Methodenartikel

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen peripheren T-Zellen Mit Sendai Virus in Feeder-freien Bedingungen

DOI:

10.3791/53225

⸱

11. November 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Keio University School of Medicine, 2Department of Emergency and Critical Care Medicine, Keio University School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt, wie induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) aus menschlichen peripheren T-Zellen unter Feeder-freien Bedingungen unter Verwendung einer Kombination aus Matrigel- und Sendai-Virus-Vektoren, die Reprogrammierungsfaktoren enthalten, erzeugt werden.

Zusammenfassung

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Vor kurzem haben iPSCs Aufmerksamkeit als neue Quelle von Zellen für regenerative Therapien angezogen. Obwohl die ursprüngliche Verfahren zum Erzeugen iPSCs angeführten dermalen Fibroblasten durch invasive Biopsie und retrovirale genomische Insertion von Transgenen erhalten wird, hat es viele Bemühungen, diese Nachteile zu vermeiden. Menschliche periphere T-Zellen sind eine einzigartige Zellquelle zur Erzeugung von iPS-Zellen. iPSCs aus T-Zellen abgeleitet sind Neuanordnungen der T-Zell-Rezeptor (TCR) Gene und sind eine Quelle von Antigen-spezifischen T-Zellen. Zusätzlich haben die T-Zell-Rezeptor-Umlagerung in das Genom hat das Potential, einzelnen Zelllinien zu markieren und eine Unterscheidung zwischen transplantierten und Spenderzellen. Zum sicheren klinischen Anwendung iPSCs, ist es wichtig, um die Gefahr des Freilegens neu erzeugten iPSCs schädliche Mittel zu minimieren. Obwohl fötalem Rinderserum und Feeder-Zellen wurden wesentlich für pluripotente Stammzellen in Kultur ist es bevorzugt, sie aus dem Kultursystem zu entfernen, um das Risiko zu verringernunvorhersehbarer Pathogenität. Zur Lösung dieses Problems haben wir ein Protokoll zur Erzeugung iPSCs aus humanen peripheren T-Zellen unter Verwendung von Sendai-Virus, um das Risiko der Freigabe iPSCs undefinierte Pathogene reduzieren etabliert. Obwohl Umgang mit Sendai-Virus erfordert Geräte mit der entsprechenden Sicherheitsstufe, aktiviert Sendai Virus infiziert T-Zellen ohne Genom Insertion, noch mit hohem Wirkungsgrad. In diesem Protokoll zeigen wir die Erzeugung von iPSCs aus humanen peripheren T-Zellen in Feeder freien Bedingungen mit einer Kombination von aktivierten T-Zellkultur und Sendai-Virus.

Einleitung

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iPSCs haben beträchtliche Aufmerksamkeit als eine bahnbrechende Quelle von Zellen für die regenerative Medizin 1-3 angezogen. Bisher wurden verschiedene Methoden zur Erzeugung iPSCs wurde berichtet 4,5. Unter diesen haben iPSCs von menschlichen T-Zellen erzeugt von besonderem Interesse wegen der weniger invasiven Verfahren des Zellprobenahme 6-8 gewesen. Zusätzlich iPSCs von T-Zellen abgeleitet sind Neuanordnungen der T-Zell-Rezeptor (TCR) Gen und sind daher eine Quelle von Antigen-spezifischen T-Zellen 9,10. Daher Erzeugung T-Zell-abgeleiteten iPSCs sicher ist nützlich zur fortschreitenden regenerativen Medizin.

Dieses Verfahren basiert auf dem Konzept der Verringerung der Gefahr von unvorhersehbaren Pathogenität basiert. Zum sicheren klinischen Anwendung iPSCs ist es wichtig, um das Risiko der Exposition gegenüber Pathogenen 11 zu reduzieren. Zuvor in vielen Kultursystemen pluripotenter Stammzellen haben fötalem Rinderserum und Feeder-Zellen als wesentliche Reagenzien verwendetS12. Jedoch ist die Entfernung dieser beiden Reagenzien aus dem Kultursystem bevorzugt iPSC Generation, das Risiko von unvorhersehbaren Pathogenität zu reduzieren.

Zusätzlich hat dieses Verfahren den Vorteil, daß eine invasive Zellprobenahme von Patienten und mühsame Herstellung von feeder-Zellen. Da T-Zell-abgeleiteten iPSCs wurden bereits erfolgreich in Forschungs 13,14 verwendet wurde, ist dieses Verfahren ebenfalls anwendbar und nützlich für die Erzeugung krankheitsspezifische iPSCs von Patienten.

Unter T Reprogrammierung Verfahren unter Verwendung des Sendai-Virus (SeV) Vektor als ein Gen Fahrzeug ist ein Verfahren, das mit hoher Effizienz iPSCs 7,16 generieren kann. Darüber hinaus, da SeV ist ein Einzelstrang-RNA-Virus und keine DNA-Phase für die Replikation benötigen, die Nutzung im iPSC Generation vermeidet das Brechen des Wirtsgenom 17-19. Daher haben wir Protokolle zur Erzeugung iPSCs aus humanen peripheren T-Zellen in serum fr festee und Feeder-freien Bedingungen mit einer Kombination von Matrigel mTeSR Medium und SeV Vektoren.

Protokoll

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1. Bereiten Sie aktivierten humanen T-Zellen

  1. Sammeln Sie 10 ml heparinisiertes Vollblut von einem Spender durch Venenpunktion.
    1. Erhalten informierte Zustimmung der Spender vor der Venenpunktion. Venenpunktion müssen von qualifiziertem und geschultem Personal durchgeführt werden.
    2. Griff Blutproben mit steriler Ausrüstung und nach entsprechender Biosicherheit Richtlinien.
  2. Verdünnen von 10 ml heparinisiertes Vollblut mit 10 ml D-PBS (-).
  3. Setzen 15 ml Ficoll-Lösung (Ficoll-Paque PREMIUM) in ein neues 50 ml konischen Röhrchen.
  4. Schicht die 20-ml Blutlösung in Schritt 1.2 auf die Ficoll-Lösung in Schritt 1.3 vorbereitet. Mit einem elektrischen Pipette, lassen Sie Blutlösung in Schritt 1.2 laufen langsam entlang der Innenwand der Röhre hergestellt. Achten Sie darauf, das Blut-Lösung und Ficoll Lösung zu mischen.
  5. Zentrifuge bei 400xg 30 min bei RT. Stellen Sie die Schleuderverzögerungsgeschwindigkeit auf "langsam".
    Hinweis: Nach der Zentrifugation eine weiße dünneSchicht entsteht zwischen einer oberen milchig Plasmaschicht und eine untere klare Ficoll-Schicht. Dieser weiße dünne Schicht enthält mononuklearen Zellen.
  6. Übertragung der mononuklearen Zellschicht in ein neues 50 ml konischen Röhrchen mit einer 1-ml-Pipette. Achten Sie darauf, Ficoll-Lösung enthalten.
  7. Hinzufügen D-PBS (-) zu den mononuklearen Zellen auf ein Gesamtvolumen von 10 ml und Zentrifugation bei 200 × g für 5 min bei RT.
  8. Überstand verwerfen. 10 ml D-PBS (-) zu den mononuklearen Zellen und Zentrifugation bei 200 × g für 5 min bei RT.
  9. Überstand verwerfen, 1 ml KBM502 Medium, um den gesammelten mononuklearen Zellen, und zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer. Mehr als 5 x 10 6 mononuklearen Zellen aus 10 ml heparinisiertem Vollblut mit angemessene Trennung unter Verwendung von Ficoll gewonnen werden.
  10. Vorbereitung eines Anti-Mensch CD3-Antikörper-Lösung mit einer Konzentration von 10 ug / ml in D-PBS (-). Fügen Sie den Anti-Mensch-CD3-Antikörper-Lösung zu einer 6-Well-Platte, genießen die BrandungAss jede Vertiefung und inkubieren Sie die Schale bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Inkubator für mindestens 30 min.
  11. Entfernen Sie den Anti-Mensch-CD3-Antikörper-Lösung aus jeder Vertiefung und einmal mit D-PBS waschen (-) unmittelbar vor der Aussaat der Zellen.
  12. Samen mononukleären Zellen, die in Schritt 1,9 bei einer Dichte von 2,5 × 10 5 Zellen / cm 2 an den Anti-Human-CD3-Antikörper-beschichtete Platten mit 6 Vertiefungen in KBM502 Medium hergestellt wurden. Bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Inkubator für 3-7 Tage ohne Mediumwechsel, bis die T-Zellen Konfluenz erreichen. T-Zellen in dieser Zeit sind beide suspendiert und adhärenten Zellen.

2. Infect menschlichen T-Zellen mit SeV Vektoren

  1. Nach 3-7 Tagen Kultur, sammeln die aktivierten T-Zellen mit den bestehenden Medium durch Pipettieren. Übertragung auf einen 15 ml konischen Röhrchen und Zentrifugieren bei 200 × g für 5 min bei RT.
  2. Entfernen Sie den Überstand und 1 ml frisches KBM502 Medium. Zählen Sie die Zellen und die Platte 1.5 × 10 6 Zellen (in 2 ml frisches Medium KBM502) in jede Vertiefung eines Anti-CD3-Antikörper-beschichteten 6-Well-Platte.
  3. Auftauen SEV Lösungen OCT3 / 4-SeV / TSΔF, SOX2-SeV / TSΔF, KLF4-SeV / TSΔF und c-MYC (HNL) -SeV / TS15ΔF auf Eis.
  4. Fügen Sie die SeV Lösungen, die OCT3 / 4-SeV / TSΔF, SOX2-SeV / TSΔF, Klf4-SeV / TSΔF und c-MYC (HNL) -SeV / TS15ΔF einzeln in die Vertiefungen, die jeweils bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) 10. Inkubieren bei 37 ° C in einem 5% -CO 2 -Inkubator für weitere 24 hr.

3. Entfernen Sie SeV Vektoren von menschlichen T-Zellen

  1. 24 Stunden nach der Infektion, sammeln Sie die infizierten Zellen mit einer Pipette. Wenn es anhaftenden Zellen, können sie leicht abgenommen Pipettieren von ihnen mehrmals nach oben und unten ist. Übertragung auf einen 15 ml konischen Röhrchen und Zentrifugieren bei 200 × g für 5 min bei RT.
  2. Entfernen Sie die Überstand, der die SeV-Vektoren und 2 ml frischem KBM502 Medium. Ausstrich Zellen in each der Vertiefungen. Inkubieren bei 37 ° C in einem 5% -CO 2 -Inkubator für zusätzliche 24 Std.

4. Reseed Cells auf einem Matrigel Schicht

  1. Bereiten Basalmembranmatrix Lösung durch Auftauen Matrix-Gel (finden Sie in der Materialliste für die jeweilige Marke in dieser Studie verwendet) bei 4 ° C und Auflösen von 0,2 ml in 10 ml DMEM / F12-Medium.
    Hinweis: Matrix-Gel (finden Sie in der Materialliste für die jeweilige Marke in dieser Studie verwendet) muss O / N bei 4 ° C aufgetaut, um vollständig aufgetaut werden. Halten Sie es auf Eis, bis kurz vor der Verwendung.
  2. Platte 5 ml Basalmembranmatrix Lösung pro Schale in 100 mm-Schalen und lassen bei RT für mindestens 30 min vor der Aussaat Zellen. Mindestens zwei 100-mm-Schalen werden für ein Experiment benötigt wird.
  3. Sammeln SeV-infizierten Zellen durch Pipettieren, Übertragung auf einen 15-ml konischen Röhrchen und Zentrifuge bei 200 xg für 5 Minuten bei RT.
  4. Entfernen Sie den Überstand und 1 ml frisches KBM502 Medium. Zählen Sie die Anzahl der cells mit einer Zählkammer, entfernen Sie die Basalmembran-Matrix-Lösung von 100-mm-Schalen in Schritt 4.2 und platte 1 × 10 5 und 1 × 10 6 Zellen (in 10 ml frischem mTeSR mittel) auf einem 100-mm Basalmembranmatrix beschichtet Geschirr. Schließlich verwenden Sie die Platte, in der Kolonien werden leicht aufgenommen.
  5. Inkubieren der Schale bei 37 ° C in einem 5% -CO 2 -Inkubator O / N.
  6. Ändern Sie das Medium auf 10 ml Medium mTeSR Fleisch jeden zweiten Tag.
    Hinweis: ca. 20-30 Tage nach der Infektion, Kolonien, die sehr ähnlich sind embryonale Stammzellen (ESC) wird angezeigt.

5. Erweitern Sie T-Zellen abgeleiteten iPSCs

  1. Bereiten Basalmembranmatrix Lösung durch Auftauen Matrix-Gel (finden Sie in der Materialliste für die jeweilige Marke in dieser Studie verwendet) bei 4 ° C und Auflösen von 0,2 ml in 10 ml DMEM / F12-Medium.
  2. Platte 1 ml der Basalmembran Matrixlösung pro Well in einer 6-Well-Platte und lassen bei RT für zuminmindestens 30 min vor Kommissionierung Kolonien.
  3. Füllen Sie einen 96-Loch-Platte mit 20 ul mTeSR Medium pro Vertiefung.
  4. Wählen Kolonien, die Wirtschafts- und Sozialräte unter dem Stereomikroskop mit einer 20 & mgr; l-Pipette ähneln.
    Hinweis: Die Kolonien der WSR und iPSCs sind rund und flach, wie in 1B gezeigt.
  5. Transfer ausgewählten Kolonien in die 96-Lochplatte mit mTeSR Medium in Schritt 5.3 gefüllt.
  6. Fügen Sie 200 ul mTeSR Medium in jede Vertiefung pipettieren und vorsichtig nach oben und unten, um die Kolonie zu kleinen Klumpen unter dem Stereomikroskop mit einer 200 ul Pipetten brechen. Entfernen Sie die Basalmembran-Matrix-Lösung aus dem gut vorbereitet in 5.2 und legte jede Kolonie in eine Vertiefung der Basalmembran-Matrix beschichteten 6-Well-Platte mit 2 ml mTeSR Medium pro Vertiefung.
  7. Ändern Sie den mittleren bis 2 ml mTeSR Medium Fleisch jeden zweiten Tag.

6. Pflegen Sie T-Zellen abgeleiteten iPSCs

Die T-Zellen abgeleiteten iPSCs aufrechterhalten werden kannund gespeichert mit den gleichen Techniken wie für den menschlichen iPS-Zellen und menschlichen WSR. Sobald iPSC Kolonien heranwachsen, erweitern sie in größere Gerichte Wiederholung des gleichen Verfahrens.

  1. Ändern Sie den mTeSR Medium alle 1-2 Tage.
  2. Wenn die Kolonien konfluent werden alle 5-7 Tage, Durchgang die Zellen unter Verwendung Dissoziationslösung für den menschlichen iPS-Zellen und menschlichen Wirtschafts- und Sozialräte gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Ergebnisse

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Unter Verwendung dieses Protokolls können Benutzer iPSCs aus humanen peripheren T-Zellen in stabiler Weise zu erzeugen. iPSC Erzeugung von T-Zellen mit SeV und Matrigel zeigte etwa 0,002%. - 0,005% der Effizienz der Reprogrammierung zwischen mehreren Geber Fälle und SeV wurden nach mehreren Passagen nicht erkannt 16 1A zeigt eine schematische Darstellung des Protokoll zur Erzeugung von T-Zellen abgeleiteten iPSCs in Feeder freien Bedingungen unter Verwendung von Matrigel und mTeSR Medium. Ca. 20-30 Tage nach Infektion mit SeV werden iPSC Kolonien von ihren ESC-Kolonie-Morphologie (Abbildung 1B) anerkannt. Immunfluoreszenzfärbung zeigte die Expression von typischen pluripotenten Zellmarker (NANOG, OCT3 / 4, SSEA4, TRA-1-60 und TRA-1-81) in T-Zell-abgeleitete iPSCs erzeugt unter Zuführung freien Bedingungen (Abbildung 1c).

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Figur 1 (A): Ein Schema des Protokolls für eine Neuprogrammierung T-Zellen unter Zuführung freien Bedingungen in dieser Studie. (B): Eine typische ESC-ähnliche iPSC Kolonie an Tag 27 nach der Blutentnahme unter Zuführung freien Bedingungen. (C): ALP-Färbung und Immunfluoreszenzfärbung für Pluripotenz und Oberflächenmarker (NANOG, OCT3 / 4, SSEA4, TRA-1-60 und TRA-1-81) in T-Zell-abgeleitete iPSCs erzeugt unter Zuführung freien Bedingungen. Bitte Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Diskussion

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Wir beschreiben ein Protokoll zur Generierung von iPSCs aus humanen peripheren T-Zellen unter serum- und feederfreien Bedingungen unter Verwendung einer Kombination aus Matrigel, mTeSR-Medium und SeV-Vektoren. Für klinische Anwendungen von iPS-Zellen ist es wichtig, ein Protokoll zur stabilen Erzeugung von iPS-Zellen und eine weniger invasive Methode zur Zellprobenahme zu haben. Obwohl die Erzeugung von iPS-Zellen mit der Kombination von Matrigel und mTeSR-Medium eine geringere Reprogrammierungseffizienz aufwies als die mit Knockout-Serum-Ersatzmedium (KSR) und Feeder-Zellen, erreicht diese Kombination eine stabile Generierung von iPS-Zellen von Spendern16. Eine stabile iPS-Erzeugung und eine weniger invasive Zellprobenahme haben den Vorteil, dass die Anzahl der Spender für die iPS-Erzeugung erhöht werden kann.

SeV-Vektoren, ein Minusstrang-RNA-Virus, ist nicht in das Wirtsgenom integriert. Daher können die Risiken der Tumorgenese im Schritt der Induktion des Reprogrammierungsfaktors20-24 vermieden werden. Darüber hinaus ermöglichen die feederfreien Bedingungen, bei denen eine Kombination aus definiertem Kulturmedium und Matrigel anstelle einer Feederschicht verwendet wird, die potenziellen Risiken einer Exposition gegenüber unbekannten exogenen Faktoren. Die Fusion dieser Techniken bietet eine weniger invasive und sicherere iPS-Technologie für die regenerative Medizin16.

Wichtige Schritte in diesem Protokoll sind der Schritt der Aktivierung menschlicher T-Zellen (Schritt 1) und der Infektion mit SeV-Vektoren (Schritt 2). Wenn zu einem optimalen Zeitpunkt nach der SeV-Infektion keine ESC-ähnliche Kolonie in der Kulturschale erhalten wird, sollte Folgendes in Betracht gezogen werden. Erstens ist die Konfluenz der mononukleären Zellen vor der T-Zell-Aktivierung möglicherweise nicht geeignet, da eine optimale Aktivierung der T-Zellen für die SeV-Infektion entscheidend ist25,26. Eine zu hohe Dichte an mononukleären Zellen führt zum Zelltod, was die ordnungsgemäße Aktivierung der T-Zellen beeinträchtigt. Eine zu geringe Dichte von mononukleären Zellen stört auch die ordnungsgemäße Aktivierung und Proliferation von T-Zellen. Daher sollte die Konfluenz von mononukleären Zellen überprüft und entsprechend angepasst werden. Zweitens ist die Dosierung von SeV-Vektoren möglicherweise nicht ausreichend. Die Induktionseffizienz von iPS-Kolonien hängt von der Dosierung des Virusab 6. Wenn nach SeV-Infektion keine ESC-ähnliche Kolonie beobachtet wird, sollte die Option einer Erhöhung der Virusdosis bis zu einem MOI von 15-20 in Betracht gezogen werden. Wenn Anzeichen einer Differenzierung der iPS-Kolonie beobachtet werden, kann die Häufigkeit, mit der das Medium gewechselt wird, bis zu jedem zweiten Tag oder auf jeden Tag, wenn die Kolonien größer sind, erhöht werden.

Die Einschränkung in diesem Protokoll besteht darin, dass diese Methode nicht virenfrei ist. Obwohl SeV für die Zellreprogrammierung problemlos im Handel erhältlich ist, müssen die Benutzer die Geräte entsprechend dem entsprechenden Biosicherheitsniveau vorbereiten. Als weitere Methode zur Erzeugung integrationsfreier iPSCs wurden bisher episomale Vektoren verwendet27-29. Obwohl episomale Vektoren mit Geräten mit einem geringeren Maß an biologischer Sicherheit verwendet werden können, können episomale Vektoren mit extrem geringen Raten in das Wirtsgenom eindringen. Daher sind zusätzliche Kontrollen erforderlich, um das Verschwinden von Transgenen zu bestätigen, wie bei der Anwendung von SeV.

Es gibt eine weitere Einschränkung darin, dass diese Technik nicht völlig frei von tierischen Produkten ist. Einige Substrate, wie z. B. Matrigel, Anti-CD3-mAb, Dissoziationslösung und SeV-Lösung, werden aus tierischen Produkten gewonnen und sind daher mit einem Risiko der Übertragung xenogener Krankheitserreger verbunden. Die Reduktion von tierischen Substraten im Kultursystem ist jedoch aufgrund des geringeren Risikos für die klinische Anwendung der iPSC-Technologie sinnvoll.

Offenlegungen

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Die Autoren haben keine konkurrierenden oder widerstreitende Interessen offen zu legen.

Danksagungen

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Wir bedanken uns bei Yoshiko Miyake, Sayaka Kanaami, Chihana Fujita, Miho Yamaguchi, Natsuko Henmi und Rei Ohno von der Keio University School of Medicine, um technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde teilweise durch einen R & D Systems Support-Programm, um die praktische Nutzung von Gesundheitsforschungsergebnissen zu beschleunigen, und die Autobahn-Programm für die Realisierung von regenerativen Medizin gefördert.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Ficoll-Paque PREMIUMGE Healthcare17-5442-02
Aufgereinigte NA/LE-Maus Anti-Human-CD3BD Pharmingen555336
Rinderalbuminfraktion V-LösungGibco15260-037
mTeSR1 Medium KitSTEM CELL5850Vor Gebrauch bei Raumtemperatur erwärmen
DissoziationslösungReproCELLRCHETP002
D-PBS(–)Wako045-29795
SeV-Vektorkit CytoTune-iPS ver.1.0DNAVECDV-0303cVor Gebrauch auf Eis auftauen
100-mm-Gewebekulturschale Falcon353003
96-Well-GewebekulturplatteFalcon353078
6-Well-GewebekulturplatteFalcon353046
15  ml ZentrifugenröhrchenGreiner Bio-One188271
50  ml ZentrifugenröhrchenGreiner Bio-One227261

Referenzen

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Aktivierte T ZellkulturT Zell Rezeptor UmlagerungBasalmembranmatrixM T E S R Mediumpluripotente Zellmarkerimmunfluoreszenzmikroskopische F rbung

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