Eine schnelle und quantitative fluorimetrische Verfahren zur Protein-Targeting kleines Molekül als Wirkstoff-Screening

Zusammenfassung

Ein Protokoll für das Screening kleiner molekularer Wirkstoffe, das auf der In-situ-Synthese von ultrakleinen fluoreszierenden Gold-Nanoclustern (Au-NCs) unter Verwendung von wirkstoffbeladenen Proteinen als Template basiert, wird vorgestellt. Diese Methode ist einfach, um die Bindungsaffinität von Wirkstoffen an ein Zielprotein durch ein sichtbares Fluoreszenzsignal zu bestimmen, das von den Protein-Template-Au-NCs emittiert wird.

Zusammenfassung

Zeigen wir eine neue Wirkstoff-Screening-Verfahren zur Bestimmung der Bindungsaffinität von kleinen Arzneimittelmolekülen an ein Zielprotein durch Bilden Fluoreszenzgoldcluster (Au NCs) innerhalb der mit Wirkstoff beladenen Proteins, basierend auf den Differenzfluoreszenzsignal von der Au NCs emittiert. Albuminproteine ​​wie humanes Serumalbumin (HSA) und Rinderserumalbumin (BSA) als die Modellproteinen ausgewählt ist. Vier kleinen Molekular Medikamente (zum Beispiel Ibuprofen, Warfarin, Phenytoin und Sulfanilamid) unterschiedlicher Bindungsaffinitäten zur Albumin-Proteine ​​getestet. Es wurde gefunden, daß die Bildungsrate von fluoreszierenden Au NCs Inneren Wirkstoff beladen Albuminprotein unter denaturierenden Bedingungen (dh 60 ° C oder in Gegenwart von Harnstoff) langsamer ist als die in dem ursprünglichen Protein (ohne Arzneimittel) gebildet. Darüber hinaus ist die Fluoreszenzintensität der so gebildeten Nanokristalle festgestellt wird, umgekehrt an die Bindungsaffinitäten dieser Medikamente auf die Albuminproteine ​​korreliert werden. Insbesondereje höher die Drogen-Protein-Bindungsaffinität, desto langsamer die Rate der Au NCs-Bildung und damit eine niedrigere Fluoreszenzintensität der erhaltenen Au NCs beobachtet. Die Fluoreszenzintensität der erhaltenen Au NCs stellt daher ein einfaches Maß der relativen Bindungsstärke von verschiedenen Medikamenten getestet. Dieses Verfahren ist auch erweiterbar auf die spezifischen Drogen-Protein-Bindungskonstante (K _D), die durch einfache Variation der Wirkstoffgehalt im Protein an einer festen Proteinkonzentration vorbelastet messen. Die gemessenen Ergebnisse entsprechen auch die Verwendung anderer Prestige, sondern komplizierter Verfahren erhaltenen Werte.

Einleitung

Serum Albumine, wie Humanserumalbumin (HSA) und Rinderserumalbumin (BSA) sind das häufigste Protein im Plasma und spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der osmotische Druck der Blutkammer. Sie werden auch als Trägerproteine ​​für kleine Moleküle mit geringer Wasserlöslichkeit, wie Steroiden, Fettsäuren, Schilddrüsenhormone, und eine Vielzahl von Medikamenten erkannt. Die Bindungseigenschaft (beispielsweise Bindungsstellen, Bindungsaffinität oder die Stärke) dieser Moleküle an Albumine im Serum bildet ein wichtiges Thema in der Pharmakokinetik. ^1-4 mehrere Analyseverfahren entwickelt worden, um die Bindungseigenschaften von ver....

Protokoll

Achtung: Bitte beachten Sie die Sicherheitsdatenblätter (SDS) der beteiligten Chemikalien vor Gebrauch. Das Wirkstoff-Screening-Experiment beinhaltet die Synthese und Umgang mit Nanomaterialien, die im Vergleich zu ihren Groß Pendant zusätzlichen Gefahren verursachen. Stellen Sie sicher, alle erforderlichen Kontrollmaßnahmen, um während des Experiments durchgeführt werden, einschließlich der Verwendung von technischen Massnahmen verwendet (Abzug) und persönliche Schutzausrüstung (PSA, beispielsweise Sicherheitslänge Hosen, geschlossene Schuhe, chemikalienbeständige Handschuhe und Schutzbrille).

1. Herstellung von chemischen Reagenz....

Ergebnisse

Proteinentfaltung ist ein wichtiges Verfahren für die Bildung von Protein-gestützten Au NCs, da mehr reaktive funktionelle Gruppen (zB Tyrosin) eines Proteins, um die eingekapselte Au Ionen zu reduzieren und damit Beschleunigung der Bildungsgeschwindigkeit von Au NCs ausgesetzt werden. Heiz- und externen Denaturierungsmitteln gibt zwei übliche Mittel, um das Protein Entfaltungsvorgangs zu fördern. Figur 1 zeigt die Wirkung von Erhitzen und Hinzufügen externer Denaturierungsmitteln auf die Kinet.......

Diskussion

Es gibt mehrere wichtige Schritte, die in diesem Verfahren markiert werden müssen. In das Protokoll der Screening der relativen Bindungsaffinität von verschiedenen kleinen molekularen Drogen, Schritte 3.1.2, 3.1.3 und 3.1.4 sind entscheidend für gute Ergebnisse zeigt einheitlichen Trend für die relative Bindungsstärke zu erhalten. In diesen Schritten, sollten die Maßnahmen der Zugabe von Chemikalien und Darstellung von Reaktionslösungen für die Messung, so schnell wie möglich sein, um die Zeitverzögerung Wirkung und die.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Gold(III)-chlorid-Lösung, 30%	Sigma-Aldrich	484385	ätzendes, reizendes
Serumalbumin beim Menschen, 96%	Sigma-Aldrich	A1887
Rinderserumalbumin, 96%	Sigma-Aldrich	A2153
Ibuprofen, 98%	Sigma-Aldrich	I4883
Warfarin, 98	% Sigma-Aldrich	A2250
Phenytoin	Sigma-Aldrich	PHR1139
Sulfatistilamid, 99	% Sigma-Aldrich	S9251
Dimethylsulfoxid	Sigma-Aldrich	D8418
Harnstoff	Sigma-Aldrich	U5128
Natriumhydroxid	Sigma-Aldrich
Magnetrührer	IKA	RT5
Mikrotiterplatten-Reader	Tecan	Infinite M200
384-Well-Platte	Corning
5 ml Luftverdrängerpipette	Eppendorf
1.000 μ l Luftverdrängerpipette	Eppendorf
100 μ l Luftverdrängerpipette	Eppendorf
5.000 μ l Eppendorf Spitzen
1.000 μ l Eppendorf Spitzen
100 μ l Eppendorf Spitzen
1,5 ml Mikroröhrchen	Eppendorf
20 ml Glasfläschchen mit Schraubverschluss
4 ml Glasfläschchen mit Schraubverschluss