Introduction
Bunların etki modları genellikle konvansiyonel biyokimyasal metodolojiler ile algılamak ve değerlendirmek zor olan düşük afinite etkileşimleri, tarafından tanımlanan çünkü zarı proteinleri kendi hücresel işlevlerini yerine hangi mekanizmaların anlaşılması genellikle zor bir görev olabilir. Zar proteinleri, ayrıca yüksek prensip bunların biyolojik aktivitesini 7 değiştirebilir spesifik membran etki 5,6 veya dinamik yüksek düzeyde yapılar oluşturma bölgesi zenginleştirilebilir.
Non-invaziv lazer yardımlı tek molekül floresan mikroskopi ve böylece kompleks hücresel ortamlarda protein davranışlarını incelemek için seçim metodolojisi haline gelmiştir. Bu prensip olarak gürültü azaltılmış Toplam İç Yansıma (TIRF) modunda izlenebilir gibi bu, özellikle plazma membranında meydana gelen biyokimyasal süreçler için de geçerlidir. İşte örnek aydınlatma cam su yakın 200 nm-ince dilim bir yukarı sınırlıdırflüoresan sinyal yoğunluğunun 8,9 önemli bir artış nedeniyle kaybolan uyarma ışık özelliklerine hücresel arka önemli bir kayıp ile sonuçlanır ve rface. Tek molekül tespiti yüksek pozisyonel ve temporal çözünürlük hedefleyen her iki yönü önemlidir.
Düzlemsel SLBs TIRF mikroskopi ile sadece uyumlu değildir. Uygun ligandlar ile işlevlendirilmektedir onlar ayrıca, bağışıklık hücrelerinin veya başka hücrelerden meydana gibi hücre-hücre tanıma moleküler dinamik okuyan doğrudan erişim sağlar. Ayrıca, sadece bu tür hücreler, son derece arzu edilir TIRF aydınlatma, görüntülü böylece cam slayt yakın hareketli ve aksi takdirde yıkanarak yapışmayan hücreler konumlandırmak için kullanılabilmektedir zaman tek bir molekül izleme veya tek molekül bazlı SuperResolution içeren iletim deneyleri. Bu amaçla proteinler, kolayca taşınabilir SLB üzerine yüklenmiş olması gerekir. Kullanılan li bir doğal avantajı PID'ler tüm proteinlerin herhangi bir spesifik olmayan bağlanma olduğu bulunmaktadır. Ayrıca, SLBs kendilerini iyileştirmeye içsel bir kapasiteye sahip iki boyutlu sıvı olarak kabul edilebilir; cam destek içindeki düzensizliklerin belli bir dereceye kadar telafi edilir. Bir adım aşamalı protokol ilgi konusu olan proteinlerin görevli yüksek hareketliliğe sahip iki katmanlı yapılar oluşturmak için temin edilmiştir. Düzlemsel SLBs oluşumu ana madde (90-99%) ve sentetik olarak 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfokolin (POPC) ihtiva eden, tarif edilen ve lipid, 1,2-dioleoil-işlevlendirilmektedir sn -glisero-3 - {[N- (5-amino-1-karboksipentil) iminodiasetik asit] süksinil} nikel tuzu az bulunan (% 1-10) 'de (EGM NTA-Ni). POPC bir doymuş yağ asidi ve bir mono-doymamış yağ asidi taşıyan ve hatta oda sıcaklığında yüksek akışkanlık lipit katmanlarını oluşturur. DGS NTA-Ni poli-histidin kuyruğuna onun baş grubu ile bağlanır ve seçim poli-histidin-etiketli proteinler (Şekil 1) için çapa görevi görür.
"> Önemlisi, mikroskopi donanım sağlanan bilgilerin ve optik ve lazer fiziği bazı temel bilgi ile, herhangi bir biyolog, tek bir molekül görüntüleme kurulumu inşa etmek mümkün olmalıdır. Aşağıda açıklanan çevre birimlerinin bir dizi içermelidir. Örnek uyarma ideal olmalıdır Toplam İç Yansıma (TIRF) modunda ters bir mikroskop üzerinde gerçekleştirilen bu rejim Bunun için özel bir TIRF yetenekli hedef (aşağıya bakınız). sahte ışık ve hücresel oto-floresan 9'dan aksi ortaya çıkan aşırı arka plan azaltır ve lazer aydınlatma gerektiği gibidir. Bazı deneyler milisaniye aralığında aydınlatma sürelerini gerektiren ve peş peşe ameliyat olacak. aydınlatma Zaman kazanmak için ya da iki veya daha fazla spektral kanal içine yayılan ışığı bölmek için genellikle yararlıdır tekrarlayan aydınlatma kaynaklanan gereksiz ağartma önlemek için. Bu eşzamanlı okuma sağlar zaman iletkenlik önemli bir faktör olabilir, iki veya daha fazla emisyon profilleri,Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) içeren ting deneyleri. Burada tek uyarılma ışık palsının ortaya çıkan emisyon hem FRET vericiden kaydedilir ve (sensitize emisyon olarak) kabul FRET edilebilir. Kamera aydınlatma süresi boyunca tek fluorophores görselleştirmek için yeterince düşük bir arka plan ile yeterli fotonları yakalamak gerekir. Bilgisayar yazılımı uyarma kapatılmasını ve görüntü alımı senkronize etmek görevin kadar gerekecektir. Kapsamlı bir bakış aşağıda Şekil 2'de verilmektedir:TIRF yetenekli hedefi: nesnel tabanlı TIRF aydınlatma için objektif sayısal açıklık (NA) eşit ya da standart cam slaytlar kullanarak 1.4 daha büyük olmalıdır (n = 1,515) 9. Büyütme 150X için 60x arasında değişebilir. Amacı, kromatik farklı florofor görüntülerken, belirli confocality izin vermek için düzeltilmelidir.
Lazerler: Mevcut Lase sayısır seçenekleri önemli ölçüde son yıllarda artmıştır. Modern elektronik modüle sürekli dalga diyot lazerler düşük maliyetli ve görülmemiş frekans ve hız ile çalıştırılabilir. Daha pahalı gaz iyon lazerleri Lazer ışın kalitesi excel, ancak soğutma dış kapatılmasını (aşağıya bakınız) ve genellikle geniş (Su) gerektirir.
Uyarma panjurlar: Acousto-optik modülatörler (AOM) peş peşe 10 hızlı kapatılmasını sağlar. Sıkı mekanik kepenkleri ile AOM kombinasyonunu kapatmak için tavsiye edilir. Nedeniyle sürekli ışık maruz kalma AOM Bu şekilde geniş ısıtma önlenir ve off-pozisyonunda AOM sızan ışığı iptal edilir.
Lensler lazer ışınları genişletmek ve objektif arka odak düzlemi üzerine onları odaklamak için kullanılır. Bu şekilde, uyarma ışık TIRF aydınlatma için gerekli olan bir paralel ışın (Şekil 3) gibi objektif bırakırörnek. Objektif çevresine merkezine arka odak düzlemi içinde odak noktası hareketli ışın hedefi bırakır hangi açısını değiştirmek, ancak bir işlev numune lazer nokta yeri (Şekil 3), değil ki olacak Genel ışın geometrisi. TIRF aydınlatma hedefi odak düzlemi içinde lazer odak noktasını çevirmek için bir periskop olarak işleyen aynalar bir dizi kullanarak ayarlanabilir kritik açıyla gelişir. Lensler kromatik olarak düzeltilmesi gerekmektedir ve iki ya da üç, bir dizi lens kullanılabilir. Üç mercek sistemi objektif (Şekil 4) arka odak düzlemi içine genişlemiş ışını odaklamak için lazer ışını (ve dolayısıyla numune de aydınlatma spot) ve üçüncü bir lensi genişletmek için bir teleskop gibi davranan iki lens oluşur. Her iki fonksiyon (teleskop ve odaklanma) Ayrıca sadece iki lens kombinasyonu ile elde edilebilir (Şekil 4).
Aynalar lazer ışığının kaybını önlemek için en az% 95 yansıtıcı olmalıdır. Iki ayna bir dizi genellikle düzenleme olarak uygulanır ve her bir ışın ayarı için hassas bir lazer ışınının bir açı ve konumunu ayarlamak için yeterlidir.
Dikroik kaplamaları yansıtır ve farklı belirtilen dalga boylarında ışık iletim ve üst üste ya da iki lazer ışınları bölmek için kullanılır.
Polychroic filtreler dikroik filtreleri daha karmaşıktır ve gelen uyarma ışık yansıtır ve numuneden emisyon ışığı çıkan iletmek için gereklidir. Bunlar objektif ve mikroskop tüp lens arasındaki filtre küp içerisine yerleştirilir.
Filtreleri temizleyin: Lazer employe d lazer türüne bağlı olarak bu lazer bırakır hemen sonra lazer ışınına konulmalıdır dar iletim bant genişliği filtreleri temizlemek.
Yivli filtreleretkin bir şekilde dar bantlı, lazer ışığı emer ve diğer ışık göndermek için tasarlanmıştır. Onlar herhangi bir sahte lazer ikaz ışığı süzmek için emisyon yolu içinde yerleştirilir. Ancak, çentik filtresi 0 ° gelen açıda sadece çalışır. Çentik filtresi bant genişliği çok keskin ise, farklı gelen açıları artık yansıtılmamış olabilir. Paralelleştirilmiş lazer lazer ışığının Engelleme etkilenmez, ama geri saçılan ışık verimli kamera ulaşmasını engellemiştir olmayabilir.
Rasyometrik bir ksenon veya cıva arklı bir lambayla önüne yerleştirilen, uygun filtreler tekerlekler ile donatılmış motorlu filtre tekerlekler kolay eksitasyon ve emisyon yolu içine yerleştirilir ve farklı ışık yoğunluklarında (ND filtrelerle donatılmıştır zaman) ya da flüoresan kanallar (arasında basit geçmesine izin edilebilir kalsiyum görüntüleme veya kamera önünde) yayan fluorofor için seçin.
50:50 küp ışın ayırıcı cBir, iki ayrı uyarma ışın yolları içine lazer ışınları bölmek için kullanılan ve aynı zamanda periskop önünde bunları birleştirmek.
Işın ayırıcı (emisyon yolu): fiziksel filtre değişiklikleri için herhangi bir ihtiyaç olmadan hızlı görüntü alımı için, emisyon ışını kaymıştır-mavi ve kırmızı-kaymıştır kanala ayrılmıştır. Prensip olarak, kiriş bölücülerin dikroik kama veya aynalar seti ve dalga uzunluğuna bağlı bir şekilde emisyon ışını ayrılması için bir dikroik ayna kullanılarak inşa edilebilir. İki emisyon filtreleri yayılan kanalları temizlemek için gereklidir.
Mekansal filtre: uyarma demetinin Mekansal filtreleme bazen düşük kaliteli lazer ışınları yayılan paralel olmayan ışık ışınlarını kaldırmak için gereklidir. Bir uzamsal filtre hem lenslerin odak noktasında tam yerleştirilen küçük bir iğne deliği ile iki lens teleskop oluşur. Lazer ışınının paralel olmayan bölümlerden elde edilen Bu şekilde, sahte ışığı randımanlı bir şekilde bloke olur. SuTIRF tabanlı mikroskobu kurarken ch koşulların karşılanması gerekir. Odak noktası haline ve ilk lens küçük odak uzunlukları ile konumlandırmak için daha zordur küçük iğne delikleri ile Mekansal filtreleme artar. Sapmayı kaynaklanan etkilerini azaltmak için bunun yerine basit lensler düşük büyütme (10x veya 20x) ile yüksek kaliteli ve sonsuzluk düzeltmeli mikroskop hedefleri istihdam avantajlıdır.
Periskop: Bir periskop kurulum hedefi, TIRF görüntüleme için bir ön koşul arka odak düzlemi içinde odaklanmış bir lazer ışını çevirmek gereklidir. Kolayca iki iki inç aynalar, ilk ayna ve genişledi ve mikroskop içine uyarma kiriş odaklı (Şekil 5) yansıtmak için ikinci ayna konumlandırmak için bir yazı ayarlamak için bir öteleme aşamada inşa edilebilir.
Kamera: Arka-aydınlatmalı Elektron-Çarpma Charge Coupled Devices (EMCCD) rutin kullanılırtek bir molekül sinyallerinin kaydı. Bunun nedeni yüksek kuantum verimliliği yüksek satın alma hızı, (% 95 kadar) (30 kadar MHz) ve nispeten düşük gürültü. -80 ° C kadar soğutma, termal gürültüyü azaltır ve mevcut EMCCD kameralar tarafından desteklenir. EMCCD teknolojisinin bir sınırlama kamera gürültü kamera kazancı hem de doğrusal artar ve sinyal esir olmasıdır. Bunun nedeni sCMOS çipin özel mimari de çok daha hızlı EMCCD kameralara göre önemli ölçüde daha az pahalı ve işletmek, bilimsel CMOS (sCMOS) kameralar, durum böyle değildir. Her piksel, farklı algılama hassasiyetini özellikleri nedeniyle Ancak CMOS teknolojisi ile ilgili bir sorun, o görüntü elde etme hala tek bir molekül düzeyinde bir nicel okuma bir dereceye yoksun olduğunu. Prensip olarak bu piksel normalleşme yoluyla telafi edilebilir, ancak bu prosedür 11 önemsiz hiçbir şekilde. Bu hala yeniden tereddüt nedentek molekül mikroskopi için sCMOS kameraları takdir, ancak bu teknolojinin hızla gelişmesi açısından, sCMOS kameraları yakında seçim kamera haline gelebilir. Yavaş tarama CCD kameralar kameralar hep birlikte büyütme ile ilgili gürültü ve piksel varyans önlemek ve onlar sözde 'kinetik' modunda çalıştırılabilir eğer hızlı alım hızları destekler. Bu modda faiz (ROI) bir bölge hariç tüm kamera çipi olarak mümkün bir depolama aygıtı olarak çip kendisi istihdam kılan maskelenir. YG ilk kez maruz sonra, ortaya çıkan masraflar görüntü daha ışığa maruz korunmaktadır piksel satır yonga piksel hattı, maskeli alana kaydırılır. Maskelenmiş bölgeye ROI tüm hatlar vites değiştirme (milisaniyenin aralığında) tamamlandıktan sonra, YG kendisini Bir sonraki pozlama için hazırdır. CCD çipi tüm piksel çizgileri tahsil edilinceye kadar bu döngü tekrarlanır. Çip sonra belirgin Kır ile yavaşça okunurCED okuma gürültü. Bir x 1300 piksel 1000 çip üzerinde, örneğin 50x50 piksel 20 ROI hızlı arkaya kaydedilebilir. Ve görüntüler okumak önce bir süre boyunca çip kalır, çünkü aşırı ısı gürültüsünü azaltmak için bir vasıta olarak (örneğin, sıvı azot ile birlikte), yüksek kaliteli maskeleme sağlamak ve kamera soğumaya önemlidir. Bazı EMCCD kameraları da kinetik modunu destekler.
Yazılım: lazerler, kepenk, AOMS ve kamera maruz zamanlaması yanı sıra uygun görüntü saklama başarılı bir görüntüleme deney ayrılmaz. Prensip olarak birçok tanımlanan işlemleri kamera ile gelen mevcut yazılım paketleri ile programlanabilir. Ticari yazılım paketleri biraz teknik knowhow ile uygulanabilir donanım aygıtları, çok sayıda destekler.
Darbe üreteci, Veri Toplama (DAQ) (analog ve dijital çıkış kanalları) yönetim kurulu ve osiloskop: Bir nabız jeneratörü olanmükemmel bir seçim belirlenen zaman ve gerilim darbeleri içine tetik darbeleri dönüştürmek. Bu şekilde lazerler tam çıkış gücü kontrollü ve alt milisaniyelik aralığında milisaniye içinde zaman aşımına edilebilir. Analog çıkışlar ile DAQ kurulları aynı ulaşmak ve kolayca PCI yuvaları aracılığıyla bilgisayarın anakart entegre edilmiştir. Darbe süresi, genlik ve frekans bir osiloskopla doğrulanır.
Tüm uyarma ışın yolunun Muhafaza: nedeniyle tüm uyarma ışın yolu kendi laboratuar ortamından eklenmelidir ürünün hava uyarım profilinde dalgalanmaları önlemek için. TIRF mikroskopi yaparken Bu önlem özellikle önemlidir. Optik bileşenler de toz ve lazer ışık maruz insan gözünün korunur. Kutular kolayca sanat tedarik mağazalarında satın alınabilir siyah karton, gelen inşa olabilir.
Photobleac sonra SLB Floresan Kurtarma akışkanlığını belirlemek içinHing (sıkı bağlamak) ölçümleri 12 yapılmaktadır. FRAP için iki uyarım ışın yolları varlığı (bakınız Şekil 3) tavsiye edilir. Birinci ışın yolu görüntü iki katmanlı floresan tasarlanmıştır. Bu TIRF konfigürasyonda ve düşük ışık yoğunluğu ile yapılabilir. Optik eksen boyunca hedefe bırakır, böylece ikinci ışın yolu, kısa ama yoğun çamaşır suyu darbe için izin vermeli ve non-TIRF modunda yapılandırılmalıdır. Yuvarlak diyafram uyarma ışın yoluna konabilir tanımlanmış kenarları ile mükemmel yuvarlak ağartma profili proje (Şekil 8). Görüntü için nesnenin düzlemi üzerine bu delik, optimum konumu (bakınız Şekil 3) mercek 3 odak düzlemi içinde olacaktır. Diyafram hafif kaymış pozisyonlarda yerleştirildiği zaman Ancak, bu lensin uzun odak uzunluğu, yeterli kalitede bir açıklık görüntü, ayrıca üretilebilir.
Gerçekleştirilen t yaptıktan sonraO ham veriler uygun analiz edilmelidir deney görüntülenmesi. Birkaç adım adım protokoller edinme ve verileri analiz, ana ayarlara (örn aydınlatma gücü ve zaman, TIRF açısı) ayarı kapsayan, hangi sunulmaktadır.
Protocol
1. üretilmesi ve Düzlemsel SLBs işlevselleştirilmesi
- Lipidlerin Karıştırma
- % 10 DGS NTA-Ni /% 90 POPC lipid kompozisyonu varmak için, bir 250 ml'lik yuvarlak tabanlı bir şişeye kloroform içinde POPC ya da 6.9 mg DGS NTA-Ni, 45 mg çözülür. Bir sonraki adımda bunu buharlaşması kloroform düşük (sadece birkaç ml) hacmi tutun. % 1 DGS NTA-Ni /% 99 POPC lipit kompozisyonu için 49.5 mg POPC ve 0.69 mg DGS NTA-Ni kullanın.
- Yavaş bir döner buharlaştırıcı kullanılarak kloroform çıkarın - ortam sıcaklığının üzerinde bir artış gerekli değildir. Alternatif olarak, azot veya argon gibi inert bir gaz akımı içinde kimyasal bir kaput içinde kapalı darbe. Bunu yaparken sürekli yuvarlak dipli alt yarısında kurutma lipid eşit birikimi sağlamak için şişeyi çevirin.
- Kloroform çoğunluğu buharlaştırılmıştır sonra, kantitatif kloroform kaldırmak için O / N vakum şişesi ekleyin.
NOT: Bu adım kirlenmesini önlemek için önemlidirdaha sonraki aşamalarda zehirli kloroform ile proteinlerin ve hücrelerin ve çift katlı lipid akışkanlığını sağlamak.
- Kurutuldu lipidlerden küçük tek lamelli vesiküller (SUV) üretilmesi
Not: küçük tek lamelli vesiküller (SUVler) çapı 20 nm ve 100 nm arasında ve hali hazırda banyosu sonikasyon ile üretilebilir. Lipid ekstrüzyon alternatif bir yöntem olup, ekstrüzyon için uygulanan filtre gözenek boyutuna bağlı olarak, SUV sebebiyet verebilir ve ayrıca büyük tek katmanlı veziküller (LUVler), boyut olarak 100 nm ila 1000 nm olan. Bununla birlikte, SUV SLBs oluşturulması için uygundur.- Banyo Sonikasyon yoluyla Arazi Aracı (videoda gösterildiği gibi):
- Gazsız PBS ile yıkandı. 10 ml yuvarlak tabanlı bir şişeye PBS gazı alınmış, 250 ml ile kurutuldu lipid karışımı süspanse edin.
- Örneğin nitrojen veya argon gibi eylemsiz bir gaz ile doldurmak şişesi bir tapa ile kapatın ve otoklav bant ile balon mühür.
- Banyo sonikatör içine kapalı şişeyi koyun ve lipid süspansiyon a sonikasyont 120 170 W açıkça döndü kadar. Bu 30 ila 60 dakika sürer.
- Vezikül oluşumu spectro-fotometrik ilerlemeyi izlemek: PBS kıyasla sulandırılmamış emülsiyon emilimi (lipid konsantrasyonu için yaklaşık bir göstergesi olarak) 234 nm sabit kalır henüz vadesi yoluyla azaltılmış ışık saçılması (550 nm de önemli ölçüde düşmesi gerektiğini doğmak Daha büyük parçacıklar).
- Bitişik SLB oluşumuna müdahale ağır olmayan tek lamelli veziküller, pelet için 288.000 x g'de, 4 ° C'de 8 saat boyunca daha sonra 25 ° C'de 1 saat boyunca 150,000 x g'de santrifüj ile vezikül süspansiyonunun pelet.
- 0.2 um bir gözenek çapı olan bir şırınga filtresinden süpernatanın filtre.
- Vezikül hazırlık netlik ve lipid solun miktarını izlemek için 234 nm ve 550 nm'de OD ölçün.
- Argon veya nitrojen atmosferi altında 4 ° C'de veziküller saklayın. İsteğe bağlı olarak, iki katmanlı vezikül hazırlanması için süspansiyon kullanmakaylarca.
- Lipid ekstrüzyon yoluyla SUV:
- Kısaca, 0.1 um bir gözenek boyutuna sahip bir filtre boyunca lipit bir süspansiyon birkaç kez geçer. Ne olursa olsun, imalat yöntemi iki kez, vezikül süspansiyonunun santrifüj (1h, 150,000g, 25 ° C, daha sonra 8 saat, 4 ° C, 288,000 g) ağır olmayan tek lamelli kesecikler: pelet.
Not: atıl gaz altında 4 ° C'de depolandığında, veziküller birkaç ay boyunca iki tabakalı hazırlanması için kullanılabilir.
- Kısaca, 0.1 um bir gözenek boyutuna sahip bir filtre boyunca lipit bir süspansiyon birkaç kez geçer. Ne olursa olsun, imalat yöntemi iki kez, vezikül süspansiyonunun santrifüj (1h, 150,000g, 25 ° C, daha sonra 8 saat, 4 ° C, 288,000 g) ağır olmayan tek lamelli kesecikler: pelet.
- Banyo Sonikasyon yoluyla Arazi Aracı (videoda gösterildiği gibi):
- Bir SLB Oluşumu ve protein ile şarj
- 30 dakika boyunca konsantre sülfürik asit 1 karışımı ve% 30 hidrojen peroksit: 3 ile 24 x 50 mm # 1,5 cam slaytlar tedavi edin.
NOT: videoda gösterildiği gibi karışımın saldırgan doğası nedeniyle özel dikkat, yani laboratuvar önlüğü ve koruyucu gözlük kullanın! - Bücür şişeden GKD 2 O akışı altında cam slaytlar durulayın. Teflon stand üzerinde yerleştirmek ve onları kurumaya bırakın10 ila 30 dakika karıştırılır.
- 8 ya da 16 kuyu odaları alt cam slayt çıkarın epoksi yapıştırıcı ile alt doldurun ve dikkatlice tutkal kaplı bölme altında bir temiz ve kuru bir cam slayt yerleştirin. Yaklaşık 10 dakika sertleştirmek tutkal olsun. Alttan Taşan tutkalı çıkarın.
Not: cam slayt ve bölme arasında sıkı bir sızdırmazlık da kolayca 10 ila 30 dakika içinde sertleşen diş, iki bileşenli silikon modelleme macunu, kullanımı ile elde edilebilir. Bu mühür epoksi yapıştırıcı gibi sağlam değil ama düzenli fiziksel zorlanma dayanıklıdır. Deney sonunda kolaylıkla gelecek deneylerde daha sonra tekrar kullanılabilir bölme, çıkarılabilir. - 8 (16), her kuyuya 10 kat PBS ile seyreltilmiş lipid süspansiyonu pipetle 120 ul (60μl) - 20 dakika boyunca ve izin iki katmanlı yapıda (yukarıda tarif edildiği gibi hazırlanmıştır), iyi odasının. Dikkatle 15 ml PBS ile iki kez bilayeri yıkayın. Iki tabakalı bir kere oluştu, bu her zaman tampon maddesi içinde daldırılmış olmalıdır ve havaya maruz olmadı. 330μl (8-kuyu odası) ya da 165μl (16 kuyu odacık) take off, sonra PBS ile her bir kuyunun tüm yol doldurun. De sol 350μl (175μl) vardır. Her bir oyuğa (400 ya da 200 ul nihai) PBS içinde seyreltilmiş His-etiketli proteinleri ihtiva eden kokteyl 50 ul (25 ul) ilave edilir ve karanlıkta 60 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. Yüzey proteini yoğunluğu Bu inkübasyon adımı sırasında protein konsantrasyonu değiştirilerek ayarlanabilir.
- 15 ml PBS ile her oyuk iki kez yıkayın.
Not: Genellikle, SLBs kendi protein ile doldurduktan sonra, artık, 6 saat daha deneylerde kullanılır. Bu süre boyunca, ışıkla ağartma sonra flüorofor kazanımı% 95'e kadar kalır ve iki tabakalı bir birleşik protein kaybı tespit edilebilir. Protein yoğunluğu (aşağıya bakınız) Deney öncesi belirlenmelidir. - İsteğe bağlı adım: CAB proteini ihtiva eden DGS NTA-Ni spesifik olmayan bağlanma test edilmesi için, PBS, 300 mM imidazol ihtiva eden bir kez SLB yıkayın. Profesyoneltein tamamen kapalı gelmelidir.
- 30 dakika boyunca konsantre sülfürik asit 1 karışımı ve% 30 hidrojen peroksit: 3 ile 24 x 50 mm # 1,5 cam slaytlar tedavi edin.
2. Mikroskop Kurulum
- Tek florokromların floresan saptayabilen bir mikroskop sistemi oluşturmak için giriş belirtilen tavsiyelere bakınız.
3. Güç Ölçümleri
NOT: Flüoroforlar kolayca aşırı ikaz ışığı ile doymuş olabilir. Bu salımında bir başka artış ile ışıkla ağartma hızlandırır ve dolayısıyla kaçınılmalıdır. Uyarma güç yoğunluğu numune doğrudan ölçülmelidir örnek aydınlatma optimize etmek. Bu tür ölçümler de gelecek deneyler için bir referans olarak hizmet verebilir. Işık görüntüleme sisteminde kayıp olduğu değerlendirilirken Ayrıca, giriş ve çıkış lazer güç arasındaki oranı bilerek yardımcı olur.
- Bir 90 ° açı objektif bırakır, böylece dik konuma getirin uyarma ışını taşıyın.
- Üst o güç metre başını yerleştirinkiriş f ve kiriş (= P) gücünü ölçün. Sonucu belgeleyin.
- Periskop kullanarak, TIRF konumu ve görüntü bozulmamış bir homojen floresan iki tabakalı olarak ışın açın. Nötr yoğunluk (ND) uyarma ışık yoluna 2 ila 3 arasında bir optik yoğunluk (OD) ile filtre beyazlatma ve CCD sinyali doygunluk yer önlemek için.
- Tüm ışıklı alanın entegre sayıları (= I toplam) ölçün. Ayrıca, ışıklı alanda (= toplam) boyutunu ölçmek. Entegre sayıları ölçün (= I Merkezi) maksimum ışıklı merkez nokta olarak spot boyutu (A merkezi =).
- Piksel başına arka plan sinyalini ölçmek (= B) ya aydınlatmalı alanının dışında ya da örnek aydınlatma olmadan.
- 3. ölçülen sonuçlar) arka plan sinyalini çıkarın. Arka plan ile soru (bütün ışıklı alanda veya merkez nokta) bölgenin piksel sayısı çarpılarak yapınpiksel başına sayar. (- Toplam .b ve merkezi - = I toplam A merkez .B).
- Böl entegre ve arka plan aydınlatma tüm alanın entegre ve arka plan düzeltilmiş sinyal ile merkez nokta sinyalini düzeltti.
NOT: Sonuç merkezi nokta (= (I merkezi - bir merkez .B) / (I toplam - Toplam .B)) içinde yer alan toplam güç fraksiyonu gösterir. Işık merkez nokta aydınlatıcı gücüne 2.) sonuçları ölçülen güç P Bu sonucun Çarpma. - Yerinde μm² bir merkez boyutunu belirleyin. Bu hedefin büyütmede mikron kamera piksel boyutunu bölmek için, piksel başına μm² olarak sonucun kare çekmek.
- Alternatif mikroskop üzerine yerleştirilen bir mikrometre slayt kullanımı ile görüntü içinde piksel boyutunu ölçmek ve piksel başına bir alan olarak sonucun kare çekmek. Multiply merkez nokta bulunan piksel sayısına göre bu değer aydınlatılan nokta alanına varmak için.
- Mikron 2 başına aydınlatma yoğunluğunu hesaplamak için μm², merkez nokta bir merkez boyutuna göre merkez nokta aydınlatıcı gücü P bölün. Bir örnek, Şekil 6'da verilmiştir.
- Olmayan TIRF aydınlatma ölçülen güç yoğunluğu değerleri de lazer ışığı tamamen yansıtılan edildiği tesisinin açısına bağlı olduğu TIRF aydınlatma 13 içinde mevcut olan, daha tipik olarak düşüktür. TIRF aydınlatma altında mevcut güç yoğunlukları varmak için, görüntü olmayan TIRF ve TIRF hem 0,1 mikron çaplı floresan boncuk kalibre. TIRF ve non-TIRF modunda ölçülen boncuk floresan yoğunlukları oranı TIRF aydınlatma (denklem 1) altında etkili olanlar içine ölçülen güç yoğunluğu değerlerinin dönüşüm sağlar dönüşüm faktörü C, tutarlar.
güç yoğunluğu TIRF = C • güç yoğunluğu olmayan TIRF (denklem 1)
C = boncuk yoğunluğu T IRF / boncuk yoğunluğu olmayan TIRF
4. Yoğunluk Ölçümleri
- Bir çift-katlı üzerinde bulunan bireysel fluorophores ortalama sinyal belirleyin. Floresan peptidler ile yüklü iki tabakalı bağlı MHC molekülleri protein beri bu amaç için idealdir: Etiket stoikiometri tam bir tanesidir. Gerekli ağartıcı tüm görüş alanında iki tabakalı üzerine etiket ve floresan tek fluorophores görselleştirmek için geri izin verirseniz.
- Peş peşe rekor görüntüleri (örneğin bir akış satın protokolü uygulanır) ve birkaç karelerin üzerine tek molekülleri hareketliliği izler. Daha fazla bilgi için Şekil 7'ye bakın.
- Sadece bu ROI içinde tek bir molekül ve toplu floresan belirleyin. Tek emiter bakış açısı yayılmış fonksiyonu% 99 veya daha fazla yakalamak için yeterince büyük bir ROI, sinyal entegre edin. 16-20 mikron piksel boyutuna sahip bir kamera kullanılarak zaman 100 kat büyütme ve eşit veya 1.45 daha büyük bir sayısal diyafram ile objektif, 7 piksel 7 bölgesini almak, (üreticinin kamera şartnamesinde belirtilen) Meydanın merkezinde bulunan yoğunluk zirve.
- Arka plan sinyalini belirlemek için, bir floresan sinyali içermeyen bir komşu 7 7 piksel kare sayılarını entegre. Tek bir molekülün flor için düzeltilmiş değerini belirlemek için tek bir molekül sinyalinden arka plan çıkarmaEscence. Hala şu çerçevede görülebilir tek sinyalleri seçin.
5. Test iki tabakalı Bütünlüğü
- Floresan çift tabakası hazırlamak ve yukarıda tarif edildiği gibi bir mikroskop sahne üzerine yerleştirin.
- Odağı ayarlamak ve TIRF modunda iki katmanlı bir görüntü alır. Küçük bir disk şeklindeki ROI içinde floresan baskılamak olmayan TIRF modunda kısa ama yoğun çamaşır suyu darbe uygulayın.
- Hemen beyazlatma sonrası düşük yoğunluklu TIRF modunda iki katmanlı bir görüntü çekin ve ardından her beş saniye on floresan kurtarma hızını izlemek için.
- Mobilayeri farklı bir alana ettik ve adım 2 ve 3 ağartma darbe sonrası düşük yoğunluklu TIRF modunda 5 dakika başka bir resim çekin izleyin. Ben çamaşır suyu alanında çamaşır suyu göndermek ve aşağıdaki gibi (IF) hareketsiz kısmını hesaplamak için (hiçbir ağartma meydana gelmiş olmalı) Deneyin başında I 0 ağartma öncesi yoğunluk karşılaştırın yoğunluğunu belirlemek:
Hareketsiz Kesir (%) = EĞER (I 0 - Ben çamaşır suyu sonrası) / (I 0 - arkaplan), 100 x
arka plan ile = no uyarma ışık ROI içinde ölçülen yoğunluk uygulanan
IF% 10'dan daha az (ideal olarak en az 5%) olmalıdır.
Representative Results
Tek bir molekül floresan mikroskopi sisteminin mimarisi Şekil 2'de oldukça ayrıntılı bir şekilde özetlenmiştir. Optik bileşenleri ve diğer donanım bileşenleri gibi bireysel parça giriş açıklanmıştır. TIRF ve non-TIRF aydınlatma için tanımlanmış bir şekilde doğuran optik uyarma ışın yolları, gösterilen ve 5 Şekil 3 açıklanmaktadır. Konumlandırılmış ilk periskop ayna önünde 50:50 ışın ayırıcı konumunu not Bir mikrometre çevrilebilir sahne (Şekil 5). Bu ışın ayırıcı (yeşil gösterilen) görüntüleme için kullanılan TIRF ışını ve (kırmızı ile gösterilmiştir) non-TIRF demeti (Şekil 3 'de belirtildiği gibi) ağartma ya da yerel diyafram tanımlanan ışık kaynaklı Örnek aktivasyonu için kullanılan üst üste. (Turuncu belirtilen Şekil 5) kombine ışık yolları ters MICR arka portuna ikinci periskop ayna aracılığıyla yansıtılırOscope. Şekil 4'te açıklanmış ve Şekil 2'de belirtildiği gibi, iki veya üç dışbükey lens uygulaması, lazer ışını profillerini genişler ve TIRF numune aydınlatıcı iki collimated kiriş yol vermek için objektif arka odak düzlemi üzerine lazer ışınları odaklanır ve sırasıyla olmayan TIRF.
Numune üzerine güç yoğunluğunu hesaplamak için gereken ölçülen yoğunluk değerleri için bir örnek, Şekil 6'da gösterilmiştir. Ortalama arka zemin sinyali (görüntüleme için kullanılan) ortaya çıkardı ve merkezi bölgesinde ölçülen yoğunlukları çıkarılır için, içindeki bir bölgede belirlenir lazer ışınının (burada 7089 sayımları) tarafından yanmıyor bakış, alanı. Işıklı (1684 sayımı) arka plan düzeltilmiş ortalama yoğunlukları ve merkezi alanı (4830 sayısı) daha sonra entegre yoğunlukları yol (1,471 vermek için gelen bölge boyutları ile çarpılırışıklı alan için x 10 8 sayar ve orta alan için 3,424 x 10 7 sayar). Merkez ve ışıklı bölgeler içinde entegre şiddetleri oranı orta alanı (0.23 veya% 23) aydınlatıcı genel gücün kısmını verir. Film de gösterildiği gibi, genel güç olmayan TIRF aydınlatma modunda güç ölçer kullanımı ile amaca belirlenmelidir. Örneğimizde böylece orta alanı içinde 5 mW x 0,23 = 1,15 mW bir güç sebebiyet veren, 5 mW ayarlanır. 1 mikron 2 örnekte 41,5 piksel miktarı bu yana, merkezi alanı 7089 piksel /41.5 piksel x um 2 = 170,8 mm 2 bir boyutu vardır. Bu alanda (170.8 mikron 2) merkez alan (1.15 mW) aydınlatan ışığın gücünü Bölme ortalama güç verirorta alanı içinde 0.7 kW / cm2 yoğunlukta.
Şekil 7 görüntü ve peş peşe edinilen tek fluorophores karşılık gelen yoğunluk sonuçlarını (10 milisaniye bir zaman çerçevesi yani saniyede 100 kare) sahiptir. Yoğunluk kantitatif için floresan sinyalini kapsayan yedi (= 49) piksel ile yedi dikdörtgen bölgenin ortalama sinyal, tespit edilir. Ayrıca arka plan ortalama sinyal tek bir molekül sinyalinin yakın yedi piksel yedi dikdörtgen bölge içinde tespit edilir. Background-düzeltilmiş ortalama sinyal (koyu renkli) tek bir molekül sinyaline yol açan bölgenin (= 49) içinde piksel sayısı ile çarpılır.
SLB-ilişkili olarak floresan-etiketli proteinler hareketliliğini değerlendirmek için tasarlanmış temsili bir sıkı bağlamak deneyi Şekil 8 'de gösterilmiştir. Şekil 8A'da repeti Not,genişletilmiş düşük yoğunluklu görüntüleme kiriş ve daha dar ve saniyenin tek kullanım tive kullanımı sıfır ikinci kez noktasında hızlı florokrom ablasyonu için yüksek yoğunluklu ışın diyafram tanımlanmış. Ağartıcı darbe öncesinde ilk ortalama yoğunluk değeri ile normalize edilmiş sarı daire içinde arka plan çıkarılır ortalama yoğunlukları, hız ve ölçüde floresan kurtuldu kaydetmek için zamana karşı Şekil 8B'de çizilir. Gösterildiği gibi, ilk iki katmanlı yoğunluğu (yeşil çizgi ile gösterilen),% 90'dan fazla florokrom ablasyon aşağıdaki 75 saniye içinde kurtarıldı. Bunun bir sonucu olarak gösterilen SLB içinde gömülü proteinlerin en az% 10 hareketsiz.
Bir SLB sisteminin 1. şematik anahat rakam. (A) SLBs POPC (90-99%) ve sentetik lipid DGS NTA-N yapılmıştıri (1-10%). Temiz bir cam yüzeyleri gelen lipidlerin oluşan SUV'lar ile şarj olduğunda Onlar kendiliğinden oluştururlar. (B) Bir kere oluştuktan sonra, bu SLBs kolayca ya bir C- ya da (12H oniki histidini içeren N-terminal etiketi için genişletilebilir çözünür proteinler ile dekore edilebilir örnek ko-stimülatör molekül B7-1 ve yapışma molekülü ICAM-1) veya protein dimerleri iki etiketler Örneğin bir αβMHC sınıf II dimer). için, her (2x6H altı histidini içeren genişletilmiş bu büyük halini görmek için tıklayınız rakam.
Şekil 2. uyarma ve emisyon ışın yolları bakış. Gaz iyon lazerleri (örn Ar + veya Kr +) akusto optik mo kullanımı ile hızlı kapatıldıktan nedeniyle ameliyat edilebilir dulators. Lazerler diyotlar birçok dalga boylarında günümüzde mevcuttur ve bunlar elektronik mikrosaniye-öfke modüle edilebilir mükemmel bir alternatif temsil etmektedir. Lazer ışınları kolayca iki (dikroik) aynalar ve bölünmüş ayarlanmış ve iki veya daha fazla ışın yolları yol vermek için basit kiriş bölücülerin kullanımı ile kombine edilebilir unutmayın. Bu örnekte bir TIRF görüntüleme ışın (olayları izlemek için) ve bir ağartıcı ışın (ağartma fluorophores veya birine fotoğrafın etkinleştirebilirsiniz bir açıklık tanımlı bir şekilde kafesli moleküller) kullanılır. Her iki uyarım yolları ek panjurlar kullanımı ile birbirinden bağımsız olarak çalıştırılabilir. Periskop numunenin TIRF aydınlatma oluşturmak için objektif arka odak düzlemi içinde odaklanmış lazer ışınları çevirmek için izin verir. Floresan görüntü spektral ultra-duyarlı kamera (örneğin EM-CCD veya bilimsel CMOS kamera) kullanımı ile alımı öncesinde bir emisyon ışın ayırıcı kullanımı ile ayrılabilir..com / files / ftp_upload / 53158 / 53158fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. objektif arka odak düzlemi içinde odaklanmış ışın çevirerek TIRF aydınlatma ayarlanması. Lazer ışınının odak noktası görüldüğü gibi kirişin translokasyonu yoluyla çevresine merkezine hedefi arka odak düzlemi içinde kaydırılır (a periskop aynası düzeneği kullanarak). Kritik açı toplam iç yansıma olur hangi ulaşana kadar bir sonucu olarak paralel bir ışın bir eğik aydınlatmada hedefi bırakır. Fani alan toplam yansıma oluşur cam medya arayüzü oluşturulur. Bu fi büyük halini görmek için tıklayınız şekil.
Şekil 4. Basit optik sistemler hedefi arka odak düzlemi içine lazer ışınını odaklamak için. Ya üç ya da iki lensler lazer ışını genişletmek ve TIRF objektif arka odak düzlemi üzerinde odaklanmak gerekmektedir. İki mercek sistemleri üç lens sistemleri daha az lens ile ilişkili hatalar içeren ve TIRF görüntüleme ışını üretmek için daha uygun olabilir. Tanımlanan kiriş genişleme ve keskin kenarlı bir aydınlatma nokta hedefleyen yaparken fotoğraf etkinleştirme veya -bleaching istihdam çalışmalar için gerekli olacak gibi üç lensler tercih olabilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
/53158fig5.jpg "/>
Şekil 5. floresan mikroskop arka ışın yolunun fotoğrafı Açıklamalı. Zaten kolayca iki uyarma kirişler, TIRF tane (yeşil belirtilen) non-TIRF modunda diğer uygulama Şekil 2 tek baston belirtildiği gibi (belirtilen kırmızı). Bu 50:50 ışın dağıtıcı (BS) kullanımı ile kaplanmış olur. Konveks lens (L1 ve L2) objektif arka odak düzlemi üzerine odaklanması için ilgili kirişler içine konumlandırılır (gösterilmemiştir). Iki ayna (M1 ve M2) oluşan bir periskop mikroskop girdiği bağlantı noktası üzerinden her iki kirişler yönlendirir. Birinci ayna (M + -1) TIRF pozisyona kirişlerin bir hareket ettirmek için (şekilde gösterildiği gibi bir mikrometre vida çevirerek) bir translasyon kademesi (TS) kullanımı ile hareket ettirilebilir. TIRF bir kez kurulduktan sonra, (buradan kırmızı ile gösterilmiştir foto-ağartıcı ya -activation için kullanılır) ikinci bir kiriş olmayan TIRF amacı terk bağımsız TIRF kirişin ayarlanabilirmod. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Aydınlatma spot merkezi alanı içinde güç Ölçme Şekil 6.. Arka plan yansıtan ilgi uygun bölgeleri seçtik belirtildiği gibi, tüm ışıklı alan (IA) ve olaylar daha sonra kaydedilecektir merkezi alanı (CA). IA ve CA için kaydedilen bu arka plan değerlerini çıkarma ve her alanda (= entegre şiddetler) içinde bulunan piksel sayısı ile düzeltilmiş ortalama yoğunlukları çarpılması suretiyle yoğunluklarını entegre. (:% 23 bu örnekte) CA aydınlatıcı ışın gücü oranında varmak IA o kadar CA entegre yoğunluğu bölün. Burada genel ışın gücü (çarpılarak CA aydınlatan ışığın gücünü belirleyin: 5 m0.23): Burada CA (aydınlatan oranda W). (1 / 41.5 mikron 2 piksel -1 burada) bir piksel için alanda boyutu dönüşüm faktörü: (7089 piksel burada) alanı çarpın merkezi alanının boyutunu belirlemek için. CA boyutuna göre: (1.15 mW burada) gücünü bölmek, CA aydınlatma ikaz ışığı ortalama güç yoğunluğu gelmesi. (Burada: 170.8 mikron 2) Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Tek bir molekül sinyallerinin Şekil 7. kantitasyonu. (A) SLB tek fluorophores Time kursu. Faiz (roi, sarı) A 7 x 7 piksel büyüklüğünde bölge kantitatif için sinyal etrafına yerleştirilir. Arka plan, komşu bir 7 x 7 piksel tespit edilirroi (yeşil). (B) nicel ortalama piksel yoğunlukları listelenir. Tek bir molekül sinyalini belirlemek için, arka plan değerleri (yeşil roi), bir fluorofor Tek molekül yoğunlukları zaman bazlı grafiği çizdirilir sinyal değerleri (sarı ROI) çıkarıldı ve 49 (C) çarpılır. Fluorofor ağartma işleminde olduğu gibi 90 msn zaman nokta ihmal olduğunu unutmayın. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
SLB bütünlüğünü belirlemek için (sıkı bağlamak) analizi Photobleaching sonra 8. Floresan Kurtarma Şekil. (A) sıkı bağlamak deney her 10 bir resim gösterilir IEK / MCC-Alexa Fluor 647 taşıyan bir çift-katlı uygulandı. De gösterilen deneyde (B) FRAP kantitasyonu (A). Değerler ağartma önceki başlangıç yoğunluğu (I o) bölü (A) 'da gösterilen san bir ROI içinde ortalama yoğunlukları (I)' e işaret eder. Kırmızı veri noktaları (A) görüntülenir, yeşil hat orijinal şiddetleri 0.9 kurtarma gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Discussion
Tek molekül mikroskopi kendi ana hücresel ortamda proteinlerin davranışlarını incelemek için eşsiz bir fırsat sunuyor. Moleküler görüntüleme geniş bir bilimsel topluluk, bu nedenle giderek daha çekici hale, henüz birçok hayat bilim adamları hala uzak teknoloji ve uzmanlık ilk yatırım çekiniyorlar. Kişinin kendi görüntüleme sistemi montaj kaynaklanan ana parası hali hazırda kimsenin belli bir ihtiyaca göre ayarlanabilir olmasıdır.
Bu tarifnamede belirtildiği gibi olmayan bir TIRF uyarma ışın kolayca varolan TIRF ışık yolu ek olarak uygulanabilir, floroforlar ve ligandların, hızlı ve tanımlanan foto-ağartıcı (veya -activation) arzu edildiği takdirde, örneğin gerçekleştirilmesi sıkı bağlamak veya ligand uncaging deneyler 14 . Emisyon ışın ayırıcı giriş en az iki eş zamanlı kayıt ve dört flüoresan kanalı bazı durumlarda sağlar. Uzantılarının listesi sadece sınırlı özündeKişinin kendi hayal.
Örneğin, emisyon yolunda bir motorlu emisyon filtresi tekerlek uygulanması kadar on farklı floresan kanallar arasında hızlı geçiş için izin verir. İki motorlu emisyon filtre tekerlekleri birleştiren zaman 18 floresan kanalı okunabilir, seri olarak (her 10 filtre yuvaları ile donatılmış). TIRF tabanlı görüntüleme kalsiyum mobilizasyonu ölçümleri ve Xenon veya Mercury uyarma lamba yolunun entegrasyonundan sonra Girişim Yansıma Mikroskobu (IRM) ile tamamlanabilir. IRM hücreleri cam yüzeyinde veya SLB bağlıdır ve TIRF tabanlı görüntüleme verileri yorumlanırken dolayısıyla kritik bilgi verebilir hangi dereceye görselleştirmek için tercih edilen bir yöntemdir. Basit bir dikroik ayna kullanımı ve fotoaktivasyon yerelleştirme mikroskobu (PALM) ya da stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (STORM) iletken veriyor nm 405 ek lazer, yani iki superresolut ile genişletilmiş uyarım ışını KurulmasıGörünür ışık 15,16 kırılma sınırının altında bir konumsal doğruluk ile iyon metodolojileri.
Ancak, deneysel başarı sadece uygun donanım meselesi. Gürültü azaltılmış TIRF tabanlı görüntüleme tam olarak yararlanabilmek için, hücreler, hücre yüzeyinde kısıtlamalar empoze veya plazma zarı fizyolojisi müdahale etmeyen bir moda bir yüzeye temas etmelidir. SLBs Tüm SLB gömülü ligandlar yanal olarak mobil olması ve bağlayıcı ve ayırma dinamikleri reseptör yanıt olarak çift-katlı olan yanal konumunu ayarlamak için hücre yapışması için uygun proteinler, bu amaç için uygundur aştığını ile işlevlendirilmektedir.
Tekrarlanabilir bir şekilde SLBs üretmek için, yüksek saflıkta SUV'lar ile başlamak en iyisidir. Burada tarif edildiği gibi, bu, i, iki Ultrasantrifügasyon adımda da sonikasyon sırasında üretilen çok katmanlı veziküller kaldırmak, böylece kritikYüksek akışkanlık özelliğine sahip, bitişik SLBs oluşumu ile nterfere. Sadece temiz cam yüzeyler üzerinde yüksek kaliteli formunun SLBs. Bir kez temizlenmiş cam slaytlar hemen kullanılabilir veya vakumla saklanmalıdır. Önemlisi, SLBs onların bozulmasına yol açacak bu kadar havaya maruz asla kullanılmamalıdır. SLB Yıkama bu için değil, zaman tasarrufu prosedürü sadece olarak, tampon serolojik bir pipet kullanımı ile durulama, gösterildiği gibi, içerir.
SLB yerleşik proteinlerin toplanması ve saflaştırılması sırasında, deterjan kullanımından kaçınılmalıdır. Bu deterjan bile mevcut eser miktarlarda önemli ölçüde protein hareketlilik azaltacaktır çünkü. Hep birlikte deterjan ihtiyacını aşmak için, salgılanabilir polihistidin etiketi donatılmış ligandların çözünür ifadesi, memeli veya böcek hücrelerine tavsiye edilir. E. coli katma gövdelerinden yeniden katlama gerekli ise, dikkatli bunların olmayan ve tekrar katlama önce, enklüzyon gövdelerinden elde etkili bir madde deterjanların aynlması için uygulanması gereken.
Özellikle hücre aktivasyonu ve hücre yapışması için, belirli bir reseptör-ligand etkileşiminin rol incelemek için sağlar, modüler ve reconstitutive doğadan SLBs sonuçları kullanılarak önemli bir avantaj sağlar. Bu bağlamda, DGS NTA-Ni NTA-NI bağlanma bölgeleri için rekabet proteinleri önlemek amacıyla SLB içinde% 10 mevcut olmalıdır belirtmeyi önemlidir. % 1 veya% 2 DGS NTA-Ni, belirli bir polihistidin-etiketli protein türlerinin birlikte bir azalma barındıran SLBs kullanıldığı zaman yayınlanmamış (özellikle ikinci bir polihistidin etiketli protein türlerinin artan miktarları birlikte inkübe edilmesi zaman fark edilebilir gözlem). % 10 DGS NTA-Ni içeren SLBs çalışırken bu olgu gözlenmemiştir.
Biz DGS NTA-Ni ihtiva eden SLBs test herhangi bir polihistidin-etiketli proteinin spesifik olmayan bağlanma gözlenmiştir hiç birlikte ilk kez bir protein uygulandığında, bu olasılık test edilmelidirBu amaçla biz DGS NTA-Ni (protein bağlamak gerekir) yoksun SLBs kullanmanızı tavsiye ederiz. DGS NTA-Ni içeren bir SLB kullanırken İkincisi, protein PBS 300 mM imidazol içeren SLB yıkadıktan sonra tamamen kapalı gelmelidir.
SLBs kullanıldığı bir diğer önemli avantajı, geçici etkileşimleri ve sinyal olayları geliştirilmiş uzaysal çözünürlük 17-19 ile izlenebilir olmasıdır. Üç boyutlu bir bağlama işlemi, esasen özellikle gürültü zayıflatılmış TIRF modunda kayıt olduğunda, iki görüntüleme boyutlarına azalır, çünkü bu, en azından kısmen bir. SLBs kullanımı tek bir molekül sinyal tespiti, fotoğraf aktive yerelleştirme mikroskobu (PALM) ya da stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (STORM) için bir önkoşul, kırınım sınırının 15,16 altında bir çözünürlüğe sahip yani superresolution mikroskobu ile uyumludur. Bu özel görüntüleme yöntemleri tek bir molekül Förster Rezonans Enerji Tra etkinleştirinnsfer deneyler sinaptik ortamda 20 bireysel protein-protein etkileşimlerini görselleştirmek için tasarlanmıştır. Bu yaklaşım, "Measuring TCR-pMHC FRET tabanlı mikroskopi analizi kullanılarak bağlanma" 21 olarak adlandırılan bir jove yayında oldukça ayrıntılı bir şekilde açıklanmıştır.
SLB-tabanlı deneyler yorumlarken bir zaman canlı bir hücrenin plazma zarının tüm özellikleri SLBs tarafından yer veriliyor tutmalı ve eksik nitelikleri bazı soruşturma altında fizyolojisini etkileyebilir söyledi. Sonuçta, SLB-gömülü proteinler serbestçe difüzyon ve hücresel meslektaşları çoğu 5,6,22 gibi membran mikro organize edilmez. Bir dereceye kadar canlı hücrelerin plazma zarı mimarisini muhafaza yapışık hücreler türetilen İmmobilize plazma zarı levhalar, başarılı bir şekilde B-lenfositleri 23 membran gömülü antijenlerden alımını incelemek için kullanılmıştır. Bununla birlikte bu gibimembranlar son derece dinamik bir iskeleti ile etkileşim ve sert cam yüzeyin tarafından desteklenen hiçbir esneklik özelliği yoktur. Bu tutarsızlıkların ışığında ayarlanabilir esneklik yüzeyleri veya lokal olarak uygulanan ışık darbeleri yanıt olarak kendi katılık değiştirmek yüzeyleri tarafından desteklenen bir tanımlanmış moda proteinleri bölümlere yollarını sunmak ve mühendislik SLBs, ihtiyaç açıkça vardır.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali ilgi var olduğunu beyan ederiz.
Acknowledgments
MA mali ve idari destek Avusturya Bilim Fonu'nun (FWF, J3086-B11) ve bir teşekkür Schrödinger bursu Max-Planck-Toplum tarafından desteklenmiştir. GS Viyana Bilim ve Teknoloji Fonu (WWTF, LS13-030) tarafından desteklenmiştir. JH Viyana Bilim ve Teknoloji Fonu (WWTF, LS14-031) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #1.5 glass slides | VWR | 631-0853 | |
| 250ml round bottom flask | VWR | 201-1357 | |
| 50:50 beam splitter cubes | Thorlabs | BS013 | |
| Acousto-opitcal modulator C1205-2 | Isomet | - | only necessary if CW lasers, which cannot be modulated, are used |
| Alexa Fluor 488-NHS | Life technologies | A-20000 | |
| Alexa Fluor 555-NHS | Life technologies | A-20009 | |
| Alexa Fluor 647-NHS | Life technologies | A-20006 | |
| autoclave tape | VWR | 489-1312 | or any other heat-stable sticky tabe |
| Avanti Mini-Extruder | Avanti Lipids | 610000 | alternative to the bath sonicator |
| bath sonicator QSONICA Q700 | QSONICA | Q700 | |
| beam splitter | Cairn | P280/210/MLS | |
| Büchi rotary evaporator | VWR | 531-0837 | |
| camera | Andor | iXon Ultra 897 | see manuscript text for alternatives |
| concentarted hydrogenperoxide | Roth | 9683.1 | |
| concentrated sulfuric acid | Roth | X944.2 | |
| epoxy glue | Uhu | 45705 | Uhu plus sofortfest 2min |
| filter wheel | Sutter instruments | Lambda 10-2 | |
| LabTek chambers | VWR | 734-2062 | |
| laser | Toptica | - | different variants (wavelengths 375 - 785 nm) are available |
| lens | Thorlabs, Newport | - | |
| DGS NTA-Ni (lipid) | Avanti Lipids | 790404C | already in Choroform-solved delivered version of the nicekl salt variant is recommended |
| POPC (lipid) | Avanti Lipids | 850457C | already in Choroform-solved delivered version is recommended |
| microscope Zeiss Axiovert 200 | Zeiss | - | |
| mirrors | Thorlabs | BB1-E02 | |
| optical filters | AHF, Chroma, Semrock | - | filter sets are available for many different combinations of dyes |
| oscilloscope | BK Precision | 2120C | |
| phosphate buffered saline (PBS) | Life technologies | 14190-136 | degas before usage |
| periscope | Thorlabs | RS99/M | |
| picodent twinsil 22 | Picodent | 13001000 | alternative to the epoxy glue |
| power meter Lasermate-Q | Coherent | - | any powermeter sensitive in the used spectral range will do |
| pulse generator | Stanford Research Systems | SRS DG535 | |
| spatial filter | Thorlabs | KT310/M | |
| syringe filter 0.2µm | Millipore | GVWP04700 | |
| TIRF-capable apochromat objective 100x, NA 1.46 | Zeiss | 440782-9800-000 | |
| trichloromethane/chloroform | Roth | 3313.1 | |
| tubes forultracentrifugation polycarbonate 1.00 mm, 11 mm x 32 mm | Thermo Fisher | 45237 | |
| Sorvall ultracentrifuge | Thermo Fisher | RC M150GX | |
| ultracentrifuge rotor | Thermo Fisher | S120-AT2 | |
| UV spectrophotometer Nanodrop 2000c | Thermo Fisher | - | |
| vacuum pump | VWR | 181-0248 |
References
- Walter, N. G., Huang, C. Y., Manzo, A. J., Sobhy, M. A. Do-it-yourself guide: how to use the modern single-molecule toolkit. Nat Methods. 5, 475-489 (2008).
- Sahl, S. J., Moerner, W. E. Super-resolution fluorescence imaging with single molecules. Current opinion in structural biology. 23, 778-787 (2013).
- Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. T cell receptor-proximal signals are sustained in peripheral microclusters and terminated in the central supramolecular activation cluster. Immunity. 25, 117-127 (2006).
- Kaizuka, Y., Douglass, A. D., Varma, R., Dustin, M. L., Vale, R. D. Mechanisms for segregating T cell receptor and adhesion molecules during immunological synapse formation in Jurkat T cells. Proc Natl Acad Sci U.S.A.. 104, 20296-20301 (2007).
- Wilson, B. S., Pfeiffer, J. R., Surviladze, Z., Gaudet, E. A., Oliver, J. M. High resolution mapping of mast cell membranes reveals primary and secondary domains of Fc(epsilon)RI and LAT. The Journal of cell biology. 154, 645-658 (2001).
- Lillemeier, B. F. TCR and Lat are expressed on separate protein islands on T cell membranes and concatenate during activation. Nat Immunol. 11, 90-96 (2010).
- Woof, J. M., Burton, D. R. Human antibody-Fc receptor interactions illuminated by crystal structures. Nature reviews. Immunology. 4, 89-99 (2004).
- Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. The Journal of cell biology. 89, 141-145 (1981).
- Axelrod, D. Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods in cell biology. 89, 169-221 (2008).
- Wieser, S., Moertelmaier, M., Fuertbauer, E., Stockinger, H., Schutz, G. J. (Un)confined diffusion of CD59 in the plasma membrane determined by high-resolution single molecule microscopy. Biophys J. 92, 3719-3728 (2007).
- Huang, F. Video-rate nanoscopy using sCMOS camera-specific single-molecule localization algorithms. Nat Methods. 10, 653-658 (2013).
- Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophys J. 16, 1055-1069 (1976).
- Axelrod, D., Burghardt, T. P., Thompson, N. L.
- Huse, M., Quann, E. J., Shouts Davis, M. M. Whispers and the kiss of death: directional secretion in T cells. Nat Immunol. 9, 1105-1111 (2008).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3, 793-795 (2006).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285, 221-227 (1999).
- Bunnell, S. C. T cell receptor ligation induces the formation of dynamically regulated signaling assemblies. J Cell Biol. 158, 1263-1275 (2002).
- Sherman, E. Functional nanoscale organization of signaling molecules downstream of the T cell antigen receptor. Immunity. 35, 705-720 (2011).
- Huppa, J. B., et al. TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity. Nature. 463, 963-967 (2010).
- Axmann, M., Schuetz, G. J., Huppa, J. B. Measuring TCR-pMHC binding using a FRET-based microscopy assay. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
- Lillemeier, B. F., Schuetz, G. J., Pfeiffer, J. R., Surviladze, Z., Wilson, B. S., Davis, M. M. Plasma membrane-associated proteins are clustered into islands attached to the cytoskeleton. Proc Natl Acad Sci U.S.A.. 103, 18992-18997 (2006).
- Natkanski, E., et al. B cells use mechanical energy to discriminate antigen affinities. Science. 340, 1587-1590 (2013).
