Methodenartikel

Eine schnelle und quantitative fluorimetrische Verfahren zur Protein-Targeting kleines Molekül als Wirkstoff-Screening

DOI:

10.3791/53261

⸱

16. Oktober 2015

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Materials Research and Engineering, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), 2School of Chemical & Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Ein Protokoll für das Screening kleiner molekularer Wirkstoffe, das auf der In-situ-Synthese von ultrakleinen fluoreszierenden Gold-Nanoclustern (Au-NCs) unter Verwendung von wirkstoffbeladenen Proteinen als Template basiert, wird vorgestellt. Diese Methode ist einfach, um die Bindungsaffinität von Wirkstoffen an ein Zielprotein durch ein sichtbares Fluoreszenzsignal zu bestimmen, das von den Protein-Template-Au-NCs emittiert wird.

Zusammenfassung

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Zeigen wir eine neue Wirkstoff-Screening-Verfahren zur Bestimmung der Bindungsaffinität von kleinen Arzneimittelmolekülen an ein Zielprotein durch Bilden Fluoreszenzgoldcluster (Au NCs) innerhalb der mit Wirkstoff beladenen Proteins, basierend auf den Differenzfluoreszenzsignal von der Au NCs emittiert. Albuminproteine ​​wie humanes Serumalbumin (HSA) und Rinderserumalbumin (BSA) als die Modellproteinen ausgewählt ist. Vier kleinen Molekular Medikamente (zum Beispiel Ibuprofen, Warfarin, Phenytoin und Sulfanilamid) unterschiedlicher Bindungsaffinitäten zur Albumin-Proteine ​​getestet. Es wurde gefunden, daß die Bildungsrate von fluoreszierenden Au NCs Inneren Wirkstoff beladen Albuminprotein unter denaturierenden Bedingungen (dh 60 ° C oder in Gegenwart von Harnstoff) langsamer ist als die in dem ursprünglichen Protein (ohne Arzneimittel) gebildet. Darüber hinaus ist die Fluoreszenzintensität der so gebildeten Nanokristalle festgestellt wird, umgekehrt an die Bindungsaffinitäten dieser Medikamente auf die Albuminproteine ​​korreliert werden. Insbesondereje höher die Drogen-Protein-Bindungsaffinität, desto langsamer die Rate der Au NCs-Bildung und damit eine niedrigere Fluoreszenzintensität der erhaltenen Au NCs beobachtet. Die Fluoreszenzintensität der erhaltenen Au NCs stellt daher ein einfaches Maß der relativen Bindungsstärke von verschiedenen Medikamenten getestet. Dieses Verfahren ist auch erweiterbar auf die spezifischen Drogen-Protein-Bindungskonstante (K D), die durch einfache Variation der Wirkstoffgehalt im Protein an einer festen Proteinkonzentration vorbelastet messen. Die gemessenen Ergebnisse entsprechen auch die Verwendung anderer Prestige, sondern komplizierter Verfahren erhaltenen Werte.

Einleitung

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Serum Albumine, wie Humanserumalbumin (HSA) und Rinderserumalbumin (BSA) sind das häufigste Protein im Plasma und spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der osmotische Druck der Blutkammer. Sie werden auch als Trägerproteine ​​für kleine Moleküle mit geringer Wasserlöslichkeit, wie Steroiden, Fettsäuren, Schilddrüsenhormone, und eine Vielzahl von Medikamenten erkannt. Die Bindungseigenschaft (beispielsweise Bindungsstellen, Bindungsaffinität oder die Stärke) dieser Moleküle an Albumine im Serum bildet ein wichtiges Thema in der Pharmakokinetik. 1-4 mehrere Analyseverfahren entwickelt worden, um die Bindungseigenschaften von verschiedenen Medikamenten zu untersuchen Albumine im Serum, beispielsweise Röntgenkristallographie, 5,6 kernmagnetische Resonanz (NMR), 7-11 und Oberflächenplasmonresonanz (SPR), 12,13 usw. Jedoch sind diese Verfahren entweder durch eine mühsame und zeitraubende Analyseprozess ist (Zwangs zB Wachstum von Einkristall-Röntgen kristalloGrafik-Studie), Erfordernis spezialisierte und teure Ausrüstung (SPR), oder in der Notwendigkeit von teuren Isotopenmarkierung (NMR) für die Erkennung. Es ist daher höchst wünschenswert, alternative Möglichkeiten zur kleinen molekularen Wirkstoff-Screening auf eine schnelle, unkomplizierte und kostengünstige Art und Weise zu entwickeln.

Gold-Nanocluster (Au ​​NCs) sind eine spezielle Art von Nanomaterialien, die mehrere Zehnmetallatome mit einer Größe von weniger als 2 nm. 14-17 Sie haben umfangreiche Forschungsinteressen zogen enthalten aufgrund ihrer diskreten und größenabhängige elektronische Struktur, 18, 19 und molekularartigen Absorptionen und Emissionen. 20-23 Solche einzigartigen Materialeigenschaften, insbesondere die starke Fluoreszenz, haben diverse Anwendungen wie Sensorik und Bildgebung in biologischen Systemen. 24-32 Ultrasmall Fluoreszenz Au NCs können mit Hilfe der funktionellen Proteine ​​synthetisiert werden gefunden, wie Serumalbumine, als Vorlage. 33 In einem typischen Protein-gestützten Synthese Au NCs, eine bestimmte Menge an Au-Salze werden zunächst innerhalb der Protein eingekapselt und anschließend durch das Protein selbst reduziert. Die reduzierende Fähigkeit des Proteins zugeschrieben wird, um funktionelle Aminosäurereste (zB Tyrosin), die durch eine Erhöhung des pH-Lösung alkalisch aktivierbaren Bestandteil enthält. Entfaltung der Proteinstruktur wird als ein kritischer Schritt für die Bildung von Au NCs betrachtet. Dies liegt daran, dass in einem ungefalteten Protein kann mehrere Reduktions funktionellen Gruppen zu den eingekapselten Au-Salzen ausgesetzt werden. Proteinentfaltung kann durch Wärmebehandlung oder durch Einwirkung von Denaturierungsmitteln erfolgen. Einführung von kleinen Molekül Medikamente können auch auf den Entfaltungsvorgang, dh Änderung der Mittelpunkt Denaturierungstemperatur und die Enthalpie der Entfaltung. 34,35 die Wirkung aller dieser Faktoren kann wiederum durch die Bildungskinetiken fluoreszierender Au NCs reflektiert und manifestieren die Fluoreszenzintensität der resultierenden Au NCs. 36

e_content "> Das Video zeigt das Verfahren zum Wirkstoff-Screening durch Synthetisieren Au NCs mit Wirkstoff beladenen Albuminproteine ​​bei einer höheren Temperatur (60 ° C) oder in Gegenwart denaturierender Agenzien (zB Harnstoff). Die Fluoreszenzintensität der resultierenden Au NCs ist die Signalauslese. Zuerst Au NCs werden HSA und BSA-Vorlagen, auf 60 ° C oder in Gegenwart von Harnstoff behandelt wird synthetisiert, um zu zeigen, wie Proteinentfaltung (durch Wärmebehandlung oder Denaturierungsmitteln induziert) wirkt sich auf die Bildung Kinetik Au NCs. Zweitens Au NCs in Protein-Vorlagen mit unterschiedlichen Medikamenten vorbelastet synthetisiert und die Wirkstoffbeladung auf die relative Fluoreszenzintensitäten von resultierenden Au NCs sucht wird, das die Messung der relativen Bindungsstärke bereitzustellen. Schließlich wird der Au-NC-Wirkstoff-Screening-Protokoll für die modifizierte quantitative Messung der Wirkstoff-Protein-Bindungskonstante (K D) durch Variieren der Arzneistoffgehalt in dem Protein von einer festen Konzentration vorgespannt.

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Protokoll

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Achtung: Bitte beachten Sie die Sicherheitsdatenblätter (SDS) der beteiligten Chemikalien vor Gebrauch. Das Wirkstoff-Screening-Experiment beinhaltet die Synthese und Umgang mit Nanomaterialien, die im Vergleich zu ihren Groß Pendant zusätzlichen Gefahren verursachen. Stellen Sie sicher, alle erforderlichen Kontrollmaßnahmen, um während des Experiments durchgeführt werden, einschließlich der Verwendung von technischen Massnahmen verwendet (Abzug) und persönliche Schutzausrüstung (PSA, beispielsweise Sicherheitslänge Hosen, geschlossene Schuhe, chemikalienbeständige Handschuhe und Schutzbrille).

1. Herstellung von chemischen Reagenzien für die Drug Screening

  1. Vorprodukte für Au-NCs Synthese
    1. Auflösen 30 mg Gold (III) chlorid-Lösung (99,99% Spurenmetalle Basis, 30 Gew.% In verdünnter HCl) in 6,9 ml Reinstwasser zur Vorbereitung 15 mM von Gold (III) -chlorid-Lösung. Achtung: Goldchloridlösung ist ätzend und reizend. Tragen Sie angemessene PPE, um den direkten Kontakt mit Augen und der Haut vermeiden.
    2. Dissolve 74 mg HSA oder BSA in 1 ml hochreinem Wasser bis 74 mg / ml Protein-Stammlösung vorzubereiten.
  2. Arzneimittellösungen
    1. Lösen die gewünschte Menge des Arzneimittels, zum Beispiel 1,9 mg für (a) Ibuprofen, 2,8 mg (b) Warfarin, 2,3 mg (c) Phenytoin und 1,5 mg für (d) Sulfanilamid werden in 20 ul DMSO zu 450 mm herzustellen der Arzneimittelstammlösungen.
      Anmerkung: DMSO als Lösungsmittel gewählt, da diese Arzneimittel sind hydrophob und haben eine schlechte Löslichkeit in Wasser.
  3. Andere Reagenzien
    1. Man löst 600 mg NaOH-Plätzchen in 10 ml Reinstwasser herzustellen 1,5 M NaOH-Lösung. Man löst 2,4 g Harnstoff in 2 ml hochreinem Wasser zur Vorbereitung 20 M Harnstofflösung.

2. Synthese von Protein-gestützte Au NCs

  1. HSA-gestützten Au NCs (HSA-Au-NCs)
    1. Legen Sie zwei Glasfläschchen, die jeweils eine Mikro Magnetrührstab in ihm, auf zwei getrennten Temperatur steuerbaren Magnetrührstabsteller.
    2. Stellen Sie die Temperatur von einem Magnetrührer bis 60 ° C, und beschriften Sie die Glasfläschchen auf es als "60 ° C"; während die andere Magnetrührer bei Raumtemperatur (RT), wobei die Glasfläschchen auf es wird als "RT" bezeichnet gehalten.
    3. Mit 200 ul HSA-Lösung wurden 200 ul ultrareinem Wasser, und 200 ul der Gold (III) -chlorid-Lösung in jedes Röhrchen unter konstantem Rühren (als 360 UpM, wenn nicht anders angegeben), um die Einkapselung des Au-Ionen in der Proteintemplats ermöglichen.
    4. 2 Minuten später werden 20 ul NaOH-Lösung in jedes Röhrchen, um so die Reduktionsfähigkeit von HSA bei der Bildung Au NCs aktivieren und um die Reaktionszeit 0 min aufzeichnen.
    5. Alle 20 Minuten, ziehen 50 ul-Lösungen von jedem der Probe auf eine 384-Well-schwarze Platte und Messung der Emissionsspektrum mit einem Mikroplatten-Reader. Die typische Scan-Setup: λ ex = 370 nm, λ em = 410 bis 850 nm.
    6. Stoppen Sie den Magnetrührer nach 100 min.
    7. Cool down der Glasfläschchen unter fließendem Wasser in ein Waschbecken. Achtung: Die Glasflaschen sind heiß. Tragen Sie hitzebeständige Handschuhe, um Verbrennungen zu vermeiden.
    8. Zeichnen Sie die Photoemissionsspektren zu jeder Zeit für jede Probe, um die Bildung Kinetik der Au NCs an verschiedenen Temperaturbedingungen zu erwerben.
  2. BSA-gestützten Au NCs (BSA-Au-NCs)
    1. Legen Sie ein Glasfläschchen, die eine Mikro Magnetrührstab auf der Oberseite der einen Magnetrührer. Lassen Sie die Temperatur als Raumtemperatur.
    2. Mischungs 200 ul BSA-Lösung, 200 & mgr; l Harnstoff und 200 & mgr; l von Gold (III) -chlorid-Lösung in dem Glasfläschchen unter konstantem Rühren.
    3. 2 Minuten später, fügen Sie 20 ul NaOH-Lösung, um die Verringerung der Fähigkeit der BSA zu aktivieren, um Au-NCs bilden, und starten Sie die Reaktionszeit als 0 min aufzuzeichnen. Messen die Photoemissionsspektrum der Reaktionsmischung pro Stunde.
      Hinweis: Die Photoemissionsspektrum der BSA-Au-Nanokristallen wird gemessenweniger häufig, weil die Bildungsgeschwindigkeit von BSA-Au NCs ist langsamer als die des HSA-Au auf der gleichen Temperatur durch geringere Wirksamkeit von Harnstoff, um das Protein zu entfalten.
    4. Stoppen Sie den Magnetrührer nach 7 Std. Zeichnen Sie die Photoemissionsspektren zu jeder Zeit, um die Bildung Kinetik der Au NCs durch Harnstoff Denaturierung zu sehen.

3. Kleine Molecular Drug Screening

  1. Screen relative Bindungsaffinität von verschiedenen kleinen molekularen Drogen, um HSA
    1. Platzieren fünf Glasampullen, die jeweils einen magnetischen Rührstab in ihr, auf einer Temperatur steuerbares Mehr Magnetrührer. Beschriften Sie diese Ampullen als, b, c und jeweils für jedes Medikament, nämlich Ibuprofen, Warfarin, Phenytoin und Sulfanilamid d. Beschriften Sie die man mit reinem HSA als Kontrolle.
    2. Fügen Sie 200 ul von HSA in jedes Fläschchen. 1 & mgr; l Arzneimittellösung auf die vier entsprechenden Durchstechflaschen. 1 & mgr; l DMSO zu der Kontrolle. Schalten Sie das Rührgerät stellen und das Schleuderdrehzahl auf 360min und Inkubation für 1 Stunde, damit das Medikament Bindung an HSA in Anspruch.
    3. 1 h später mit 200 & mgr; l Milli-Q-Wasser und 200 ul der Gold (III) -chlorid-Lösung in jedes Röhrchen unter konstantem Rühren. Die Temperatur auf 60 ° C unter konstantem Rühren für 10 min. Mit 20 & mgr; l von 1,5 M NaOH zu jedem Gefäß und beginnt mit der Reaktionszeit 0 min aufzeichnen.
    4. Ziehen schnell 50 ul Lösung aus jedem Fläschchen zu einer 384-Well-schwarze Platte und Messung der Emissionsspektrum (Ergebnisse in 0 min beschriftet). Aufzeichnung der Emissionsspektren von jeder Probe alle 10 min. Sammeln mindestens vier Spektren, die bei vier verschiedenen Zeit, das heißt 0, 10, 20 und 30 min.
    5. Wiederholen Sie die Schritte 3.1.1 - 3.1.4 mehrmals, um Ergebnisse mit einer konsistenten Trend zu erhalten. Stoppen Sie den Magnetrührer.
    6. Zeichnen Sie die zeitaufgelöste Photoemissionsspektren für jede Probe (A - D und Kontrolle). Identifizieren Sie die Spitzenintensität aller Proben und Verschwörung gegen die Zeit, um die Bildung Kinetik der Au-NCs in di vergleichenfferent wirkstoffbeladenen Protein-Vorlagen.
  2. Messung der Bindungskonstante eines bestimmten Arzneimittels an HSA
    1. Wiederholen Sie die Schritte 3.1.1 - 3.1.4. Ersetzen Sie die Medikamentenlösung mit Ibuprofen Lösungen bei vier verschiedenen Konzentrationen (einschließlich einer Kontrollprobe mit HSA nur ohne Wirkstoffbeladung). Beschriften Sie die Glasfläschchen nach der Medikamentenkonzentration entsprechend.
    2. 10 Minuten später abkühlen die Glasfläschchen unter fließendem Wasser in ein Waschbecken. Achtung: Die Glasflaschen sind heiß. Tragen Sie hitzebeständige Handschuhe, um Verbrennungen zu vermeiden.
    3. Zeichnen Sie 50 ul der oben genannten Lösungen aus jedem Fläschchen zu einer 384-Well-schwarze Platte und Messung der Emissionsspektrum.
    4. Wiederholen Sie die Schritte 3.2.1 - 3.2.3 zweimal zwei weitere Sätze von Ergebnissen bei unterschiedlichen Wirkstoffkonzentrationen zu erhalten.
    5. Stoppen Sie den Magnetrührer. Zeichnen Sie die Photoemissionsspektren und Analyse der Ergebnisse.
      1. Für die in jeder einzelnen Charge erhaltenen Rohdaten, zeichnen Sie die Photoemissionsspektren von jedemProbe in Software wie Origin-Software und finden Sie heraus die Spitzenintensität.
      2. Berechnung und Darstellung der relativen Fluoreszenzintensität [(I 0 - I) / I 0] gegen die Arzneimittelkonzentration, wobei I und I 0 auf die Fluoreszenzintensität von Au NCs in wirkstoffbeladenen HSA und reine HSA gebildet, hinzuweisen.
      3. Berechnung der Bindungskonstante durch Anpassen der Daten an einer einzigen Stelle Bindungsmodell unter Verwendung der Michaelis-Menten-Gleichung: Y = R max × C / (K D + C), wobei R max die maximale Antwortsignal angibt, C ist die Konzentration des Liganden und K D für die Bindungskonstante. Führen Sie diese in der Software wie Origin. Wählen Sie das Menü Analyse Montage Nichtlinearer Fit, dann wählen Sie Hill Funktion aus Kategorie Growth / Sigmoidal. Auf der Einstellungen: Auswahlseite Funktion, klicken Sie auf Fit zu zeigen, bis die Einbauergebnisse.

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Ergebnisse

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Proteinentfaltung ist ein wichtiges Verfahren für die Bildung von Protein-gestützten Au NCs, da mehr reaktive funktionelle Gruppen (zB Tyrosin) eines Proteins, um die eingekapselte Au Ionen zu reduzieren und damit Beschleunigung der Bildungsgeschwindigkeit von Au NCs ausgesetzt werden. Heiz- und externen Denaturierungsmitteln gibt zwei übliche Mittel, um das Protein Entfaltungsvorgangs zu fördern. Figur 1 zeigt die Wirkung von Erhitzen und Hinzufügen externer Denaturierungsmitteln auf die Kinet...

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Diskussion

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Es gibt mehrere wichtige Schritte, die in diesem Verfahren markiert werden müssen. In das Protokoll der Screening der relativen Bindungsaffinität von verschiedenen kleinen molekularen Drogen, Schritte 3.1.2, 3.1.3 und 3.1.4 sind entscheidend für gute Ergebnisse zeigt einheitlichen Trend für die relative Bindungsstärke zu erhalten. In diesen Schritten, sollten die Maßnahmen der Zugabe von Chemikalien und Darstellung von Reaktionslösungen für die Messung, so schnell wie möglich sein, um die Zeitverzögerung Wirkung und die...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Y.N.T. möchte der Agentur für Wissenschaft, Technologie und Forschung (A*STAR), Singapur, für die finanzielle Unterstützung im Rahmen des JCO CDA-Zuschusses 13302FG063 danken.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Gold(III)-chlorid-Lösung, 30%Sigma-Aldrich484385ätzendes, reizendes
Serumalbumin beim Menschen, 96%Sigma-AldrichA1887
Rinderserumalbumin, 96%Sigma-AldrichA2153
Ibuprofen, 98%Sigma-AldrichI4883 
Warfarin, 98% Sigma-AldrichA2250
PhenytoinSigma-AldrichPHR1139
Sulfatistilamid, 99% Sigma-AldrichS9251
DimethylsulfoxidSigma-AldrichD8418
HarnstoffSigma-AldrichU5128
NatriumhydroxidSigma-Aldrich
MagnetrührerIKART5
Mikrotiterplatten-ReaderTecanInfinite M200
384-Well-PlatteCorning
5 ml LuftverdrängerpipetteEppendorf
1.000 μ l LuftverdrängerpipetteEppendorf
100 μ l LuftverdrängerpipetteEppendorf
5.000 μ l Eppendorf Spitzen
1.000 μ l Eppendorf Spitzen
100 μ l Eppendorf Spitzen
1,5 ml MikroröhrchenEppendorf
20 ml Glasfläschchen mit Schraubverschluss
4 ml Glasfläschchen mit Schraubverschluss
221465

Referenzen

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Schlagwörter

Fluorescent Gold NanoclustersProtein Targeting Drug ScreeningBinding Affinity MeasurementHuman Serum AlbuminFluorescence Intensity AnalysisGold Nanocluster FormationDrug Protein Binding ConstantMicroplate Reader EmissionTemperature Denaturing ConditionsUrea Denaturation Method

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