtemperatur führt zu einer Nanoemulsion. Dieses Verfahren resultiert in der Synthese von SLNs mit kleinerer Teilchengrße ¹ als die zuvor unter Verwendung verschiedener Verfahren für die Synthese von Lipid nan gemeldetoparticles ^17-22. Die resultierende Größenskala von weniger als 20 nm beträgt, stellt einen Vorteil für die intrazelluläre Targeting-Anwendungen aufgrund der erhöhten Oberfläche und dem Potential für erhöhte zelluläre Interaktionen.

Eine schematische Darstellung SLNs designt einen fluoreszierenden Farbstoff oder therapeutischen liefern, ist in Abbildung 1 dargestellt. Die SLN bestehen aus einer Lipid Innenraum (zB lineares Alkan), die die Einarbeitung von lipophilen Verbindungen (beispielsweise Farbstoffe oder Therapeutika) und einem Tensid Außen (zB lineares nichtionisches Tensid) von Wasser umgeben ist. In dieser Studie wurden SLNs mit einem Fluoreszenzfarbstoff beladen, und als ein Modell verwendet, um Partikel-Zell-Wechselwirkungen zu untersuchen. Primäre humane dermale Fibroblasten und Maus dendritischen Zellen wurden farbstoffbeladenen SLN über die Zeit ausgesetzt, um Wechselwirkungen im Hinblick auf Toxizität und Partikelaufnahme charakterisieren. A 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenylphenyltetrazolium (MTT) -Assay wurde utilium geeignete Dosierung Ebenen zu etablieren zed. Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie zwei eingesetzt werden, um Partikelaufnahme in vitro zu untersuchen Methoden.

Abbildung 1. Schematische Darstellung des SLN, die die Hauptbestandteile. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Protokoll

1. Die Verarbeitung von SLNs

1. Synthese von SLNs
   Hinweis: Mit der PIT-Methode ^1,17,20, um die Unter 20 nm SLNs ¹ vorzubereiten.
   1. Verwenden Sie aseptisch, Bioreagenzien oder Zellkultur-Reagenzien und sterilen Materialien (dh, Pipetten, Spatel, Fläschchen, etc.).
   2. Verwenden Sie ein Biosicherheitswerkbank für die Synthese von SLN (Abbildung 2).
   3. Kombinieren 0,6 mg Fluoreszenzfarbstoff (Nile Red (NIR) ist NiR Konzentration etwa 0,3 mg / ml) und 0,10 g Heneicosan (Lipid, 5 w / w% Lipid-Konzentration) in einem Glasfläschchen (15 ml), Co-Schmelze mit 90 ° C und umrühren.
   4. Hinzufügen 0,11 g Polyoxyethylen (10) oleylether (Tensid, 5,5 Gewicht / Gewicht% Tensidkonzentration). Co-Schmelzen der resultierenden Mischung bei 90 ° C und rühren.
   5. Hinzufügen 1,79 g steriles Wasser zu der Mischung, Erhitzen auf 90ºC und Rühren, bis eine transparente Nanoemulsion gebildet.
      Hinweis: Unter fortgesetztem Rühren und kontrollierte Kühlung, SLNs erzeugt. Diese Bedingungen verursachen eine Inversion der Wasser-in-Öl-Emulsion zu einer Öl-in-Wasser-Emulsion. Lipophile Moleküle wie NiR Partition auf die Lipidtröpfchen.
   6. Bereiten Sie eine Nanoemulsion parallel ohne Zugabe des Fluoreszenzfarbstoffs, um als Kontrollprobe zu dienen. Kombinieren 0,10 g Heneicosan und 0,11 g Polyoxyethylen (10) oleylether in ein Fläschchen (15 ml) Co-Schmelze bei 90 ° C und umrühren.
      1. Hinzufügen 1,79 g steriles Wasser zu der Mischung, Erhitzen auf 90ºC und Rühren, bis eine transparente Nanoemulsion gebildet.
   7. Weitere Sterilisierung jedes Nanoemulsion mit einer sterilen 0,2 um Filter.
   
   Abbildung 2. Schematische Darstellung der Synthese von SLN. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
2. Teilchengröße und Polydispersity
   1. Verwenden Sie dynamische Lichtstreuung (DLS), um die Teilchengröße und Polydispersität der SLN ^{1 unter Verwendung einer} Glasküvette und ein Gerät zur Partikelgröße zu messen messen.
   2. Vor den Messungen der Proben zu messen, die Teilchengrößen der beiden bekannten Normen nach Herstellerprotokoll für die Standards Vorbereitung und Messung.
   3. Füllen Sie das Glas Küvetten mit 1,5 ml Standardlösung und messen Sie die Standardlösung mit den gleichen Messbedingungen wie die Proben.
      Hinweis: Vorheriger Schritt wurde für jeden Standard wiederholt.
   4. Messen Sie die Proben vorbereitet. Für jeden, die folgenden Versuchsparameter: eine Laufzeit von 100 sec, Brechungsindex von Wasser (1,33), die Viskosität von Wasser bei 20 ° C (1.002 mPa · s).
      Anmerkung: Diese Technik verwendet frequenzverschobenen Lichts, um die Größe der Nanopartikel zu messen.
   5. Berichten über den mittleren Teilchendurchmesser und Polydispersität particle Größenverteilung.
3. Schmelzpunkt und latente Schmelzwärme
   1. Verwenden eines Differential-Scanning-Kalorimeter (DSC) mit einem Auto-Sampler und Flüssigstickstoffkühlquelle ausgestattet, um das thermische Verhalten von SLNs ¹ zu untersuchen.
   2. Pipettieren Sie den bei der Herstellung SLNs in einen 40 ul Aluminiumschale mit einer Masse von etwa 25 mg und hermetisch abzudichten die Pfanne mit einer Universal crimper drücken, um den Feuchtigkeitsverlust während der DSC-Scan zu minimieren.
   3. Messen jedes Nanoemulsion 5 bis 80 ° C.
   4. Bericht der Schmelzpunkt und die latente Schmelzwärme aus dem DSC-Diagramm, wo das Tal stellt den Schmelzpunkt und das Integral der Fläche unter der Kurve in der DSC-Diagramm, geteilt durch die Menge des Materials stellt die latente Schmelzwärme.

2. SLNs Wechselwirkungen mit Fibroblasten und dendritischen Zellen

1. Kultur von primären humanen Fibroblasten
   1. Kultur primären humanen fiFibroblasten gemäß den Anweisungen des Herstellers in einem flüssigen Medium für die Kultur von humanen dermalen Fibroblasten (Medium 106) mit der niedrigen Serum-Wachstumsergänzung (LSGS) -Kit ergänzt. Aufrechtzuerhalten Zellen in einer befeuchteten Atmosphäre bei 37 ° C, 5% CO _{2 und} Subkultur bei Erreichen 80% Konfluenz.
   2. Für beide MTT und Bildanalyse, Samenzellen in einem 96-Well-Platte, bei einer Dichte von 2 ^× 10 4 Zellen pro Vertiefung, und lassen Sie sie bei 37 ° CO / N vor der SLN Belichtung ausgleichen lassen.
   3. Zum Zeitpunkt Null, verdünnter SLNs in Komplettmedium ab (Abbildung 4), in Bezug auf Lipidkonzentration und Zugabe von 10 ul pro Vertiefung an jedem Replikat auch in der 96-Well-Platte.
   4. Aufrechtzuerhalten Zellen bei 37 ° C, 5% CO _{2 während der} Inkubationszeit.
2. MTT Toxizitätstest
   1. Nach 24 h Inkubation mit SLNs bestimmen zelluläre Lebensfähigkeit unter Verwendung des MTT-Assay nach dem Protokoll des Herstellers.
   2. Waschen Sie die Zellen einmal und fügen Sie frisches Medium in jede Vertiefung (100 ul / Vertiefung). Getötet Kontrolle Wells durch Inkubation in einer 70% igen Methanol-Lösung für 10 min vor dem Ersetzen mit frischem Medium.
   3. Hinzufügen MTT-Reagens (10 ul pro Vertiefung) zu jeder Vertiefung der Mikrotiterplatte und Inkubieren O / N bei 37 ° C.
   4. Nach O / N Inkubation solubilisieren intrazellulärem Formazin Kristalle mit dem vorgesehenen Detergenslösung (100 ul pro Vertiefung) gemäß dem Protokoll des Herstellers.
   5. Nach 3 h Inkubation bei RT erhalten Absorptionswerte bei einer Meßwellenlänge von 570 nm mit einem Mikrotiterplatten-Lesegerät.
      Anmerkung: MTT-Reagenz verwendet wird, sollte weniger als 1% (w / v) 3- (4,5-dimethylthiazolyl-2) -2, 5-Diphenyl-Tetrazolium-Bromid.
3. Fluoreszenzmikroskopie
   1. Zu bestimmten Zeitpunkten nach der Dosierung von Fibroblasten mit SLN, wäscht die Fibroblasten zweimal mit steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und fixieren 10 min mit kaltem 70% igem Methanol.
   2. Nach 10 min, Ersetzen Sie das Methanol mit PBS und die Aufnahmen mit einem inversen Mikroskop, mit einem Bandpass (BP) 690/50-nm-Filter-Set.
4. Kultur von Knochenmark der Maus Dendritic Cells
   1. Induzieren Maus-Knochenmark gewonnene dendritische Zellen (BMDC) wie zuvor beschrieben ^23,24. Kurz gesagt, Platte Einzelzellsuspensionen von C57BL / 10 Knochenmark in 100 mm Petrischalen bei ² × 10 6 / Platte mit rekombinantem murinen Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF, 300 U / ml) und rekombinantem murinem IL-4 (B-Zell-stimulierender Faktor, 200 U / ml). Ändern Medien alle 3 Tage.
   2. Am 7. Tag hinzuzufügen NiR belastet SLN auf die Schalen in einer Endkonzentration von 0,5 und 5,0 ug / ml Lipid und Aufrechterhaltung der Zellen in einem 37 ° C, 5% CO _{2 -Inkubator} für die gewünschte Dauer der Exposition.
   3. Sammeln Zellen von den Schalen durch Ansaugen alle Medien in der Platte gesammelt wird in ein 50 ml Röhrchen, gefolgt von gründlichem Waschen der Platte (lose ad verdrängenrente Zellen) mit 5 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), enthaltend 4 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA). Sammeln Sie die erhaltene Zellsuspension in der gleichen 50-ml-Tube.
5. Beurteilung der SLNs Incorporation über Durchflusszytometrie
   1. Bestimmen Sie die Konzentration des in Punkt 2.4.3 erhaltene Zellsuspension und vertreiben 3x10 ⁵ Zellen in eine 12 mm x 75 mm Rund FACS-Röhrchen.
   2. Die Zellen werden durch Zugabe von 1 ml PBS und anschließendem Zentrifugieren der Röhrchen für 5 min bei 400 · g, bei einer Temperatur von 4 ° C.
   3. Der Überstand verworfen und das Pellet mit 100 ul PBS / 2 mM EDTA / 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) (Färbepuffer) mit anti-CD11c-FITC monoklonalen Antikörper (0,25 ug / ml final). Inkubieren für 30 min auf Eis im Dunkeln.
   4. Die Zellen werden mit 1 ml PBS und dann zentrifugieren Röhrchen 5 min bei 400 · g, bei einer Temperatur von 4 ° C.
   5. Überstand verwerfen und resuspendieren jedesPellet mit 400 & mgr; l Färbepuffer. Die Zellen sind nun bereit für die Übernahme der Proben mit einem Durchflusszytometer (möglicherweise mit blauen und roten Lasern ausgestattet ist).
   6. Mit Hilfe der Durchflusszytometrie-Analyse-Software, zu bewerten den Grad der Einbeziehung der SLN von DC durch Gating auf die Bevölkerung von CD11c + Zellen (FITC positiv) und Vergleichen der Intensität der SLN-assoziierte Fluoreszenz (in der PerCP-Cy5.5 oder APC-Kanälen gemessen).

Ergebnisse

Die PIT-Verfahren wurde verwendet, um die SLN zu synthetisieren und die Phaseninversionstemperatur wurde bestimmt unter Verwendung eines Wasserbades. Die Proben wurden langsam erwärmt und vorsichtig gerührt, bis die Lösung klar erschien. Der Phaseninversionstemperatur für die SLNs unter Verwendung Heneicosan Lipid 45 ° C. Tabelle 1 faßt die Teilchengröße, Polydispersität, Schmelzpunkt und die latente Schmelzwärme für den SLN. Die synthetisierten Verwendung der oben beschriebenen Verarbeitungsbedingungen...

Diskussion

In dieser Studie wurden die Synthese SLNs und ihre Anwendbarkeit für eine intrazelluläre Targeting-Anwendungen erforscht. Diese biokompatible Nanopartikel versprechen als Lieferfahrzeuge für mehrere Anwendungen einschließlich der Arzneimittelabgabe, Gen-Silencing, und Impfstoff-Technologien ^25-30 gezeigt. Ultrakleine SLNs wurden unter Verwendung eines einfachen Prozesses hergestellt, und ihre Wechselwirkungen mit primären Hautzellen und primären Immunzellen wurden untersucht. SLNs wurden zur Verkapselung von ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Nilrot (NiR)	Sigma	19123	BioReagenz, geeignet für Fluoreszenz, ≥ 98,0%
Heneicosan	Aldrich	286052	98%
Brij O10	Sigma	P6136	Brij 97, C18-1E10, Polyoxyethylen (10) Oleylether
Wasser	Sigma	W3500	Sterilfiltriert, BioReagenz, geeignet für Zellkultur
Spritzenfilter 0,2 & Mikro; m Supor Membran Low Protein Binding	Life Sciences	PN4612	Nicht-pyrogener
Nanotrac Ultra	Microtrac	Seriennummer U1985IS	Instrument
Differential Scanning Calorimeter	Mettlet-Toledo		Instument
Primäre humane Fibroblasten	Life Technologies	C-004-5C	für Neugeborene (HDFn)
Medium 106	Life Technologies	M-106-500	Ein steriles, flüssiges Medium für die Kultivierung von humanen dermalen Fibroblasten.
Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit)	Life Technologies	S-003-K	Alle Komponenten des kompletten LSGS
MTT Cell Proliferation Assay Kit	Trevigen	4890-025-K	Sensitives Kit für die Messung der Zellproliferation basierend auf der Reduktion des Tetrazoliumsalzes, 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromid (MTT)
Safire2 Mikroplatten-Reader	Tecan	----	Instrument
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Sigma	P5493	Für die Molekularbiologie
Rekombinantes murines GM-CSF	Peprotech	315-03	>97%, von SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen und sichtbar durch Silberfärbung.
Rekombinante murine IL-4	Peprotech	214-14	>97%, durch SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen und sichtbar durch Silberfärbung.