Methodenartikel

Epithelialen Zellwiederbevölkerung und Herstellung von Nagetier extrazellulären Matrix Scaffolds für Nierengewebe Entwicklung

DOI:

10.3791/53271

⸱

10. August 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Comprehensive Transplant Center, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 2Department of Surgery, Feinberg School of Medicine, Northwestern University, 3Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 4Simpson Querrey Institute for BioNanotechnology in Medicine, Northwestern University, 5Department of Internal Medicine, University of New Mexico HSC, 6Department of Pathology, University of New Mexico HSC, 7Department of Chemical and Biological Engineering, Northwestern University, 8Chemistry of Life Processes Institute, Northwestern University, 9Department of Surgery, Jesse Brown VA Medical Center

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Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt die Dezellularisierung von Sprague-Dawley-Rattennieren durch antegrade Perfusion von Detergenzien durch das Gefäßsystem, wodurch azelluläre extrazelluläre Nierenmatrizen entstehen, die als Vorlagen für die Wiederbestückung mit menschlichen Nierenepithelzellen dienen. Die Rezellularisierung und Verwendung des Resazurin-Perfusionsassays zur Überwachung des Wachstums wird in speziell entwickelten Perfusionsbioreaktoren durchgeführt.

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von azellulären, noch biofunktionellen, Nierenextrazellulären Matrix (ECM) Gerüste, die als kleine Modellsubstrate für Orgel angelegten Gewebeentwicklung sind. Sprague Dawley-Rattennieren werden durch Einführen eines Katheters in die Nierenarterie über 26 h kanüliert und mit einer Reihe von niedrigkonzentrierten Waschmitteln (Triton X-100 und Natriumdodecylsulfat (SDS)) perfundiert, um intakte, ganze Niere Gerüste mit intakten abzuleiten perfundierbaren Gefäßsystem, Glomeruli und Nierentubuli. Folgende Dezellularisierung wird das Nierengerüst in einem speziell entworfenen Perfusionsbioreaktor Gefäß platziert und der katheterisiert Nierenarterie an eine Perfusionskreislauf, bestehend aus miteinander verbunden sind: einer peristaltischen Pumpe; Schlauch; und wahlweise Sonden für pH, gelöster Sauerstoff und Druck. Nach Sterilisieren des Gerüsts mit Peressigsäure und Ethanol, sowie den Ausgleich der pH-Wert (7,4), der Niere Gerüst zum Impfen mittels Perfusion von Kulturmedium in einem larg zubereitetE-Kapazität bei 37 ° C gehalten und 5% CO 2. Vierzig Millionen Nierenrinden Tubulusepithelzellen (RCTE) Zellen durch die Nierenarterie durch das Gerüst unter Hochstrom (25 ml / min) und Druck (~ 230 mm Hg) für 15 min vor der Verringerung der Fließgeschwindigkeit auf einen physiologischen spritzt und rasch perfundierten (4 ml / min). RCTE Zellen besiedeln vor allem die Rohr ECM Nische in der Nierenrinde, vermehren sich und bilden Rohr Epithelstrukturen über sieben Tagen Perfusionskultur. A 44 uM Resazurinlösung in Kulturmedium wird durch die Niere für 1 h bei Medium tauscht perfundiert, um eine fluorometrische, redox-basierte metabolische Beurteilung der Zell-Lebensfähigkeit und Proliferation während Tubulogenese bereitzustellen. Die Niere Perfusionsbioreaktor ermöglicht nicht-invasive Entnahme von Medium für biochemische Bewertung, und mehrere Einlassöffnungen ermöglichen alternative Rück Aussaat durch die Nierenvene oder Harnleiter. Diese Protokolle können verwendet werden, um Nieren Gerüste mit einem recellularize werdenVielzahl von Zelltypen, einschließlich vaskulären Endothelzellen, Tubulusepithelzellen und stromalen Fibroblasten zur schnellen Auswertung innerhalb dieses Systems.

Einleitung

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Da die Zahl der Patienten mit end-stage Nierenversagen weiter zu erhöhen, gibt es eine starke und wachsende Knappheit in der Zahl der Spendernieren für die Transplantation zur Verfügung. Die Unfähigkeit, die Nachfrage einer stetig steigenden Zahl von Bewerbern zu treffen für Nierentransplantation Warteliste hat sich die Forschung in Niere Orgel Technik mit dem Ziel der Entwicklung von kundenspezifischen, implantierbare Nierentransplantate auf Anfrage 1,2 aufgefordert werden. Aufbau funktionierender Nierengewebe aus patienteneigenen Zellen würde die Notwendigkeit des lebenslangen Immunsuppression zu beseitigen, verringern die Menge der Zeit verbringen die Patienten an der Dialyse wartet auf eine Nierentransplantation und erstrecken sich lebensrettende Transplantation, mehr Patienten mit chronischer Nierenerkrankung.

Der erste Schritt zur Verwendung Bioengineering Patienten stammenden Zellen, die ein Nierengewebe ist es, ein Gerüst, das als Stützsubstrat für Nierenparenchym dient entwickeln (zB Rohr epitheLiAl), Stroma-Fibroblasten und Gefäßzellwachstum. Biomaterial Gerüste aus natürlichen extrazellulären Organ Matrices (ECM) abgeleitet haben mehrere Eigenschaften, die sie für den Einsatz im Tissue Engineering, einschließlich ihrer natürlichen biologischen Zusammensetzung wünschenswert machen; entsprechende Makro- und Mikrostruktur, um physiologische Funktion zu versehen; und zellulären Biokompatibilität Förderung der Zelladhäsion, Migration und Umbau 3 konstruktiven Gewebe. Eine vielversprechende Methode, um Gerüste für Nierengeweberegeneration zu erzeugen, ist durch Dezellularisierung von allogenen oder xenogenen Nieren, die einen Großteil der komplexen natürlichen Proteinzusammensetzung der Niere ECM 4 zu erhalten, behalten die inhärente Komplexität der Architektur der Orgel, und die Überwindung der Schwierigkeiten mit Bottom zugeordnet up-Engineering von dicken cellularized Gewebe durch die Bereitstellung einer Gefäßversorgung in Entwicklungs Zellen nach Gerüst Rezellularisierung 5.

Perfusion Dezellularisierung ist ein Verfahren inwelche Detergentien, Enzyme oder andere Zellstörende Lösungen werden gleichmäßig durch das Gefäßnetzwerk des Organs 6 geliefert. Diese Strategie hat sich als effizienter Prozess eingerichtet, um azellulären organ ECM-Gerüste als dreidimensionale (3D), biologische Schablonen für ganzen Organ Engineering 6-8, wie durch die Entwicklung von zellfreien Nieren Vorlagen von weggeworfenen menschlichen Nieren 9 belegt abzuleiten und xenogenen Nieren von Großtier (zB Schwein 10, Ziege 11) und Nagetierquellen 12 erhalten. Insbesondere die Verwendung von kleinen Tiermodellen wie Nagetiere erfordert weniger Zellen und Kulturmedien, die besonders nützlich für die Organ Rezellularisierung Studien, in denen Zellzahlen sind in der Regel begrenzt ist, wie es der Fall mit Stammzellen abgeleiteten Geweben. Das Ziel des beschriebenen Dezellularisierung Protokolls ist es, eine azelluläre Nieren ECM, die als 3D-Gerüst-System zur Regeneration von Nieren Structur verwendet werden können, zu erzeugenES, einschließlich Nephron Tubuli, die im vorliegenden Beispiel mit der menschlichen Nierenrinden Tubulusepithelzellen (RCTE) Zellen wieder besiedelt werden. Wir zuvor beschrieben unserer strengen Bewertung eines optimalen Waschmittelbasis Rattenniere Dezellularisierung Protokoll 7, die mehr schneller (ca. 1 Tag) als andere Methoden zuvor berichtet (Ross et al .- 5 Tage 12, Song et al .- 4,5 Tage 13), und setzt die Orgel zu einer deutlich geringeren Konzentration (0,1%) des Denaturierungsmittels Natriumdodecylsulfat (SDS) bei Dezellularisierung als frühere Berichte 12-15.

Eine begrenzte Anzahl von Studien haben die Verwendung von Nagetier-Nieren Dezellularisierung und die anschließende Verwendung als 3D-Gerüst für Zell Repopulation beschrieben (Bewertung anderswo 1) 12-16. In diesem Protokoll stellen wir eine detaillierte Beschreibung unserer zuvor ermittelten optimalen Dezellularisierung Strategie zur Herstellung von azellulären NierengerüsteSprague Dawley-Rattennieren 7. Mit Hilfe speziell entworfenen Perfusion Bioreaktoren in der Lage Dual Aussaat und Pflege Perfusionskultur 17. recellularize wir die azellulären Nieren Gerüste mit menschlichen RCTE Zellen, die konsequent die röhrenförmige Komponente wieder zu bevölkern in diesen dezellularisierten Matrizen, vermehren und überleben in Perfusionskultur über eine Woche. Wir die Verwendung der Resazurin Perfusion Assay zeigen ferner - einem kostengünstigen, nicht-zytotoxischen und nicht-invasive metabolische Beurteilung zuvor für Cytotoxizität verwendet Beispiele 17 -, um eine Anzeige der Lebensfähigkeit der Zellen und die Proliferation innerhalb der rezellularisiertes Nieren über die Zeit 7 bereitzustellen.

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Protokoll

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ETHIK STATEMENT: Alle Verfahren, die Tiere wurden nach den Richtlinien der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss der Northwestern University genehmigt durchgeführt.

1. Kidney Dezellularisierung

  1. Bereiten Dezellularisierung Lösungen. Bereiten Sie die folgenden Mengen an Reagenzien für jede Niere dezellularisiert werden, plus ein zusätzliches Volumen (zB für 4 Nieren, bereiten 5.000 ml Triton X-100 zu Schritt 1.1.3.):
    1. Bereiten Sie 500 ml Umkehrosmosewasser (ROH 2 O). Hinweis: Alternativ kann VE-Wasser in den Schritten wo ROH 2 O angezeigt werden.
    2. Herzustellen 1000 ml Triton X-100, 1% (v / v) in ROH 2 O. Langsam 10 ml Triton X-100 bis 990 ml Wasser in einem großen Becherglas unter schnellem Rühren auf einer Rührplatte. Das Reagenz vollständig gelöst vor der Anwendung (mindestens 10 min).
    3. Herzustellen 1000 ml Triton X-100, 1% (v / v) in ROH 2 O (Separate Volumen).
    4. Herzustellen 1000 ml Natriumdodecylsulfat (SDS), 0,1% (v / v) in ROH 2 O. Langsam 5 ml SDS (20% Stammlösung) zu 995 ml Wasser in einem großen Becherglas unter Rühren schnell auf einer Rührplatte. Lassen Sie das Reagenz gleichmäßig vor der Anwendung (mindestens 10 min) zu mischen.
    5. Bereiten Sie 500 ml ROH 2 O (separater Band).
  2. Bereiten Sie für Nieren Dezellularisierung.
    1. Recover eine Niere von einem männlichen Sprague-Dawley-Ratten (250-300 g), wie zuvor beschrieben 7.
      1. Betäuben die Ratte durch intraperitoneale Injektion von Pentobarbital (50 mg / kg Körpergewicht). Häufig untersuchen die Narkosetiefe (alle 10-15 min) durch die Überwachung der Atmung, der Herzfrequenz und toe Prise Antwort während der Operation. Wenn das Tier eine erhöhte Atemfrequenz oder positive Pedalreflex, zu verwalten eine zusätzliche Dosis (mit 1/3 bis 1/4 der Anfangsdosis) von Pentobarbital.
      2. Führen Sie eine Längsmittellinie abdominal Einschnitt, um die Nieren, abdominale Aorta und die untere Hohlvene aussetzen.
      3. Injizieren 2.000 USP Heparin-Einheiten / kg Körpergewicht in den Penis Vene.
      4. Mobilisieren beide Nieren durch vorsichtiges Sezieren. Sorgfältig trennen die Nieren aus dem perirenalen Fett, während die Nierenkapsel um die Niere intakt. Perfusion der Niere mit kalter Kochsalzlösung (10 ml) über Infrarot-Nieren abdominalen Aorta.
    2. Legen Sie eine 24-Gauge-Katheter in die Nierenarterie, dicht ligieren den Katheter in die Arterie, und (mit einer Spritze) sanft Perfusion der Niere mit 10 ml kalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), um ganz klar das Organ Blut.
    3. Tauchen Nieren in 25 ml PBS in einer Petrischale und in einen -20 ° C Gefrierschrank einfrieren allmählich die Orgel (wodurch Zell-Lyse zu induzieren) zur Lagerung bis Dezellularisierung.
      Hinweis: Wenn gewünscht, kann der Ureter und / oder Nierenvenen auch retrograd kanüliert Aussaat, wenn auch nicht in thi beschriebens Protokoll.
    4. Vollständig auftauen gefrorenen Nieren (equilibriate bei Raumtemperatur (RT)), und sanft Perfusion mit 10 ml PBS, um das ligierte Nierenarterie auf Dichtheit zu überprüfen. Wenn Leckagen oder erheblichen Widerstand beobachtet werden, re-Katheterisierung der Nierenarterie.
  3. Bereiten Ausrüstung für Dezellularisierung. Montieren Sie den Dezellularisierung Perfusionssystem, wie in 1B dargestellt.
    1. Schließen Sie ein 8 "Länge der Schlauchpumpenschlauch (1D, f), um zwei ausreichend Längen (> 36" empfohlen) von 1/16 "Innendurchmesser (ID) Silikon-Gummi-Schlauch (1D, h). Verwenden Sie zwei männliche Luer-Lock zu 1/8 "mit Widerhaken versehenen Adapter von einem weiblichen Luer-x Luer-Adapter, um Segmente der Rohrleitung (1D, j) join. Legen Sie eine weitere männliche Luer-Lock zu 1/8 "mit Widerhaken versehenen Adapter (1D, c) in den stromabwärts gelegenen Ende der Perfusion Linie zur Befestigung an der NierenArterienkatheter.
    2. Schließen Sie jede Schlauchpumpe Schlauchsegment in die 4-Rollen-Pumpenkopf mit einer großen Pumpe Patrone.
    3. Nach dem Einlegen der stromaufwärts gelegenen Ende Silikongummischlauch im ersten Lösungsreservoir (ROH 2 O), halten Sie die "Prime", um vollständig prime jeder Perfusionskreislauf mit Lösung. Kritisch: Sicherstellen, dass keine Luftblasen bleiben im Schlauch eingeschlossen ist und daß die stromaufwärts gelegene Ende des Silikongummischlauch (links offen, um Flüssigkeit zu ziehen) unterhalb der Flüssigkeit-Luft-Grenzfläche des Reaktionsmittelreservoir befestigt ist, wie in 1B dargestellt.
  4. Führen Sie die Dezellularisierung Protokoll bei RT 7.
    1. Verbinden die renale Arterienkatheter jedes taut Niere Ende Perfusionskreislauf Schlauch stromabwärts der Pumpe, so dass keine Luftblasen in dem Katheter eingeschlossen ist. Ermöglichen, dass die Niere zu längs der Innenwand eines leeren 5 l-Becher (Perfusat Sammelreservoir ausgesetzt werden, siehe Abbure 1B), so daß der Nierenarterie nicht geknickt oder gewendelt.
    2. Stellen Sie den Pumpenantrieb bis 5 ml / min, und drücken Sie die Schaltfläche "Start". Bestätigen Sie, dass jede Niere Perfusion durch Beobachtung Lösungen Tropf von der Unterseite der Orgel.
    3. Perfundieren jeder Niere mit den folgenden Reagenzien wie in 1A beschrieben
      1. Perfusion mit 500 ml ROH 2 O mit 5 ml / min für 1 h, 40 min.
      2. Perfusion mit 1000 ml 1% Triton X-100 in 5 ml / min für 3 h, 20 min.
      3. Perfusion mit 1000 ml 1% Triton X-100 in 1 ml / min 16 h, 40 min.
      4. Perfusion mit 1000 ml 0,1% SDS bei 5 ml / min für 3 h, 20 min.
      5. Perfusion mit 500 ml ROH 2 O mit 5 ml / min für 1 h, 40 min.
        Hinweis: Jeder dezellularisierten Niere in PBS in einem 50 ml konischen Röhrchen bei 4 ° C für maximal zwei Wochen vor Verwendung gelagert werden (ohne Additive).

2. PerFusion Bioreactor Versammlung, Kidney Sterilisation und Vorbereitung für Rezellularisierung

  1. Bereiten Bioreaktorgefäße.
    1. Mit warmem Waschen Sie die Glasbioreaktorbehälter (der Karosserie) und Bioreaktor Köpfe, verdünnte Spülmittel-Lösungen (zB. 1% Spülmittel-Lösung in Leitungswasser) und anschließend gründlich mit Leitungswasser und dann ROH 2 O. Lassen Sie Komponenten vollständig trocknen.
    2. Sie eine kleine Volumen (~ 5 ml) von Silikonisieren Reagenz zum Boden jedes Behälters. Stellen Sie sicher, dass die Reagenz benetzt die gesamte Bodenfläche für einige Sekunden, dann abtropfen überschüssige Flüssigkeit.
    3. Lassen Sie die Vorratsbehälter, einen Abzug bei RT O / N trocknen. Alternativ Reservoirs kann in einem Ofen bei 100 ° C für 30 Minuten getrocknet werden, um das Trocknen zu beschleunigen und verbessern die Haltbarkeit der Beschichtung, die dazu bestimmt ist, um die Befestigung der Zellen an den Boden der Glasbioreaktorbehälter zu verhindern.
  2. Bereiten Perfusion Schaltungskomponenten für die Sterilisation (Abbildung1D).
    1. Schneiden Sie die folgenden Schlauchlängen (für jeden Bioreaktor):
      1. Schneiden zwei 25 "Längen von 1/16" ID Silikongummischlauch (Figur 1D, h).
      2. Schneiden Sie ein 8 "Länge des Schlauchpumpenschlauch (1D, f).
      3. Schneiden Sie ein 4,25 "Länge von 1/16" ID Silikongummischlauch.
      4. Schneiden Sie zwei 1 "Längen von dickwandigen 1/16" ID Silikongummischlauch (1D, g).
      5. Schneiden Sie ein 2 "Länge von 1/4" ID x 0.5 "Außendurchmesser (OD) Silikon-Gummi-Schlauch (1D, e).
    2. Bereiten Sie die folgenden Luer-Adapter (für jeden Bioreaktor):
      1. Bereiten Sie 10 männlichen Luer-Lock auf 1/8 "Stacheldraht-Adapter (1D, c)
      2. Bereiten Sie 2 Luer-Stecker (1D, a)
      3. Bereiten Sie 2 Luer Kappen (1D, b)
      4. Bereiten 5 Luerx Luer Adapter (x5, 1D, d)
    3. Waschen Sie alle mit warmen Schlauch und Luer-Adapter, verdünnte Lösungen Spülmittel, gründlich abspülen in Leitungswasser und dann ROH 2 O, und lassen Sie sie trocknen.
  3. Montieren Perfusionskreisläufe.
    1. Slip 1 "Länge von dickwandigen 1/16" ID Silikongummischlauch über Einlass Luer-Akzeptor auf den Kopf des Bioreaktors angebracht. Zeigen männlichen Luer-Lock, um 1/8 "ID barb Adapter in offene Ende des Schlauchs. Wiederholen Sie für das andere Einlass Luer-Akzeptor, und schließen Sie einen weiblichen Luer-Kappe zur Abdichtung Anschluss (für Harnleiter oder venöse Aussaat Techniken nicht in diesem Protokoll beschrieben bestimmt).
    2. Schließen Sie jeden 25 "Segment 1/16" ID Silikongummischlauch an die "Segment der Schlauchpumpenschlauch mit Luer-Lock 8 bis 1/8" ID barb und weiblichen Luer x Luer Adapter (1D, j).
    3. Schließen Sie das eine offene Ende des Silikonkautschuk Tubing für die Medien Perfusat Auslass auf der Außenseite des Bioreaktors Kopf. Verbinden die 4,25 "Länge von 1/16" ID Schlauch an der gegenüberliegenden (innere) Seite des Medien Perfusat Auslass im Inneren des Bioreaktors Kopf.
    4. Schließen Sie einen männlichen Luer-Lock auf 1/8 "ID Stacheldraht Adapter an den verbleibenden offenen Ende des Perfusionskreislauf Schläuche. Schließen Sie eine weibliche Luer x Luer Adapter mit dem männlichen Luer-Lock. Verbinden Sie den weiblichen Luer-x Luer-Adapter an den offenen männlichen Luer-Lock, die in die Einlass Luer-Akzeptor auf der Bioreaktor. Dies wird als Medien Perfusat Einlass führt direkt in die Nierenarterie Katheter dienen.
    5. Achten Sie darauf, dass keine Anschlüsse an den Bioreaktor Deckel offen gelassen oder ausgesetzt. Dicht schließen Sie das Druckventil am Bioreaktor Körper.
    6. Den Bioreaktor Kopf über den Speicherkörper, mit einem O-Ring zwischen den identischen Nuten Futter jede Komponente eingeklemmt. Legen Sie eine metallische Klammer über die Schnittstelle, die beiden Komponenten zusammen zu halten.
    7. Passen die Entlüftungsöffnung auf der Bioreaktor Kopf mit einem 0,2-Mikron-Entlüftungsfilter, welche die beiden Komponenten mit einem 2 "Länge von 1/4" ID x 0.5 'OD Silikongummischlauch (Figur 1D, e). Öffnen Sie das Entlüftungsventil.
    8. Lösen Sie die rote Verschlusskappe auf dem Bioreaktor Kopf.
    9. Die restlichen Luer Adapter und 6 "gezackten Muster Zange in einem autoklavierbaren Beutel und Abdichtung.
  4. Autoklaven werden die zusammengebauten Bioreaktoren und Luer-Stecker.
  5. Bereiten Sie die folgenden Reagenzien für die Gerüst Sterilisation und mittlere Perfusion vor der Aussaat (Volumina pro dezellularisierte Nieren aufgeführt):
    1. Innerhalb einer Abzugshaube, bereiten ein 50 ml 0,1% Peressigsäure, 4% igen Ethanollösung durch Zugabe von 2,56 ml Peressigsäure-Lösung (39% Stammkonzentration) und 40 ml 200 Proof Ethanol auf ~ 957 ml ROH 2 O in einem 1-l-Flasche. Gründlich mischen durch mehrmaliges Umdrehen Flasche, und legen Sie in biologischen Sicherheitsschrank.
    2. Bereitenein 150 ml 1x PBS-Lösung, vorsterilisiert durch Autoklavieren.
    3. Vorbereitung 50 ml DMEM / F12 Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin (Pen-Strep).
  6. Sammeln Sie die übrigen Elemente für Perfusionsbioreaktor Montage. Alle Produkte in einem biologischen Sicherheitsschrank. Kritisch: Stellen Sie sicher, dass die biologischen Sicherheitswerkbank ist mit Arbeits Steckdosen, um die digitale Pumpenantrieb Macht ausgestattet. Alternativ können Sie ein Verlängerungskabel, um den Pumpenantrieb an externe Steckdosen außerhalb des Schaltschranks zu verbinden.
    1. Sammeln dezellularisierten Nieren.
    2. Sammeln autoklaviertem Bioreaktoren mit angeschlossenem Perfusionskreisläufe.
    3. Sammeln autoklaviertem Beutel mit Luer-Adapter und Pinzette.
    4. Sammeln Digitale Pumpenantriebe mit angeschlossenem 4-Rollenkopf und große Pumpe Kartuschen (1 pro Perfusionskreislauf).
  7. Füllen Sie das Perfusionskreislauf wie in 1C unter sterilen c beschriebenEDINGUNGEN in einem biologischen Sicherheitsschrank.
    1. Ein mit 3-Wege-Absperrhahn (1D, i) zwischen dem männlichen Luer-Lock-bis 1/8 "ID Widerhakenteil in der Nähe der Medien Perfusat Einlass und der weibliche Luer x weiblichen Luer-Adapter. Lassen Sie alle drei Häfen an der Hahn geöffnet ist.
    2. Entfernen Sie die rote Verschlusskappe auf dem Kopf und Bioreaktor Pipette 50 ml der 0,1% Peressigsäure, 4% Ethanol-Lösung in den Medienspeicher durch die Öffnung.
    3. Schließen Sie die Schlauchpumpe Schlauchsegment mit dem Pumpenkopf mit einer großen Pumpe Patrone. Stellen Sie die Flussrate auf 5 ml / min, drücken Sie "Start", und lassen Sie den Stromkreis, um prime.
      1. Wenn die Flüssigkeit füllt den Perfusionsleitung und erreicht den verbleibenden offenen Port des Dreiwegehahn, stecken Sie den Anschluss mit einem männlichen Luer-Stecker (1D, ein).
      2. Ermöglichen die Schaltung vollständig prime bis keine Luft in dem Perfusionskreislauf Schlauch oder auf der Innenseite des Einlasses Luer Akzeptor beobachtet. Wenn necessary, erhöhen die Durchflussrate vorübergehend Blasen aus dem Perfusionsleitung zu vertreiben. Wenn vollständig gefüllt, stoppen Sie den Pumpenantrieb.
    4. Das weibliche Luer Ende der Nierenarterie Katheter vorsichtig Stecker in die männliche Zulauf Luer-Akzeptor auf der Innenfläche des Bioreaktors Kopf mit den sterilisierten 6 "Pinzette. Sicherstellen, dass die Verbindung dicht ist und daß keine Luft in dem Katheter verbleibt. Ermöglichen die Niere sanft hängen von Nierenarterienkatheter, so dass die Nierenarterie nicht verdreht oder geknickt.
    5. Ziehen Sie die metallische Klemmzusammenhalten des Bioreaktors Kopf und Körper, so dass der Bioreaktor Behälter dicht geschlossen halten. Schließen Sie die roten Schraubkappe auf den Bioreaktor Kopf.
  8. Sterilisieren Nieren bei RT durch Perfusion mit 0,1% Peressigsäure, 4% Ethanol-Lösung mit 5 ml / min für 1 h, dann drei aufeinanderfolgende 1-stündigen Perfusionen bei RT mit 50 ml PBS mit 5 ml / min.
    1. Ändern Lösungen:
      1. Nach 1 Stunde, stoppen Sie die Pumpe und öffnen roten Schraubverschluss. Mit Hilfe eines steärgern (autoklaviert) Pasteur Pipette vorsichtig aspirieren die gesamte Lösung aus dem Bioreaktor Reservoir. Verlassen Sie die Perfusionskreislauf vollständig gefüllt.
      2. Je 50 ml frische Lösung in den Bioreaktor Behälter, schließen Sie die Verschlusskappe, und starten Sie die Pumpe.
  9. Nach der letzten PBS spülen absaugen PBS aus dem Reservoir und Pipetten in 50 ml DMEM / F12-Medium mit 10% FBS und 1% Pen-Strep ergänzt. Schließen der Schraubkappe und übertragen den Bioreaktor mit den beigefügten Perfusionskreislauf zu einer großen Kapazität bei 37 ° C und 5% CO 2 gehalten.
  10. Falls erforderlich, überweisen Sie den Pumpenantrieb in den Inkubator. Verbinden Bioreaktor Perfusionskreislauf zur Pumpe und Perfusion der Niere bei 4 ml / min mindestens 1 Stunde vor der Aussaat.

3. Kidney Rezellularisierung mit Nierenrinden Tubulusepithelzellen

  1. Warm ausreichender Menge DMEM / F12 (ergänzt mit 10% FBS und 1% Pen-Strep) und cell dissoziierenden Enzyms zur Zelle Hebe bis 37 ° C. Empfohlene Mengen sind nachfolgend aufgeführt:
    1. Bereiten Sie 10 ml Zell dissoziierenden Enzyms und 10 ml DMEM / F12 pro 175 cm 2 Kulturflasche zum Heben.
    2. Bereiten Sie 5-10 ml DMEM / F12 pro Niere geimpft werden.
  2. Sammeln einer ausreichenden Anzahl von Kulturkolben für die gewünschte Konzentration Aussaat (4 x 10 7 Zellen immortalisierte menschliche RCTE 18 pro Niere ergibt maximale Verpflanzung von Zellen mit diesen RCTE Seedingstrategie).
  3. Lift-Zellen aus den Kolben unter Verwendung von Zell dissoziierenden Enzyms. Saugen Sie Medium aus Kolben, dann Pipette 10 ml Zell dissoziierenden Enzyms in den Kolben. Platz-Kolben in 37 ° C-Inkubator, um die Dissoziation zu beschleunigen.
  4. Kolben-Überprüfung auf einem Phasenkontrastmikroskop alle 2 min bis zur vollständigen Dissoziation von Zellen aus Flaschenoberfläche beobachtet wird. Hinweis: Die Inkubationszeit wird in Abhängigkeit von der Höhe der Einmündung der Zellen variieren, aber RCTE Zellen rEquire etwa 15 min vollständig zu distanzieren.
  5. Nehmen Sie eine Probe von dissoziierten Zellsuspension zur Zählung vor der Pelletierung. Verdünnen Sie die Zellsuspension mit einem gleichen Volumen von vorgewärmten DMEM / F12-Medium, und Zentrifuge bei 232 xg relative Zentrifugalkraft (RCF) für 5 min.
  6. Zählen Sie die Zellen während der Zentrifugation. Verdünne die erhaltene Probe mit einem gleichen Volumen von Trypan-Blau, und Pipette 10 ul in jedes Ende eines Hämozytometers zum Zählen. Berechnen notwendigen Pelletverdünnungsvolumen, um die gewünschte Konzentration der Aussaat (2 x 10 7 Zellen / ml) zu erhalten.
  7. Nach Zentrifugation verdünnt das Pellet mit einem geeigneten Volumen des Kulturmediums, um eine Endkonzentration von 2 x 10 7 Zellen / ml zu erhalten. Auszuarbeiten 2 ml der Suspension in ein Seeding sterile 5 ml-Spritze.
  8. Übertragen Sie die Perfusionsbioreaktor zu einem biologischen Sicherheitsschrank. Drehen Sie das Absperrventil, um den Fluss zu der Aussaat Port zu schließen. Entfernen Sie den männlichen Luer-Slip Stecker ausder Hahn, und verbinden Sie die Spritze mit der Aussaat Aussetzung geladen.
  9. Schnell übertragen die Perfusionskreislauf zurück zu Inkubator, und verwenden Sie die große Pumpe Patrone, um die Schlauchpumpe Schlauchsegment mit dem Pumpenkopf zu sichern.
  10. Zellaussaat: Schließen Sie den Hahn Ventilöffnung weisenden Pumpe. Langsam spritzen die Zellsuspension in Niere, sicherzustellen, dass die gesamte Suspension wird aus der Spritze in den Absperrhahn und Durchblutung Leitung übertragen. Drehen Sie das Absperrventil, um den Fluss von der Spritze zu schließen, und starten Sie die Pumpe mit 25 ml / min für 15 min.
  11. Nach 15 Minuten, senken Sie die Pumpenleistung auf 4 ml / min. Austauschmedium (100 ml Volumen für spätere Änderungen) am folgenden Tag und danach alle zwei Tage.

4. Bewertung der Zelllebensfähigkeit und Proliferation mit Resazurin Perfusion Assay

  1. Bereiten Resazurin Reagenz. Man löst 110,5 mg Resazurin-Natriumsalz werden in 100 ml PBS unter Rühren und 1:10 verdünnen, indem 5 ml deserhaltenen Lösung auf 45 ml frischem PBS, um eine 440 & mgr; M Resazurin Stammlösung zu erstellen. Filter-sterilisiert (unter Verwendung eines 0,2 & mgr; m Spritzenfilter), und speichert die Stammlösung in einem lichtgeschützten 50 ml konischen Röhrchen bei 4 ° C.
  2. Bereiten Resazurin-ergänzt Mediensteuerungen. Bereiten Sie eine 10% ige Lösung von Resazurin Reagenz in Kulturmedium (z. 5 ml Resazurin Stammlösung + 45 ml Kulturmedium), um Resazurin Arbeitslösung zu erstellen. Autoklavieren eine 10 ml Volumen des Resazurin Arbeitslösung in einem lichtgeschützten Behälter. Hinweis: Dies wird vollständig reduzieren die Verbindung Resazurin zu Resorufin und wird als positive Kontrolle für die Berechnung Prozent Resazurin Reduktion dienen.
  3. 1 ml Aliquot jeder Resazurin Arbeitslösung (oxidiert), Resazurin Arbeitslösung (reduziert), und das Kulturmedium allein (blank) in einzelne 1,5 ml Sammelröhrchen autoklaviert. Legen Sie die offenen Rohre in der gleichen Brutkasten wie die Perfusion Bioreaktoren.
  4. Übertragen Sie die Niere PerfusionSchaltung aus dem Inkubator zu einem biologischen Sicherheitsschrank. Entfernen Sie die Verschlusskappe aus dem Bioreaktor Kopf, und saugen Kulturmedium aus dem Bioreaktor Reservoir mit einer Pasteurpipette.
  5. Je 10 ml von Resazurin Arbeitslösung in den Behälter, in der Nähe Schraubverschluss, und übertragen Sie die Nierendurchblutung Kreis zurück in den Inkubator.
  6. Starten der Pumpe bei 4 ml / min und lassen Reagens durch die Nieren für genau 1 h zu perfundieren.
  7. Nach 1 Stunde, stoppen Sie die Pumpe, und übertragen Sie die Nierendurchblutung Schaltung mit der biologischen Sicherheitsschrank.
  8. Sammeln Sie die Anlage (teilweise reduziert) Resazurin-Lösung und 100 ml Kulturmedium in den Bioreaktor Reservoir. Transfer Perfusionskreislauf zu Brutkasten, und Strömungs fortzusetzen (4 ml / min).
  9. Je 100 & mgr; l (x 3 Wiederholungen) Anlage Resazurin-Lösung, Resazurin Arbeitslösung, autoklaviert Arbeitslösung und Kulturmedien Rohling in einem schwarzen (undurchsichtigen) 96-Loch-Testplatte. Lesen Fluoreszenzintensität (excitatIon: 540/35; Emission: 590/20) mit einem Spektralphotometer.
  10. Berechnen prozentige Reduktion als Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten, die durch die Fluoreszenzintensität (FI), normalisiert durch die oxidierten Resazurin Medium erzeugt (ORM oder Resazurin Arbeitslösung nicht an Zellen ausgesetzt sind) oder die reduzierte Resazurin Medium (RRM oder autoklaviert Arbeitslösung):% Reduktion = 100 x {[FI (konditioniert Resazurin-Lösung) - FI (ORM)] / [FI (RRM) - FI (ORM)]}. Um Ergebnisse zu normalisieren, Multiplizieren% Reduktion durch Kreislaufvolumens (10 ml) und dividieren durch Inkubation (1 h).

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Ergebnisse

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Nieren nacheinander mit Wasser durchströmt und verdünnte Detergenslösungen (1% Triton X-100, 0,1% SDS) gemäß einer vorher festgelegten, optimalen Dezellularisierung Protokoll (siehe 1A, B) 7, wird über einen 26 Stunden-Zeitraum zunehmend transparent, wie in 2A gezeigt. Das resultierende acellular Nierengerüst ist frei von Zellen und erhält eine zusammenhängende Nieren ECM durch eine intakte Nierenkapsel, die unbeschädigt ist im Anschluss an die Perfusion-Protokoll unterstützt...

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Diskussion

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Die beschriebene Dezellularisierung Protokoll konsistent erzeugt eine ganz azellulären Nieren ECM, die als 3D-Vorlage für die Kultur von menschlichen Nierenrinden Tubulusepithelzellen (beide proximalen und distalen Tubulus-abgeleitete) dient, zusätzlich zu den vaskulären endothelialen Zellen 7,17. Die Kanüle versehen Nierengefäßsystem dient als wesentliches Merkmal für eine gleichmäßige Abgabe von Reagenzien und Zellen in der gesamten Gerüst in einem Bioreaktor Set-up, so dass die Durchblutung Dezellularisier...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

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Die Autoren danken der Zeller Familienstiftung für die Unterstützung. Wir danken der Northwestern Memorial Foundation Dixon Translational Research Grants Initiative, dem Faculty Development Grant der American Society of Transplant Surgeon und einem Research Grant for the Young Investigator der National Kidney Foundation of Illinois. Wir danken der Robert R. McCormick Foundation für die Unterstützung. Diese Arbeit wurde auch vom NIDDK K08 DK10175 an J.A.W. unterstützt. Die für diese Forschung verwendeten Bildgebungs- und Histologiekerne werden vom Mouse Histology and Phenotyping Laboratory, dem Electron Probe Instrumentation Center (EPIC) und dem Simpson Querrey Institute Equipment Core an der Northwestern University sowie von einem Cancer Center Support Grant (NCI CA060553) unterstützt. Die Autoren möchten den Mikrochirurgie-Kern der Northwestern University für die Beschaffung von Nagetiernieren anerkennen. Bewertung der Morphologie der renalen tubulären Epithelien nach Rezellularisierung, durchgeführt in der Fluoreszenzmikroskopie Shared Resource mit Unterstützung von P30 CA118100.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Reagenzien
TRITON X-100, Proteomics Grade, AMRESCOVWR M143-4L
Natriumdodecylsulfatlösung, BioUltra, für die Molekularbiologie, 20% in H2OSigma-Aldrich05030
Peressigsäurelösung, purum, ~ 39% in Essigsäure (RT)Sigma-Aldrich77240Peressig ist brennbar und ätzend. Bereiten Sie sich in einem Abzug mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (z. B. Handschuhe, Schutzbrille) vor.
200 proof EthanolVWRV1001TP
Sigmacote, silikonisierendes Reagenz für Glas und andere OberflächenSigma-AldrichSL2Für die Behandlung von Bioreaktor-Reservoirs. Im Text als silikonisierendes Reagenz bezeichnet.
DMEM/F12 mediaLife Technologies11320-033
Corning cellgro Fötales Kälberserum Premium, MediatechCorning35-010-CV
Penicillin-Streptomycin-Lösung, 100X 10.000 I.E. Penicillin 10.000 & Mikro; g/mL StreptomycinCorning30-002-CI
TrypLE Express (1X), Phenol RedLife Technologies12605-028Im Text als zelldissoziierendes Enzym bezeichnet.
Trypan Blue Stain (0,4%)Life Technologies15250-061
Resazurin-NatriumsalzSigma-AldrichR7017
Ausrüstung:
Masterflex L/S Digital Drive, 600 RPM, 115/230 VACCole-ParmerEW-07522-20
Masterflex L/S große Kartuschen für 07519-05 und -06 Pumpenköpfe.Cole-ParmerEW-07519-70Im Text als große Pumpenkartusche bezeichnet.
Masterflex L/S 8-Kanal-Pumpenkopf mit 4 Rollen.Cole-ParmerEW-07519-06
Gerade 6" Probenzange, gezahntVWR82027-438
*NierenperfusionsbioreaktorWilMad Labglass*SonderanfertigungenBioreaktoren werden wie von WilMad Labglass beschrieben hergestellt. Die Entwürfe wurden in einer früheren Veröffentlichung ausführlich beschrieben.
der Perfusionsschaltung
24 G x 0,75 Zoll BD Insyte Autoguard abgeschirmter IV-Katheter (0,7 mm x 19 mm) aus BD Vialon Biomaterial. Hat eine eingekerbte Nadel. (50/sp, 200/ca)BD Biosciences381412Im Text als 24-Gauge-Katheter bezeichnet.
Masterflex PharMed BPT Tubing, L/S #14, 25'Cole-ParmerHV-06508-14Im Text als peristaltische Pumpenschläuche bezeichnet.
Peroxidvernetzter Silikonschlauch, 1/16" ID x 1/8" OD, 25 ft/PackCole-ParmerHV-06411-62Im Text als Silikonkautschukschlauch mit 1/16" ID bezeichnet.
Masterflex platinvernetzter Silikonschlauch, L/S 14, 25 ft.Cole-ParmerHV-96410-14Im Text als dickwandiger Silikonkautschukschlauch mit 1/16" ID bezeichnet.
VWR Silikonschlauch, 1/4" ID x 0,5" ADVWR89068-484
Acro 50 Entlüftungsfilter, Pall Life SciencesVWR28143-558Im Text als 0,2-Mikron-Entlüftungsfilter bezeichnet.
Cole-Parmer Luer-Adapter, männlicher Luer-Lock auf 1/8" ID, Nylon, 25/pkCole-ParmerT-45505-11Im Text als männlicher Luer-Lock-auf-1/8"-Adapter mit Widerhaken bezeichnet.
Cole-Parmer Luer-Zubehör, männlicher Luer-Stecker, Nylon, 25/pkCole-ParmerEW-45505-58
Weiblicher Luer-x-weiblicher Luer-Adapter, Nylon, 25/pkCole-ParmerEW-45502-22Im Text als weiblicher Luer-x-weiblicher Luer-Adapter bezeichnet.
Cole-Parmer Luer-Zubehör, weibliche Luer-Kappe, Nylon, 25/pkCole-ParmerEW-45502-28
Smiths Medical Large Bore Hi-Flo Hahn # MX4311L - 3-Wege-Hi-Flo-Absperrhahn mit erweitertem Luer-Lock für Männer, Nicht-DEHP-Formulierung, latexfrei (LF), lipidbeständig, nicht PVD, 50/csCareforde Healthcare10254821Smiths Medical (Anbieter) lautet #MX4311L.
Weitere Komponenten
5 ml BD Luer-Lok Einwegspritze mit BD Luer-Lok™ Spitze.BD Biosciences309646
35 mm x 10 mm Easy Grip KulturschaleBD Biosciences353001Wird verwendet, um Zellsuspension in die Spritze für die Zellaussaat zu ziehen.
Komponenten Die Katalognummer von

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development
Posted by JoVE Editors on 3/03/2017. Citeable Link.

An erratum was issued for Epithelial Cell Repopulation and Preparation of Rodent Extracellular Matrix Scaffolds for Renal Tissue Development.

The human RCTEC/RCTE cell stocks used here and in Caralt et al., 2015, Uzarski et al., 2015 were originally provided by Dr. Loghman-Adham (then at St. Louis University) to co-author Dr. Wandinger-Ness (University of New Mexico) through an MTA in 2001. The SV40 immortalized human RCTEC/RCTE cells were characterized as being of distal tubule cell line as detailed in Loghman-Adham et al., 2003. On the basis of recent short tandem repeat (STR) DNA sequencing (Performed by IDEXX BioResearch) of the earliest passages of the RCTEC/RCTE cell stocks it became evident the cells were of mixed lineage. Further analyses of PCR products using QIAxcel capillary electrophoresis demonstrated the presence of a canine product. The product was sequenced and established to be of canine origin. A set of canine specific STR markers were compared to the sample and showed that the sample had a genetic profile with 92% identity to the MDCK cell line.  Later cell stocks that were used in the present publication were STR profiled and showed drift to 100% MDCK lineage. Despite being of canine origin, rather than human as was previously thought, MDCK is similarly a distal tubule epithelial cell line. For this reason, previous interpretation and conclusions drawn using these cells here and in Caralt et al., 2015, Uzarski et al., 2015 remain sound, but for purposes of rigor, reproducibility and experimental validation by others we report on this misidentification. This information will also be reported for listing on the International Cell Line Authentication Committee (ICLAC) database (http://iclac.org).

Schlagwörter

Renale extrazellul re MatrixDezellularisierungsprotokollPerfusionsbioreaktorEpithelzellbesiedlungNierenger st von Nagetierenhumane NierenzellenSterilisationsprozessmetabolische BewertungTubulogenese KulturGer st Rezellularisierung

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