Einzelmolekülfluoreszenzmikroskopie auf Planar Unterstützte Bilayers

Zusammenfassung

Die Herstellung von proteinfunktionalisierten planaren glasgestützten Lipiddoppelschichten, die Bestimmung der Proteinmobilität innerhalb und die Messung von Proteindichten wird hier gezeigt. Es wird eine Roadmap zum Bau eines rauschreduzierten Totalreflexionsmikroskops skizziert, das die Visualisierung von in einzelnen Doppelschichten residenten Fluorochromen mit hoher raumzeitlicher Auflösung ermöglicht.

Zusammenfassung

Im Laufe eines einzigen Jahrzehnts hat sich die Einzelmolekülmikroskopie von einer abgelegenen Domäne, die nur von Physikern mit einem starken Hintergrund in Optik und Laserphysik geteilt wird, zu einer Disziplin gewandelt, die jetzt lebhafte Aufmerksamkeit von Lebenswissenschaftlern aller Art genießt ¹. Dies liegt daran, dass die Einzelmolekül-Bildgebung das einzigartige Potenzial hat, das Verhalten von Proteinen in situ in lebenden Zellen aufzudecken und die zelluläre Organisation mit einer noch nie dagewesenen Auflösung unterhalb der Beugungsgrenze des sichtbaren Lichts ^{aufzudecken 2}. Glasgestützte planare Lipiddoppelschichten (SLBs) sind ein leistungsfähiges Werkzeug, um Zellen, die sonst in Suspension wachsen, nahe genug an den Objektträger zu bringen, so dass sie im rauschreduzierten Total Internal Reflection-Beleuchtungsmodus ^3,4 problemlos abgebildet werden können. Sie sind sehr nützlich, um die Proteindynamik bei Plasmamembran-assoziierten Ereignissen zu untersuchen, die so unterschiedlich sind wie Zell-Zell-Kontaktbildung, Endozytose, Exozytose und Immunerkennung. Es werden einfache Verfahren vorgestellt, wie hochmobile proteinfunktionalisierte SLBs reproduzierbar erzeugt werden können, wie die Proteinmobilität innerhalb des Proteins bestimmt werden kann und wie Proteindichten mit Hilfe der Einzelmoleküldetektion gemessen werden können. Es wird gezeigt, wie man ein kosteneffizientes Einzelmolekül-Mikroskopiesystem mit TIRF-Beleuchtungsfähigkeit konstruiert und wie es im Experiment bedient wird.

Einleitung

Das Verständnis der Mechanismen, durch die Membranproteine ​​ihre zellulären Funktion erfüllen kann oft eine schwierige Aufgabe sein, weil ihre Wirkungsweisen werden häufig durch eine geringe Affinitätswechselwirkungen, die nur schwer zu erfassen und auszuwerten durch herkömmliche biochemische Methoden, definiert. Membranproteine ​​können weiterhin stark in speziellen Membrandomänen ^5,6 oder bilden dynamische Strukturen höherer Ordnung, die grundsätzlich verändern können ihre biologische Aktivität ⁷ angereichert werden.

Nicht-invasive lasergestützte Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie ist damit zu Methodik der Wahl, um Protein-Verhalten in komplexen zellulären Umgebungen zu studieren. Dies gilt insbesondere für biochemische Prozesse, die an der Plasmamembran, da diese im Prinzip in geräuschreduzierten Total Internal Reflection (TIRF) Modus überwacht werden. Hier Probenbeleuchtung ist mit einem bis zu 200 nm-dünne Scheibe in unmittelbarer Nähe zu einem Glas su eingeschränktrface, die zu einem erheblichen Verlust der zellulären Hintergrund ergibt, und aufgrund der Eigenschaften des abklingenden Anregungslicht auch zu einem deutlichen Anstieg in der Fluoreszenzsignalintensität ^8,9. Beide Aspekte sind wichtig, wenn mit dem Ziel für eine hohe Positions und zeitlicher Auflösung in Einzelmoleküldetektion.

Planar SLBs sind nicht nur mit TIRF-Mikroskopie kompatibel. Wenn mit geeigneten Liganden funktionalisiert sie bieten auch einen direkten Zugang zum Studium der molekularen Dynamik von Zell-Zell-Erkennung, wie sie in Immunzellen oder anderen Zellen auftreten. Sie kann aber auch einfach verwendet werden, um bewegliche und ansonsten nicht-adhärenten Zellen nahe genug an dem Glasträger zu positionieren, dass solche Zellen in TIRF-Beleuchtung, was sehr wünschenswert ist abgebildet werden, wenn Leitungsversuche mit einzelnen Moleküls Verfolgung oder Einzelmolekül-basierten Superauflösung. Zu diesem Zweck Proteine ​​haben, auf eine hochmobile SLB geladen werden. Ein inhärenter Vorteil der verwendeten li PIDs, daß es keine unspezifische Bindung von Proteinen an allen. Darüber hinaus kann SLBs als zweidimensionale Flüssigkeiten mit einer inhärenten Fähigkeit, sich selbst zu heilen betrachtet werden; Unregelmäßigkeiten im Glasträger sind bis zu einem gewissen Grad ausgeglichen. Ein Schritt-Schritt-Protokoll vorgesehen ist, um hochmobilen Doppelschichten mit Proteinen von Interesse berechnet generieren. Die Bildung von planaren SLBs beschrieben, die 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-Phosphocholin (POPC) als Hauptbestandteil (90-99%) und der synthetischen, und funktionalisierte Lipid 1,2-Dioleoyl sn-glycero-3 - {[N (5-Amino-1-carboxypentyl) iminodiessigsäure] succinyl} Nickelsalz (DGS NTA-Ni) in geringer Menge (1-10%). POPC trägt eine gesättigte Fettsäure und eines monoungesättigten Fettsäure und bildet Lipiddoppelschichten mit hoher Fließfähigkeit, selbst bei RT. DGS NTA-Ni bindet mit seiner Kopfgruppe um Polyhistidin-Schwanz und dient als Anker für die poly-Histidin-markierte Proteine ​​der Wahl (Abbildung 1).

"> Wichtig ist, muss der Mikroskopie-Hardware eine Reihe von Peripheriegeräten, die unten beschrieben werden, umfassen. Mit der zur Verfügung gestellten Informationen und einige Grundkenntnisse in der Optik und Laserphysik, sollte jeder Biologe in der Lage, ein einzelnes Molekül Imaging-Setup zu bauen. Probenanregung sollte idealerweise sein, auf einem inversen Mikroskop in Total Internal Reflection (TIRF) Modus durchgeführt, wie diese Therapie reduziert Streulicht und übermässigem sonst infolge zelluläre Autofluoreszenz ^9. Hierzu wird eine spezielle TIRF fähiges Ziel (siehe unten) und Laserbeleuchtung benötigt werden. Einige Experimente werden Belichtungszeiten im Millisekundenbereich erfordern und schnell hintereinander betrieben werden. Zur Beleuchtung Zeit zu sparen oder um unnötige Bleich durch wiederholte Beleuchtung ist es oft hilfreich, um das emittierte Licht in zwei oder mehrere spektrale Kanäle aufgeteilt zu vermeiden. Dies ermöglicht gleichzeitige Auslesen aus zwei oder mehr Emissionsprofile, die ein wichtiger Faktor, wenn CondUC werden kannting Experimenten mit Förster Resonance Energy Transfer (FRET). Hier die Emission von einzelnen Anregungslichtpuls resultieren, können beide von der FRET-Donor aufgezeichnet und FRET-Akzeptor (wie sensibilisierten Emission). Die Kamera sollte genug Photonen mit ausreichend niedrigen Hintergrund zu erfassen, um einzelne Fluorophore während der Beleuchtungszeit zu visualisieren. Computer-Software müssen bis zur Aufgabe der Anregung Schließung und Bildaufnahme zu synchronisieren. Ein umfassender Überblick wird unten und in Abbildung 2 angegeben:

TIRF-fähigen Ziel: Für zielorientierten TIRF-Beleuchtung die numerische Apertur (NA) des Objektivs muss gleich oder größer als 1,4 unter Verwendung von Standard-Glasobjektträger sein (n = 1.515) ^9. Vergrößerung zwischen 60x bis hin zu 150x. Das Ziel sollte chromatisch korrigiert werden, um Konfokalität bei der Abbildung unterschiedlicher Fluorophore zu ermöglichen.

Laser: Die Anzahl der verfügbaren laser Möglichkeiten hat sich in den letzten Jahren stark zugenommen. Moderne elektronisch modulierbaren Dauerstrichdiodenlaser sind kostengünstig und kann mit noch nie da gewesenen Frequenz und Geschwindigkeit betrieben werden. Teurer Gasionenlaser zeichnen sich durch Laserstrahl Qualität, benötigen aber externe Schließung (siehe unten) und oft umfangreiche (Wasser-) Kühlung.

Anregungsläden: akustisch-optische Modulatoren (AOM) ermöglichen eine schnelle Schließung in schneller Folge ^10. Für enge schloss die Kombination aus einem AOM mit mechanischer Rollläden wird empfohlen. Auf diese Weise starke Aufheizung des AOM aufgrund der kontinuierlichen Belichtung vermieden und austretendes Licht aus dem AOM in der Aus-Stellung aufgehoben ist.

Linsen werden verwendet, um Laserstrahlen zu erweitern und um sie auf der hinteren Brennebene des Objektivs fokussieren. Auf diese Weise, das Ziel als ein paralleler Strahl (3), die für die TIRF Beleuchtung erforderlich ist verlässt das Anregungslichtdie Probe. Bewegen des Brennpunkts in der hinteren Brennebene von der Mitte zu der Peripherie des Ziels der Winkel, unter dem der Strahl das Ziel verläßt, nicht jedoch für die Position des Laserflecks auf der Probe (3), die eine Funktion ist des Gesamtstrahlgeometrie. TIRF-Beleuchtung erfolgt bei einem kritischen Winkel, die mit einem Satz von Spiegeln, die als ein Periskop, um den Brennpunkt des Lasers innerhalb der Brennebene des Objektivs zu übersetzen angepasst werden kann. Linsen sollten chromatisch korrigiert werden und kann in einer Reihe von zwei oder drei Linsen verwendet werden. Ein Drei-Linsensystem besteht aus zwei als Teleskop, um den Laserstrahl (und daher der Beleuchtungsfleck auf der Probe) und einer dritten Linse zu erweitern, um den verbreiterten Strahl in der hinteren Brennebene des Objektivs (4) orientiert handeln Linsen. Beide Funktionen (Teleskop und Fokussieren) kann auch durch eine Kombination von nur zwei Linsen erreicht werden (siehe Abbildung 4).

"jove_content"> Spiegel sollten mindestens 95% reflektierend sein, um den Verlust von Laserlicht zu vermeiden. Für jeden Strahl Einstellung ein Satz von zwei Spiegeln ist in der Regel als solche Anordnung angewendet ist ausreichend präzise jeden Winkel und jede Position des Laserstrahls einzustellen.

Dichroic Overlays reflektieren und Licht unterschiedlicher Wellenlängen festgelegt und werden verwendet, um zu überlagern oder teilen Sie die Strahlen aus zwei Lasern.

Polychroic Filter sind komplexer als dichroitische Filter und werden benötigt, um eingehenden Anregungslicht reflektieren und austretende Emissionslicht von der Probe. Sie werden in die Filterwürfel zwischen Objektiv und Tubuslinse des Mikroskops gelegt.

Clean up Filter: Abhängig von der Art des Lasers employe d Laser bereinigen Filter mit einem schmalen Übertragungsbandbreite sollte in den Laserstrahl direkt nach dem es den Laser verlässt platziert werden.

Notch-Filtersind entworfen, um Laserlicht effektiv absorbieren mit einer schmalen Bandbreite und übertragen alle anderen Licht. Sie werden innerhalb des Emissionspfad platziert, um herauszufiltern, keine störenden Laseranregungslicht. , Notch-Filter arbeiten, jedoch nur bei 0 ° Einfallswinkel. Wenn die Bandbreite des Kerbfilters ist sehr scharf, können die verschiedenen ankommenden Winkeln nicht mehr reflektiert wird. Blockierung des kollimierten Laserlaserlicht ist nicht betroffen, aber zurückgestreute Licht möglicherweise nicht effizient aus dem Erreichen der Kamera behindert werden.

Motorisierte Filterräder mit geeigneten Filtern Rädern leicht in die Anregungs- und Emissionspfad angeordnet werden und ermöglichen die einfache Umschaltung zwischen verschiedenen Lichtintensitäten (bei ​​Verwendung mit ND-Filter ausgestattet ist) oder Fluoreszenzkanälen (wenn vor einer Xenon- oder Quecksilber-Bogenlampe ratiometrisch platziert Kalzium-Imaging oder vor der Kamera, um die emittierende Fluorophor auszuwählen).

50:50 Würfelstrahlteiler cein zur Laserstrahlen in zwei getrennte Anregungsstrahlengänge aufgeteilt werden und auch, um sie vor dem Periskop zu kombinieren.

Strahlteiler (Emissionspfad): Für eine schnelle Bildaufnahme ohne die Notwendigkeit für physikalische Filter ändert, der Emissionsstrahl in einen blauverschoben und rotverschoben Kanal aufgeteilt. Prinzipiell können Strahlteiler durch Verwenden eines dichroitischen Keil oder eine Reihe von Spiegeln und einen dichroitischen Spiegel, um den Emissionsstrahl in einem Wellenlängen-abhängigen Weise getrennt gebaut werden. Zwei Emissionsfilter notwendig sind, um aufzuräumen, die das Sendekanäle.

Raumfilter: räumliche Filterung des Anregungsstrahls wird manchmal benötigt, um nicht-parallel von niedriger Qualität Laserstrahlen emittierten Lichtstrahlen zu entfernen. Eine räumliche Filter besteht aus einem Zweilinsenteleskop mit einem kleinen Nadelloch genau im Brennpunkt beider Linsen angeordnet. Auf diese Weise Streulicht von nicht parallelen Abschnitten des Laserstrahls resultierenden wird effektiv blockiert. Subei der Festlegung der TIRF-Mikroskopie-basierte muss ch Bedingungen erfüllt sein. Räumliche Filterung mit sinke Pinholes, die schwieriger, in den Brennpunkt, und mit kleineren Brennweiten der ersten Linsenposition sind. Um Effekte durch Linsenfehler zu reduzieren ist es vorteilhaft, anstelle von einfachen Linsen hoher Qualität und unendlich korrigierte Mikroskopobjektive mit geringer Vergrößerung (10x oder 20x) zu beschäftigen.

Periskop: Ein Periskop Einstellungen notwendig, um den fokussierten Laserstrahl in der hinteren Brennebene des Objektivs, eine Voraussetzung für TIRF Bildgebung zu übersetzen. Es kann leicht von zwei Zwei-Zoll-Spiegel, eine Translationsstufe zum Einstellen der ersten Spiegel und einen Beitrag zum Positionieren des zweiten Spiegels um die aufgeweiteten und fokussierten Anregungsstrahls in das Mikroskop (Figur 5) wiedergeben gebaut werden.

Kamera: Back-beleuchteten Electron-Multiplying Charge Coupled Devices (EMCCD) werden routinemäßig verwendetdie Aufzeichnung von Einzelmolekül-Signale. Dies ist wegen der hohen Quantenausbeute (bis 95%), hoher Aufnahmegeschwindigkeit (bis 30 MHz) und eine vergleichsweise geringe Geräuschentwicklung. Abkühlen auf -80 ° C reduziert Wärmerauschen und wird von einer Reihe von gegenwärtig verfügbaren EMCCD- Kameras unterstützt. Eine Begrenzung der EMCCD- Technologie ist, dass Kamerarauschen steigt linear mit der sowohl die Kameraverstärkung und das Signal erfasst. Dies ist nicht der Fall bei wissenschaftlichen CMOS (sCMOS) -Kameras, die deutlich auch wesentlich schneller als EMCCD- Kameras sind weniger teuer und arbeiten durch die spezielle Architektur des sCMOS Chip. Aber ein Problem mit der CMOS-Technologie verbunden ist, dass die Bildaufnahme ein gewisses Maß einer quantitativen Anzeige auf einer Einzelmolekülebene fehlt noch, weil jedes Pixel verfügt über verschiedene Erfassungsempfindlichkeit. Im Prinzip kann dies durch das Pixel-Normalisierung kompensiert werden kann, aber dieses Verfahren ist keineswegs trivial ^11. Das ist, warum wir immer noch jederzeit wiederlobe sCMOS Kameras für Einzelmolekül-Mikroskopie, aber angesichts der raschen Entwicklung dieser Technologie könnte sCMOS Kameras bald die Kamera der Wahl geworden. Slow-Scan-CCD-Kameras Kameras zu vermeiden Verstärkungsbedingte Rauschen und Pixelvarianz alle zusammen und unterstützen schnellsten Erfassungsraten, wenn sie in einer so genannten "kinetischen" Modus betrieben werden. In diesem Modus wird der gesamte Kamerachips mit Ausnahme eines Bereichs von Interesse (ROI) maskiert ist, wodurch es möglich ist, die Chips selbst als eine Speichervorrichtung zu verwenden macht. Nachdem der ROI wird zum ersten Mal ausgesetzt sind, werden die sich ergebenden Ladungen in dem maskierten Bereich des Chips Pixelzeile von Pixellinie, in der das Bild von der weiteren Lichtexposition geschützt verschoben. Sobald die Verschiebung aller Linien des ROI in den maskierten Bereich wird (im Sub-Millisekundenbereich) abgeschlossen ist, ist der ROI sich bereit für die nächste Aufnahme. Dieser Zyklus wird wiederholt, bis alle Pixelzeilen des CCD-Chips berechnet. Der Chip wird dann langsam mit deutlich redu lesenCED Ausleserauschen. Zum Beispiel auf einem 1000 x 1300 Pixel-Chip können 20 ROIs von 50x50 Pixel in schneller Folge aufgenommen werden. Weil die Bilder verbleiben auf dem Chip für eine beträchtliche Zeit, bevor sie ausgelesen werden, ist es entscheidend, zu hochwertigen Maskierungs gewährleisten und die Kamera zu kühlen (zB mit flüssigem Stickstoff), als Mittel, um übermäßiges thermisches Rauschen zu reduzieren. Einige EMCCD-Kameras unterstützen auch die kinetische Modus.

Software: Timing der Laser, Rollläden, AOMs und Kamerabelichtung sowie für eine angemessene Bildspeicher integraler Bestandteil jeder erfolgreichen Imaging-Experiments sind. Im Prinzip können viele definierten Operationen mit den verfügbaren Softwarepakete, die mit der Kamera kommen, programmiert werden. Kommerzielle Softwarepakete unterstützen eine große Anzahl von Hardware-Peripherie, die mit geringem technischen Know-how umgesetzt werden können.

Impulsgenerator, Datenerfassung (DAQ) Pension (mit analogen und digitalen Ausgangskanäle) und Oszilloskop: Ein Impulsgenerator ist einexzellente Wahl, um Triggerimpulse in Impulse definierter Zeit und Spannung umzuwandeln. Auf diese Weise Laser präzise für Ausgangsleistung gesteuert und im Millisekunden-Sub-Millisekunden-Bereich getaktet werden. Messkarten mit analogen Ausgängen erreichen die gleiche und sind bequem über PCI-Steckplätze in Hauptplatine des Computers integriert. Impulsdauer, Amplitude und Frequenz mit einem Oszilloskop überprüft.

Gehäuse der gesamten Anregungsstrahlengang: Um Schwankungen in der Anregungsprofil durch Luft Konvektionen die gesamte Anregungsstrahlengang sollte von seiner Laborumgebung eingeschlossen werden vermeiden. Diese Maßnahme ist besonders wichtig bei der Durchführung von TIRF Mikroskopie. Optische Komponenten werden auch vor Staub und das menschliche Auge aus der Laserlichtbestrahlung geschützt. Gehäuse können einfach aus schwarzem Karton, die in der Kunst-Versorgung-Läden gekauft werden können, zu bauen.

Um die Fließfähigkeit des SLB Fluorescence Recovery After Photobleac bestimmenHing (FRAP) Messungen ¹² durchgeführt werden. Für FRAP die Existenz von zwei Anregungsstrahlengänge ist ratsam (siehe Abbildung 3). Der erste Strahlengang zur Abbildung der Fluoreszenz der Doppelschicht entwickelt. Dies kann in TIRF-Konfiguration und mit geringer Lichtintensität durchgeführt werden. Der zweite Strahlengang um einen kurzen aber intensiven Bleichimpuls ermöglichen und sollte nicht TIRF-Modus konfiguriert werden, so daß es das Ziel Blätter entlang der optischen Achse. Eine runde Öffnung in den Anregungsstrahlengang platziert werden (siehe Abbildung 8), um eine perfekt runde Bleichprofil mit definierten Kanten zu projizieren. Um dieses Bild Apertur auf der Objektebene, würde seine optimale Position in der Brennebene der Linse 3 (siehe Abbildung 3). Jedoch aufgrund der langen Brennweite dieser Linse, eine Blende Bild ausreichender Qualität kann auch erzeugt werden, wenn die Öffnung an leicht versetzten Positionen angeordnet sind.

Nach Durchführung ter Imaging-Experiments die Rohdaten müssen angemessen untersucht werden. Mehrere Schritt-für-Schritt-Protokolle angeboten, die die Einstellung der wichtigsten Einstellungen (zB Beleuchtungsleistung und Zeit, TIRF Winkel) zu decken, Erfassung und Analyse der Daten.

Protokoll

1. Erzeugung und Funktionalisierung von Planar SLBs

1. Mischen der Lipide
   1. Um bei einer 10% DGS NTA-Ni / 90% POPC Lipidzusammensetzung kommen aufzulösen 45 mg POPC und 6,9 mg DGS NTA-Ni in Chloroform in einem 250 ml-Rundkolben. Halten das Volumen Chloroform niedrig (nur einige ml), um es in der nächsten Stufe zu verdampfen. Für eine 1% DGS NTA-Ni / 99% POPC Lipidzusammensetzung verwenden 49.5 mg POPC und 0,69 mg DGS NTA-Ni.
   2. Entfernen des Chloroforms unter Verwendung eines Rotationsverdampfers langsam - eine Erhöhung über der Umgebungstemperatur ist nicht notwendig. Alternativ abblasen innerhalb einer chemischen Abzugshaube in einem Strom von Inertgas, wie Stickstoff oder Argon. Während dies zu tun ständig drehen Sie den Kolben auf gleiche Abscheidung des Trocknungs Lipid auf der unteren Hälfte des Rundkolben zu ermöglichen.
   3. Sobald der Großteil wird das Chloroform abgedampft, befestigen den Kolben zur Vakuum O / N, um das Chloroform quantitativ entfernen.
      Hinweis: Dieser Schritt ist entscheidend, um eine Kontamination zu vermeidenvon Proteinen und Zellen mit toxischen Chloroform bei späteren Stufen und Lipiddoppelschicht Fluidität sicherzustellen.
2. Erzeugung von kleinen unilamellaren Vesikeln (SUV) aus getrockneten Lipide
   Anmerkung: kleine unilamellare Vesikel (SUVs) sind zwischen 20 nm und 100 nm im Durchmesser und können leicht durch Behandlung in einem Ultraschallbad hergestellt werden. Lipid Extrusion einem alternativen Verfahren kann zu SUVs zu geben und, abhängig von der Porengröße des für die Extrusion angewendeten Filter auch große unilamellare Vesikel (LUVs), die von 100 nm bis 1000 nm in der Größe. Jedoch sind SUVs besten geeignet zum Bilden SLBs.
   1. SUVs durch Behandlung in einem Ultraschallbad (im Video gezeigt):
      1. Entgasen PBS. Aussetzung der getrockneten Lipidmischung mit 250 ml Rundkolben in 10 ml entgastem PBS.
      2. Der Kolben wird mit Inertgas zu füllen, wie beispielsweise Stickstoff oder Argon, schließen Sie es mit einem Stopfen und der Kolben mit Autoklaven Band abzudichten.
      3. Legen Sie die versiegelte Flasche in einem Ultraschallbad und beschallen die Lipidsuspension eint 120 bis 170 W, bis es klar geworden ist. Dies dauert zwischen 30 und 60 min.
      4. Überwachung der Fortschritte der Vesikelbildung spektrophotometrisch: ergeben, dass die Absorption von unverdünntem Emulsion im Vergleich zu PBS konstant bei 234 nm (als ein Indikator für den Lipidkonzentration) dennoch sollte deutlich bei 550 nm fallen (aufgrund geringerer Lichtstreuung über größere Partikel).
      5. Zu Pellet schweren nicht unilamellaren Vesikeln, die mit der Bildung eines zusammenhängenden SLB stören, pelle Vesikelsuspension durch Zentrifugation bei 150000 · g für 1 Stunde bei 25 ° C und anschließend 8 Stunden bei 288.000 × g, 4 ° C.
      6. Den Überstand durch einen Spritzenfilter mit einem Porendurchmesser von 0,2 um.
      7. Messung der OD bei 234 nm und 550 nm, um die Klarheit des Vesikels Zubereitung und die Menge an Lipid linken überwachen.
      8. Speichern die Vesikel bei 4 ° C unter Argon oder Stickstoff. Optional können Sie Vesikelsuspension für Doppelschicht-Zubereitungfür mehrere Monate.
   2. SUVs durch Lipid-Extrusion:
      1. In kurzen, übergeben Sie die Lipidsuspension mehrere Male durch einen Filter mit einer Porengröße von 0,1 & mgr; m. Unabhängig von dem Herstellungsverfahren Zentrifugation der Vesikelsuspension zweimal (1H, 150,000g, 25 ° C, dann 8 h, 4 ° C, 288.000 g) pelletiert nicht unilamellare Vesikel, die schwerer sind.
         HINWEIS: Wenn bei 4 ° C unter Inertgas gelagert können Vesikel-Doppelschicht Vorbereitung für mehrere Monate verwendet werden.
3. Bildung einer SLB und der Ladevorgang mit Protein
   1. Behandlung von 24 x 50 mm # 1.5 Glasobjektträger mit einer 3: 1 Mischung aus konzentrierter Schwefelsäure und 30% Wasserstoffperoxid für 30 min.
      HINWEIS: Aufgrund der Aggressivität der Mischung besondere Sorgfalt walten lassen, dh tragen einen Laborkittel und Schutzbrille, wie in dem Video zu sehen!
   2. Spülen Glasobjektträger unter einem Strom von _ddH2O aus einer Spritzflasche. Legen Sie sie auf einer Teflon Stand und lassen Sie sie trocknenfür 10 bis 30 min.
   3. Entfernen Sie die untere Glasplatte von 8 oder 16 auch Kammern, füllen Sie das unten mit Epoxid-Kleber und sorgfältig legen Sie einen sauberen und trockenen Objektträger auf den Leim bedeckten Kammerboden. Ließ den Kleber für etwa 10 min zu härten. Entfernen Sie überschüssigen Kleber von der Unterseite.
      HINWEIS: Die Dichtheit zwischen dem Glasträger und der Kammer kann auch leicht mit der Verwendung einer Dentalzweikomponenten-Silikon Modelliermasse, die innerhalb von 10 bis 30 min aushärtet erreicht werden. Diese Dichtung ist nicht so fest wie Epoxid-Kleber, sondern hält regelmäßige körperliche Belastung. Nach dem Experiment kann es leicht aus der Kammer, die dann in zukünftigen Experimenten wiederverwendbar ist, entfernt werden.
   4. Pipette 120 ul (60 ul) einer 10-fach mit PBS verdünnt Lipidsuspension in jede Vertiefung einer 8 (16) - auch Kammer der Doppelschicht und lassen Form für 20 Minuten (wie oben beschrieben). Die Doppelschicht vorsichtig zweimal gründlich mit 15 ml PBS. Sobald die Doppelschicht gebildet hat, muss diese in einem Puffer eingetaucht werden und niemals der Luft ausgesetzt werden.
   5. Füllen Sie jede auch den ganzen Weg mit PBS, dann nehmen Sie 330μl (8-Well-Kammer) und 165μl (16-Well-Kammer). Es gibt 350 ul (175μl) in den Brunnen gelassen. Hinzuzufügen 50 ul (25 ul) des Cocktails His-markierten Proteine ​​in PBS in jede Vertiefung (400 oder 200 & mgr; l final) enthielt, verdünnt und Inkubation bei RT für 60 min im Dunkeln. Die Oberflächenproteindichte kann durch Variation der Proteinkonzentration während dieses Inkubationsschritts eingestellt werden.
   6. Spülen Sie jede Vertiefung zweimal mit 15 ml PBS.
      HINWEIS: In der Regel SLBs sollte in Versuchen nicht mehr als 6 Stunden nach der Beladung mit Protein verwendet werden. Während dieser Zeit bleibt Fluorophor Erholung nach Photobleaching bis zu 95%, und kein Verlust in Bilayer-assoziierten Protein nachgewiesen werden kann. Die Proteindichte sollte vor dem Experiment bestimmt werden (siehe unten).
   7. Optionaler Schritt: Um nicht-spezifische Bindung des Proteins der DGS NTA-Ni enthaltenden SLB testen, wäscht den SLB einmal mit PBS, enthaltend 300 mM Imidazol. Die Pro-tein sollte komplett zu kommen.

2. Mikroskop-Setup

1. Für den Bau einer Mikroskopiesystem zum Aufspüren von der Fluoreszenz der einzelnen Fluorochrome beziehen sich auf die in der Einleitung genannten Empfehlungen.

3. Leistungsmessungen

HINWEIS: Fluorophore kann leicht mit einem Überschuss an Anregungslicht gesättigt. Dies beschleunigt ohne weitere Verstärkung der Emissionsphotobleichen und sollten daher vermieden werden. Zur Optimierung der Probenbeleuchtung die Anregungsleistungsdichte sollte direkt an der Probe gemessen werden. Solche Messungen können auch als Referenz für zukünftige Experimente dienen. Ferner kennen das Verhältnis zwischen Eingangs- und Ausgangslaserleistung ist nützlich bei der Beurteilung bei dem Licht in das Abbildungssystem verloren.

1. Bewegen des Anregungsstrahls in die aufrechte Position, so daß es das Ziel Blätter in einem Winkel von 90 °.
2. Legen Sie den Kopf der Leistungsmesser an der Spitze of Strahls und Messen der Leistung des Strahls (= P). Dokumentieren Sie das Ergebnis ein.
3. Verwenden des Periskop, drehen Sie den Strahl in den TIRF-Position und ein fehlerfreies homogene Leuchtstoffdoppelschicht. Zur Bleiche und CCD-Signalsättigung Ort ein Neutraldichtefilter (ND) mit einer optischen Dichte (OD) von 2 bis 3 in die Anregungslichtpfad zu vermeiden.
   1. Messen Sie die integrierten Zählungen der gesamten Leuchtfeld (= I _insgesamt). Auch messen Sie die Größe der beleuchteten Fläche (= A _insgesamt). Messen Sie die integrierten Zählungen (= I _Center) der maximal beleuchtet Zentrum vor Ort als auch die Größe des Flecks (= A _Mitte).
4. Messen Sie die Hintergrundsignal pro Bildpunkt (= B) entweder außerhalb der beleuchteten Fläche oder ohne Probenbeleuchtung.
5. Subtrahieren Sie die Hintergrundsignal aus den Ergebnissen in 3 gemessen). Tun Sie dies, indem die Anzahl von Bildpunkten des fraglichen Bereich (ganze beleuchtete Fläche oder in der Mitte vor Ort) mit dem HintergrundZählungen pro Pixel. (= _I Gesamt _- insgesamt .B und ich _zentrieren - _ein Zentrum .B).
6. Unterteilen Sie die integrierte und Hinter korrigierte Signal der Mittelpunkt durch die integrierte und Hintergrund-korrigierte Signal von den gesamten Bereich der Beleuchtung.
   HINWEIS: Das Ergebnis zeigt den Anteil der Gesamtleistung in der Mitte vor Ort (= (I _Zentrum - _Ein Zentrum .B) / _(I Gesamt - _Insgesamt .B)) entfernt. Die Multiplikation dieses Ergebnisses mit dem in 2.) Ergebnisse in der Kraft des Lichts Beleuchtung der Mittelpunkt gemessene Leistung P.
7. Bestimmen Sie die Größe des Punktes A _Zentrum in um². Dazu teilen Sie die Kamera Pixelgröße in & mgr; m von der Vergrößerung des Objektivs, nehmen Sie den Platz des Ergebnisses als um² pro Pixel.
   1. Alternativ misst die Pixelgröße innerhalb des Bildes mit der Verwendung eines Mikrometers Folie auf das Mikroskop gelegt und das Quadrat des Ergebnisses als Fläche pro Pixel. Multiply dieser Wert durch die Anzahl von Pixeln innerhalb des Mittenfleck befindet, um am beleuchteten Spot-Bereich zu gelangen.
8. Teilen Sie die Leistung P Beleuchten der Mittelpunkt durch die Größe der Mittelpunkt _{Ein Zentrum, um²,} um die Beleuchtungsstärke pro & mgr; m ² zu berechnen. Ein Beispiel ist in Figur 6 angegeben.
9. Stromdichtewerte in nicht-TIRF-Beleuchtung gemessen, sind in der Regel niedriger als in TIRF-Beleuchtung ^{13 vorhanden,} die auch von der genauen Winkel, in dem das Laserlicht total reflektiert wird, abhängen. Bei Leistungsdichten unter TIRF-Beleuchtung vorhanden anreisen, Bild kalibriert fluoreszierende Kügelchen von 0,1 um Durchmesser sowohl in nicht-TIRF und TIRF. Das Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten Wulst in TIRF und nicht TIRF Modus gemessen beträgt der Umwandlungsfaktor C, der Umsetzung der gemessenen Leistungsdichtewerte in den unter TIRF-Beleuchtung (Gleichung 1) wirksam werden können.
   Leistungsdichte _TIRF = C • Leistungsdichte _nicht-TIRF (Gleichung 1)
   mit C = Wulst Intensität _{T IRF} / Bead Intensität _nicht-TIRF

4. Densitometermesswerten

1. Bestimmen Sie die mittlere Signal einzelner Fluorophore auf einer Doppelschicht entfernt. Doppelschicht-Attached-MHC-Moleküle mit fluoreszierenden Peptiden beladen sind ideal für diesen Zweck, da das Protein: label Stöchiometrie genau ein. Falls erforderlich Bleich alle Etiketten auf der Doppelschicht in das Blickfeld und lassen Sie die Fluoreszenz zu erholen, um einzelne Fluorophore zu visualisieren.
   1. Nehmen Sie Bilder in schneller Folge (zB Anwendung eines Streaming-Akquisition-Protokoll) und Überwachung einzelner Moleküle Mobilität über mehrere Rahmen. Für weitere Informationen siehe Abbildung 7.
2. Markieren Sie die zentralen Beleuchtungsfleck innerhalb der Doppelschicht als ROI. Messung der ROI, sollte die Varianz der Beleuchtungsleistungsdichte (die proportional zur Fluoreszenzintensität) idealerweise weniger als 15% betragen.
   1. Bestimmen Sie Einzelmolekül-Fluoreszenz-und Groß nur innerhalb dieses ROI. Integrieren Sie das Signal eines ROI, die groß genug ist, um 99% oder mehr der Punktverteilungsfunktion der Einzelemitter zu erfassen ist. Beim Einsatz einer Kamera mit einer Pixelgröße von 16-20 & mgr; m (unter Ausschluss der Spezifikationen des Herstellers angegeben ist), ein Objektiv mit 100-facher Vergrßerung und einer numerischen Apertur von gleich oder größer als 1,45, einen Bereich von 7 mal 7 Bildpunkte mit der Intensitätsmaximum in der Mitte des Platzes.
   2. Um die Hintergrundsignal zu bestimmen, integrieren die Grafen von einer benachbarten 7 von 7 Pixel-Quadrat, das ein Fluoreszenzsignal nicht enthält. Subtrahieren Sie den Hintergrund aus der Einzelmolekül-Signal, um den korrigierten Wert für Einzelmolekül-Fluor bestimmenescence. Wählen nur Signale, die sich noch in der nachfolgenden Rahmens sichtbar sind.
3. Wiederholen Sie Schritt 4.2 fünfzig bis mehrere hundert Mal. Der Mittelwert der Hintergrund-korrigierte Signal. Falls gewünscht, plotten einzigen Molekül Intensitätswerte als Histogramm. Optional: profitieren Sie von einem geeigneten Plugin von Open-Source-Software-Pakete (zB ImageJ) oder Verarbeitung der Daten mit Hilfe kommerzieller Software (zB Metamorph, Molecular Devices). Erfahrene Anwender können ihre eigenen Analyseprogramm in Matlab oder ähnliche Software-Pakete zu schreiben.
4. Platzieren eines Neutraldichtefilter von 2 oder höher in der Erregerpfad und nehmen Bilder einer fluoreszierenden Doppelschicht, die Proteine ​​mit dem gleichen Fluorophor markiert. Notieren Sie sich die durchschnittliche Pixelintensität innerhalb des gleichen ROI für Einzelmolekül-Intensitätsmessungen verwendet. Aufzeichnen der Belichtungszeit des Schüttfluoreszenzmessungen. Messen Sie die gleiche Stelle ohne Beleuchtung für Hintergrund-Subtraktion.
5. Um die Proteindichte in der Bi bestimmenSchicht, multiplizieren die hintergrundkorrigierten Massen Fluoreszenz Durchschnittspixelintensität in Schritt 4 bestimmt wird durch die Anzahl der Pixel pro Quadratmikrometer (zB 41,5), 100 (falls ein ND-Filter mit einem Außendurchmesser von 2 verwendet wurde) oder 1000 (wenn ein ND Filter mit einem Außendurchmesser von 3 verwendet wurde) und die Belichtungszeit in Schritt 2 verwendet und teilen sie durch die durchschnittliche Einzelmolekülsignal in Schritt 3 bestimmt wird, in Schritt 2 die Belichtungszeit verwendet, und die Anzahl der Fluorophore pro Protein.

5. Testen der Integrität der Doppelschicht

1. Bereiten Sie eine Leuchtstoffdoppelschicht und auf dem Mikroskoptisch, wie oben beschrieben.
2. Stellen Sie den Fokus und nehmen Sie ein Bild von der Doppelschicht in TIRF-Modus. Tragen Sie eine kurze, aber intensive Bleichpuls in nicht-TIRF-Modus, um die Fluoreszenz in einem kleinen scheibenförmigen ROI abzutragen.
3. Nehmen Sie ein Bild von der Doppelschicht in geringer Intensität TIRF-Modus unmittelbar nach dem Bleichen und dann alle fünf bis zehn Sekunden, um die Geschwindigkeit der Fluoreszenz Erholung zu überwachen.
4. Move in einen anderen Bereich auf der Doppelschicht und folgen Sie die Schritte 2 und 3. Nehmen Sie ein anderes Bild in geringer Intensität TIRF-Modus 5 min nach der Bleichpuls. Bestimmen Sie die Intensität I _{veröffentlichen Bleichmittel in der} Bleichmittelbereich und vergleichen Sie es mit der Intensität vor dem Bleichen _I 0 zu Beginn des Experiments (sollte keine Bleiche stattgefunden haben), um die immobile Fraktion berechnen (IF), wie folgt:
   Immobile Fraktion IF (%) = (I _{0 -} I _{veröffentlichen Bleichmittel)} / (I _{0 -} Hintergrund) x 100,
   mit Hintergrund = gemessene Intensität innerhalb der ROI ohne Anregungslicht angewendet
   Das IF sollte weniger als 10% (im Idealfall weniger als 5%) beträgt.

Ergebnisse

Die Architektur der Einzelmolekülfluoreszenzmikroskopiesystem wird sehr detailliert in Figur 2 dargestellt. Einzelne Teile, wie optische Komponenten und anderen Hardware-Komponenten sind in der Einleitung erläutert. Die optischen Anregungsstrahlengänge, die Anstieg definiert auf TIRF und nicht TIRF-Beleuchtung zu geben, werden gezeigt und in den 3 bis 5 erläutert. Man beachte die Lage der 50:50 Strahlteiler vor dem ersten Spiegel angeordnet ist Periskop eine Mikrometer translatierbaren Stufe (Abbildung 5). Dieser Strahlteiler überlagert die TIRF Strahl für die Bildgebung verwendet (grün angezeigt) und der nicht-TIRF Strahl (rot gekennzeichnet) zum Bleichen oder lokale Öffnung definierte Licht-vermittelte Aktivierung Probe verwendet (wie in Abbildung 3 beschrieben). Die kombinierten Lichtwege (Abbildung 5, in orange dargestellt) sind über den zweiten Periskop Spiegel in den hinteren Anschluss des invertierten micr reflektiertOscope. Wie in Figur 4 erläutert und in Figur 2 skizziert, die Umsetzung von zwei oder drei konvexen Linsen erweitert die Laserstrahlprofile und fokussiert die Laserstrahlen auf der hinteren Brennebene des Objektivs um zu zwei kollimierten Strahlen ergeben Beleuchten der Probe in TIRF und jeweils in nicht-TIRF.

Ein Beispiel für gemessene Intensitätswerte für die Berechnung der Leistungsdichte an der Probe erforderlich ist, in 6 gezeigt. Die durchschnittliche Hintergrundsignal, das von Intensitäten in dem beleuchteten und Zentralbereich (für die Bildgebung verwendet wird) gemessen subtrahiert werden soll, wird in einem Bereich innerhalb des fest Sichtfeld, die nicht durch den Laserstrahl (hier 7089 counts) beleuchtet wird. Die Hintergrund-korrigierten mittleren Intensitäten der beleuchteten (1684 Zählungen) und dem Mittelbereich (4830 Zählungen) werden dann durch die entsprechenden Bereichsgrößen multipliziert, um Anlass zu integrierten Intensitäten (1,471 gebenx ¹⁰ 8 Fälle für den beleuchteten Bereich und 3.424 x 10 ⁷ Zählungen für den zentralen Bereich). Das Verhältnis der integrierten Intensitäten innerhalb der zentralen und beleuchteten Bereiche ergibt den Bruchteil der Gesamtleistung Beleuchten der zentrale Bereich (0,23 bzw. 23%). Wie in dem Film dargestellt ist, weist die Gesamtleistung an dem Ziel bei der Verwendung eines Leistungsmessers in nicht TIRF Beleuchtungsmodus bestimmt werden. In unserem Beispiel wird sie auf 5 mW eingestellt, was was zu einer Leistung von 5 mW x 0,23 = 1,15 mW im zentralen Bereich. Da 41,5 Pixel Menge in unserem Beispiel 1 um ^{2 hat der} zentrale Bereich eine Größe von 7089 /41.5 Pixel Pixel x & mgr; m ^{2 =} 170,8 & mgr; m ^2. Dividieren der Leistung der Licht Beleuchten der zentrale Bereich (1,15 mW) von diesem Bereich (170,8 & mgr; m ²⁾ ergibt eine mittlere LeistungDichte von 0,7 kW / cm ^{2 in} dem zentralen Bereich.

Abbildung 7 zeigt Bilder und entsprechende Intensitäts Ergebnisse in schneller Folge erworbenen Einzel Fluorophore (100 Bilder pro Sekunde, dh mit einem Zeitrahmen von 10 ms). Zur Intensitäts Quantifizierung der durchschnittliche Signal eines rechteckigen Bereichs von sieben und sieben (= 49) Pixel, die das Fluoreszenzsignal umfasst, wird bestimmt. Weiterhin ist die durchschnittliche Signal des Hintergrunds in einem rechteckigen Bereich von sieben von sieben Pixeln in der Nähe des einzelnen Moleküls Signals bestimmt. Der Hintergrund-korrigierten mittleren Signal wird durch die Anzahl von Pixeln in dem Bereich (= 49) multipliziert, um Anlass zu Einzelmolekülsignal (fett dargestellt) zu ergeben.

Ein repräsentatives Experiment FRAP entwickelt, um die Mobilität von SLB-assoziierte Fluoreszenz-markierten Proteinen zu bewerten, ist in Fig. 8 gezeigt Hinweis in 8A die repetitive Verwendung eines verbreiterten geringer Intensität Abbildungsstrahl und dem einzigen Einsatz eines zweiten engeren und Blende definierten Strahl hoher Intensität für die schnelle Fluorochrom-Ablation bei dem zweiten Zeitpunkt Null. Hintergrund-subtrahiert mittleren Intensitäten im gelben Kreis, der durch die anfängliche durchschnittliche Intensitätswert vor dem Bleichimpuls normalisiert wurden, sind in Abbildung 8B gegen die Zeit, um die Geschwindigkeit und das Ausmaß, zu dem Fluoreszenz erholt hat aufzuzeichnen aufgetragen. Wie gezeigt, hat mehr als 90% (durch die grüne Linie) der anfänglichen Doppelschichtstärke innerhalb von 75 sec nach Fluorochrom Ablation erholt. Als Folge weniger als 10% der Proteine ​​in der gezeigten SLB eingebettet sind unbeweglich.

Abbildung 1. Schematische Darstellung eines SLB-System. (A) SLBs aus POPC (90-99%) und dem synthetischen Lipid DGS NTA-N gemachti (1-10%). Sie bilden sich spontan, wenn saubere Glasoberflächen mit SUVs aus den entsprechenden Lipiden geladen. (B) Einmal gebildet, sind diese SLBs können mit löslichen Proteine ​​entweder mit einem C- oder N-terminalen Histidine-Tag mit zwölf (12H, für ausgedehnte dekorierenden zB die kostimulatorische Molekül B7-1 und das Adhäsionsmolekül ICAM-1) oder Protein-Dimere mit zwei Tags mit sechs Histidinen jeweils (2x6H, beispielsweise eine αβMHC Klasse-II-Dimer). erweiterte Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version davon zu sehen Abbildung.

Figur 2. Übersicht der Anregungs- und Emissionsstrahlengänge. Gasionenlaser (zum Beispiel Ar ⁺ oder Kr ⁺⁾ kann für eine schnelle Schließung mit dem Einsatz von akusto optischen mo betrieben werden dulators. Laser-Dioden sind in vielen Wellenlängen heutzutage zur Verfügung und stellen eine hervorragende Alternative, da sie elektronisch im Mikrosekunden-rage moduliert werden. Beachten Sie, dass Laserstrahlen können leicht mit zwei (dichroitische) Spiegel und splitbereinigt und in Kombination mit der Verwendung von einfachen Strahlteiler Anlass zu zwei oder mehr Strahlengänge zu geben. In diesem Beispiel ein TIRF Abbildungsstrahl (um Ereignisse zu überwachen) und ein Bleichstrahl (entweder Bleich Fluorophore oder photo aktivieren Käfigmoleküle in einer Öffnung definiert) verwendet. Beide Anregungspfade können unabhängig voneinander durch die Verwendung von zusätzlichen Jalousien betreiben. Das Periskop ermöglicht zum Übersetzen der fokussierten Laserstrahlen in der hinteren Brennebene des Objektivs zu TIRF Beleuchtung der Probe zu erzeugen. Das Fluoreszenzbild können spektral mit dem Einsatz von einer Emissionsstrahlteiler vor dem Erwerb aufgeteilt werden unter Verwendung einer hochempfindlichen Kamera (zB EM-CCD oder wissenschaftlichen CMOS-Kamera)..com / files / ftp_upload / 53.158 / 53158fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3. Einstellen TIRF-Beleuchtung durch die Übersetzung der fokussierte Strahl innerhalb der hinteren Brennebene des Objektivs ist. Wie gezeigt den Brennpunkt des Laserstrahls ist innerhalb der hinteren Brennebene des Objektivs von der Mitte zu der Peripherie durch Translokation des Strahls verschoben (mit einem Periskop Spiegelanordnung). Als Ergebnis wird ein Parallelstrahl verlässt das Ziel in einer geneigten Beleuchtungs bis ein Grenzwinkel erreicht ist, bei welchem ​​die interne Totalreflexion kommt. Die abklingende Feld wird an der Glas-Media-Schnittstelle in denen Totalreflexion auftritt generiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses fi ansehen Abbildung.

Figur 4. Einfache optische Systeme, um den Laserstrahl in der hinteren Brennebene des Objektivs fokussieren. Drei oder zwei Linsen benötigt werden, um den Laserstrahl zu verbreitern und um es auf der hinteren Brennebene der TIRF Ziel zu fokussieren. Zwei Linsensysteme enthalten weniger Objektiv-assoziierten Fehler als drei Linsensysteme und könnten für die Erzeugung des TIRF Abbildungsstrahlen besser geeignet sein. Drei Linsen vielleicht vorzuziehen, wenn mit dem Ziel für definierte Strahlaufweitung und einer Beleuchtungsfleck mit scharfen Kanten, wie es für Studien mit Photoaktivierung oder Entfärbemittel der erforderlich sein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 5. Kommentierte Fotografie der Strahlengang an der Rückseite des Fluoreszenzmikroskops. Wie bereits in Abbildung 2 einen Rohr umrissen einfach implementieren zwei Anregungsstrahlen, eine in TIRF (grün angezeigt) die andere in nicht-TIRF-Modus (in angedeutet rot). Diese werden bei der Verwendung eines 50:50 Strahlteiler (BS) überschichtet. Konvexen Linsen (L1 und L2) sind in die jeweiligen Strahlen positioniert ist, um sie auf der hinteren Brennebene der Objektiv konzentrieren (nicht dargestellt). Ein Periskop aus zwei Spiegeln (M1 und M2) führt beide Strahlen durch den Hafen für die Einreise in das Mikroskop. Wobei der erste Spiegel (M1) mit dem Einsatz einer Translationsstufe (TS) (durch Drehen einer Mikrometerschraube wie angegeben) bewegt wird, um einen der Strahlen in TIRF Position zu bewegen. Sobald TIRF wurde festgestellt, kann der zweite Strahl (für Foto-Bleichen oder -Aktivierung, hier in rot angegeben verwendet) unabhängig von der TIRF Strahl eingestellt werden, um das Ziel in nicht-TIRF verlassenModus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 6. Messung der Leistung im mittleren Bereich der Beleuchtungsfleck. Wie angedeutet wählte geeignete Regionen von Interesse, der Hintergrund zu reflektieren, die gesamte beleuchtete Fläche (IA) und der Zentralbereich (CA), wo Veranstaltungen werden später aufgenommen werden. Subtrahieren der Hintergrundwerte von denen für IA und CA erfasst und die Integration der Intensitäten durch Multiplikation korrigierten mittleren Intensitäten mit der Anzahl der in jedem Bereich (= integrierte Intensitäten) vorhanden Pixel. Teilen Sie die integrierte Intensität der CA durch, dass der IA an der Anteil der Strahlleistung Beleuchtung des CA gelangen (in diesem Beispiel: 23%). Bestimmen Sie die Leistung der Licht Beleuchten der CA, indem der Gesamtstrahlleistung (hier: 5 mW) mit dem Anteil Beleuchten der CA (hier: 0,23). Zur Bestimmung der Größe der zentralen Bereich multiplizieren Sie den Bereich (hier: 7089 Pixel) mit einer Bildpunkt-zu-Flächengröße Umrechnungsfaktor (hier: 1 / 41,5 & mgr; m ² Pixel ^-1). Um mit dem durchschnittlichen Leistungsdichte des Anregungslicht Beleuchtung des CA anreisen, teilen Sie die Leistung (hier: 1,15 mW) von der Größe des CA. (Hier: 170,8 & mgr; m ²⁾ Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 7. Die Quantifizierung der Einzelmolekül-Signale. (A) Zeitverlauf der einzelnen Fluorophore auf einer SLB. A 7 x 7 Pixel-Größe, Region of Interest (ROI, gelb) um das Signal für die Quantifizierung platziert. Hintergrund ist aus der einer benachbarten 7 x 7 Pixel bestimmtroi (grün). (B) Quantifizierte durchschnittliche Pixelintensitäten werden aufgelistet. Um die Einzelmolekül-Signal zu bestimmen, werden Hintergrundwerte (grün ROI) von Signalwerten (gelb roi) subtrahiert und multipliziert mit 49. (C) Einzelmolekül Intensitäten einem Fluorophor gegen die Zeit aufgetragen. Beachten Sie, dass die 90 msec Zeitpunkt weggelassen, wie das Fluorophor in den Prozess der Bleiche. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 8. Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) Analyse, um die Integrität des SLB bestimmen. (A) FRAP wurde an einem Doppelschicht tragenden Iek / MCC-Alexa Fluor 647. Jeder 10. Bild des Experiments ist in (B) FRAP Quantifizierung des in dargestellten Experiment durchgeführt. (A). Werte zeigen mittleren Intensitäten (I) innerhalb der in (A) gezeigt, gelb ROI dividiert durch die Anfangsintensität (I _o) vor der Bleiche. Red Datenpunkte werden in (A) angezeigt wird, zeigt die grüne Linie 0.9 Wiederherstellung der ursprünglichen Intensitäten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Diskussion

Einzelmolekül-Mikroskopie bietet die einmalige Gelegenheit, das Verhalten von Proteinen in ihrer nativen zellulären Umgebung zu studieren. Molekulare Bildgebung wird somit zunehmend attraktiv für eine breite wissenschaftliche Gemeinschaft, aber viele Naturwissenschaftler immer noch weg von der anfänglichen Investitionen in Technologie und Know-how zurückschrecken. Der Hauptnutzen, durch Zusammensetzen der eigenen Abbildungssystems ist, dass es ohne weiteres auf jeden spezifischen Bedarf eingestellt werden.

Wie hierin vorgeschlagen, eine nicht-TIRF Anregungslichtkegel kann zusätzlich zu einer bestehenden TIRF Lichtweg eingeführt werden, wenn eine schnelle und definierte Photobleaching (oder -Aktivierung) von Fluorophoren und Liganden gewünscht wird, beispielsweise bei der Durchführung von FRAP oder Ligand uncaging Experimenten ¹⁴ . Die Einführung eines Emissionsstrahlteiler ermöglicht die gleichzeitige Aufnahme von mindestens zwei und in einigen Fällen bis zu vier Fluoreszenzkanälen. Die Liste der Erweiterungen ist im wesentlichen nur von begrenztdie eigene Vorstellungskraft.

B. Umsetzung einer motorisierten Emissions Filterrad im Emissionspfad ermöglicht eine schnelle Umschaltung zwischen bis zu zehn unterschiedlichen Fluoreszenzkanälen. Bei der Kombination von zwei motorisierten Emissionsfilterräder in Reihe (jeweils mit 10 Filterschlitze ausgestattet), bis zu 18 Fluoreszenzkanäle können ausgelesen werden. TIRF-basierte Bildgebung kann mit Calciummobilisierung Messungen und Interferenzreflexionsmikroskopie (IRM) nach der Integration einer Xenon oder Quecksilber Anregungslampe Pfad ergänzt werden. IRM ist das Verfahren der Wahl, um den Grad, in dem Zellen auf die Glasoberfläche oder eine SLB befestigt und kann somit kritische Informationen bei der Interpretation der TIRF-basierten Bilddaten zu visualisieren. Festlegung eines verbreiterten Anregungsstrahls mit der Verwendung eines einfachen dichroitischen Spiegel und einem zusätzlichen Laser von 405 nm leitenden Photolokalisierungsmikroskopie (Palm) oder stochastischer optischen Rekonstruktionsmikroskopie (STORM) ermöglicht, dh zwei superresolutIonen Methodologien Positionsgenauigkeit unterhalb der Beugungsgrenze des sichtbaren Lichts ^15,16.

Allerdings ist experimentelle Erfolg nicht nur eine Frage der geeigneten Hardware. Um alle Vorteile der geräuschreduzierten TIRF-basierte Bildgebung zu tragen, sollte Zellen Kontakt zu einer Oberfläche in einer Weise, die nicht Zwänge auferlegen wird auf der Zelloberfläche, oder dass stört die Physiologie der Plasmamembran zu machen. SLBs mit geeigneten Proteinen für die Zelladhäsion sind höchstens für diesen Zweck gut geeignet, da alle SLB eingebetteten Liganden sind lateral beweglich und passen ihre laterale Position innerhalb der Doppelschicht in Reaktion auf die Bindung und Trennung Dynamik Rezeptor funktionalisiert ist.

Um SLBs reproduzierbar herzustellen, ist es am besten, mit SUVs von hoher Reinheit beginnen. Wie hier beschrieben, ist es somit wichtig, multilamellaren Vesikeln, die auch während der Beschallung erzeugten entfernen, in zwei Schritten, wie Ultrazentrifugation Diese Interfere mit der Bildung von zusammenhängenden SLBs mit hoher Fluidität. SLBs hochwertiger Form nur auf saubere Glasflächen. Sobald gereinigte Glasobjektträger sofort verwendet oder in Vakuum gelagert werden. Wichtig ist, SLBs darf niemals an der Luft liegen, da dies würde ihre Störungen führen kann. SLB Wasch beinhaltet, wie gezeigt, Puffer Spülen mit der Verwendung einer serologischen Pipette, da dies nicht nur sparen, sondern auch zeitsparende Vorgehensweise.

Während der Ernte und Reinigung von SLB-residenten Proteinen ist die Verwendung von Reinigungsmitteln vermieden werden sollte. Dies liegt daran, Detergens-Protein Mobilität deutlich, auch wenn sie in Spurenmengen zu reduzieren. Um die Notwendigkeit für Waschmittel alle zusammen zu umgehen, wird eine lösliche Expression sekretierter Polyhistidinschwanz ausgestatteten Liganden in Säugetier- oder Insektenzellen empfohlen. Wenn die Rückfaltung von E. coli-Einschlusskörper erforderlich ist, muss vorsichtig angewendet, um Reinigungsmittel effektiv von der Einschlusskörper vor deren Ab- und Rückfaltung zu entfernen.

Ein wesentlicher Vorteil der Verwendung von SLBs Ergebnisse aus den modularen, rekonstitutiven Natur, die spezifisch sezieren die Rolle eines bestimmten Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung für die Zellaktivierung und die Zelladhäsion ermöglicht. In diesem Zusammenhang ist es wichtig zu erwähnen, dass DGS NTA-Ni vorhanden sein sollte bei 10% in der SLB, um Proteine ​​im Wettbewerb um NTA-NI-Bindungsstellen zu verhindern. Beim Einsatz SLBs beherbergen nur 1% oder 2% DGS NTA-Ni, eine Reduzierung der Assoziation der eine gegebene Polyhistidin-markierte Proteinspezies kann festgestellt werden, insbesondere, wenn Co-Inkubieren zunehmenden Mengen eines zweiten Polyhistidin-markierte Proteinspezies (unveröffent Beobachtung). Dieses Phänomen wird nicht beobachtet, wenn die Arbeit mit SLBs mit 10% DGS NTA-Ni.

Während wir nicht beobachtet unspezifische Bindung jeglicher Polyhistidin-tagged Protein SLBs enthaltenden DGS NTA-Ni getestet, sollte diese Möglichkeit bei der Einführung eines Proteins zum ersten Mal getestet werden,Zu diesem Zweck empfehlen wir den Einsatz von SLBs ohne DGS NTA-Ni (das Protein nicht binden sollte). Zweitens, wenn Sie ein SLB enthält DGS NTA-Ni, das Protein sollte komplett kommen nach dem Waschen des SLB mit PBS, das 300 mM Imidazol.

Ein weiterer wesentlicher Vorteil der Verwendung SLBs ist, dass transiente Interaktionen und Signalereignisse können mit verbesserten Raum-Zeit-Auflösung von ^{17 bis 19} überwacht werden. Dies ist zumindest teilweise, weil ein dreidimensionaler Bindungsprozesses im wesentlichen auf zwei Bildabmessungen verringert wird, insbesondere bei Aufnahmen in geräuschgedämpften TIRF-Modus. Die Verwendung von SLBs ist mit Einzelmolekül-Signalerkennung, eine Voraussetzung für die photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM) oder stochastischen optischen Rekonstruktionsmikroskopie (STORM), dh Superresolution-Mikroskopie mit einer Auflösung unterhalb der Beugungsgrenze ^15,16 kompatibel. Diese speziellen bildgebenden Verfahren ermöglichen einzelnes Molekül Förster Resonance Energy Transfer Experimente entwickelt, um einzelne Protein-Protein-Interaktionen in einer synaptischen Umgebung ²⁰ zu visualisieren. Dieser Ansatz wird in beträchtlichem Detail in einer Veröffentlichung JoVE als "Mess TCR-pMHC Bindung unter Verwendung eines FRET-Mikroskopie assay" ²¹ erläutert.

Bei der Interpretation der SLB-basierte Experimente sollte man immer daran, dass nicht alle Eigenschaften eines Plasmamembran von einer lebenden Zelle sind durch SLBs vorge zu halten, und dass einige der fehlenden Qualitäten könnten die Physiologie in Untersuchung beeinflussen. Schließlich sind SLB-eingebettete Proteine ​​frei diffundierenden und Membrandomänen, da die meisten ihrer zellulären Gegenstücke ^5,6,22 nicht organisiert. Immobilisierten Plasmamembran Blätter von adhärenten Zellen, die die Plasmamembranarchitektur lebender Zellen zu einem gewissen Grad zu sparen abgeleitet sind erfolgreich eingesetzt worden, um die Aufnahme von membrangebundenen Antigene von B-Lymphozyten ²³ zu studieren. Aber auch solcheMembranen nicht mit einer hochdynamischen Zytoskelett interagieren und bieten keine Flexibilität, wie sie durch eine starre Glasoberfläche unterstützt. Angesichts dieser Unterschiede besteht eindeutig ein Bedarf an Engineering SLBs, die Mittel bieten, um Proteine ​​in definierter Art und Weise compartmentalize und die durch Oberflächen einstellbare Flexibilität oder durch Oberflächen, die ihre Steifigkeit in Reaktion auf lokal angewendet Lichtpulse ändern unterstützt.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
#1.5 Objektträger	VWR	631-0853
250ml Rundkolben	VWR	201-1357
50:50 Strahlteilerwürfel	Thorlabs	BS013
Akusto-opitkaler Modulator C1205-2	Isomet-nur		bei Verwendung von CW-Lasern notwendig, die nicht modulierbar sind
Alexa Fluor 488-NHS	Lebenstechnologien	A-20000
Alexa Fluor 555-NHS	Life Technologies	A-20009
Alexa Fluor 647-NHS	Life Technologies	A-20006
Autoklavenband	VWR	489-1312	oder ein anderes hitzestabiles klebriges Klebeband
Avanti Mini-Extruder	Avanti Lipids	610000	Alternative zum Badbeschaller
Badsonicator QSONICA Q700	QSONICA	Q700
Strahlteiler	Cairn	P280/210/MLS
Bü chi Rotationsverdampfer	VWR	531-0837
Kamera	Andor	iXon Ultra 897	siehe Manuskripttext für Alternativen
konzentriertes Wasserstoffperoxid	Roth	9683.1
konzentrierte Schwefelsäure	Roth	X944.2
Epoxidkleber	Uhu	45705	Uhu plus sofortfest 2min
Filterrad	Sutter Instrumente	Lambda 10-2
LabTek Kammern	VWR	734-2062
Laser	Toptica-verschiedene		Varianten (Wellenlängen 375 - 785 nm) sind verfügbar
Objektiv	Thorlabs, Newport-DGS
NTA-Ni (Lipid)	Avanti Lipids	790404C	bereits in Choroform-gelöster ausgelieferter Version der nicekl-Salzvariante wird empfohlen
POPC (Lipid)	Avanti Lipide	850457C	bereits in Choroform-gelöster ausgelieferter Version wird empfohlen
Mikroskop Zeiss Axiovert 200		Zeiss-Spiegel
	Thorlabs	BB1-E02
optische Filter	AHF, Chroma, Semrock-Filter-Sets		sind für viele verschiedene Farbkombinationen erhältlich
Oszilloskop	BK Precision	2120C
phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Life technologies	14190-136	Entgasung vor Gebrauch
Periskop	Thorlabs	RS99/M
Picodent twinsil 22	Picodent	13001000	Alternative zum Epoxidleim-Leistungsmesser
Lasermate-Q	Coherent-jedes		im verwendeten Spektralbereich empfindliche Leistungsmesser ist geeignet
Impulsgeber	Stanford Research Systems	SRS DG535
räumlicher Filter	Thorlabs	KT310/M
Spritzenvorsatzfilter 0,2 & Mikro m	Millipore	GVWP04700
TIRF-fähiges Apochromat-Objektiv 100x, NA 1,46	Zeiss	440782-9800-000
Trichlormethan/Chloroform	Roth	3313.1
Röhrchen für die Ultrazentrifugation Polycarbonat 1,00 mm, 11 mm x 32 mm	Thermo Fisher	45237
Sorvall Ultrazentrifuge	Thermo Fisher	RC M150GX
Ultrazentrifugenrotor	Thermo Fisher	S120-AT2
UV-Spektralphotometer Nanodrop 2000c	Thermo Fisher-Vakuumpumpe
	VWR	181-0248