Methodenartikel

Bakterielle Blatt Infiltration Assay für Bildende Charakterisierung pflanzlicher Abwehrreaktionen mit Hilfe der

DOI:

10.3791/53364

⸱

1. Oktober 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Alabama at Birmingham

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Die Quantifizierung des Erregerwachstums ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Charakterisierung verschiedener Immunantworten von Arabidopsis thaliana (im Folgenden: Arabidopsis). Das hier beschriebene Verfahren stellt einen optimierten Spritzeninfiltrationsassay zur Quantifizierung der Pseudomonas syringae pv dar. Maculicola ES4326-Wachstum in adulten Arabidopsis-Blättern.

Zusammenfassung

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In Abwesenheit von spezialisierten mobilen Immunzellen, Pflanzen nutzen ihre lokalisierten programmierten Zelltod und Systemische Akquirierte Resistenz, sich gegen Pathogenbefall verteidigen. Der Beitrag einer speziellen Arabidopsis Gens an der Gesamtanlage Immunantwort spezifisch und quantitativ durch Bestimmung des Wachstum des Pathogens im infizierten Gewebe bewertet. Seit über drei Jahrzehnten, die hemibiotrophe Bakterium Pseudomonas syringae pv. Maculicola ES4326 (PSM ES4326) wurde weithin als Modell Erreger, die molekularen Mechanismen der Arabidopsis Immunantwort zugrunde liegenden Untersuchung angewendet. Um Krankheitserreger in das Blattgewebe zu liefern, haben mehrfache Impfung Verfahren festgelegt, beispielsweise Spritzen Infiltration, dip Inokulation, Spray, Vakuuminfiltration, und Hochwasser Inokulation. Das folgende Protokoll beschreibt eine optimierte Spritze Infiltrationsverfahren zu virulenten Psm ES4326 in Blätter von erwachsenen liefernBodenkultur Arabidopsis-Pflanzen und genau Bildschirm für erhöhte Krankheitsanfälligkeit (EDS) gegenüber diesem Erreger. Zusätzlich kann dieses Protokoll mit mehreren Vorbehandlungen, ergänzt werden, um spezifische Immundefekten weiter zerlegen innerhalb unterschiedlicher Schichten des pflanzlichen Abwehr einschließlich Salicylsäure (SA) -Triggered Immunity (STI) und MAMP-Triggered Immunity (MTI).

Einleitung

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Aufgrund ihrer sessilen Natur werden Pflanzen ständig von einer Vielzahl von Krankheitserregern, die verschiedene Lebensweisen und Ernährungsstrategien 1 bedroht. In erster Näherung, biotrophen Erreger behalten ihre Gastgeber, am Leben zu Nährstoffen abzurufen, während nekrotrophe Krankheitserreger aktiv geheime Giftstoffe und Enzyme, um Wirtsgewebe töten und ernähren sich von den toten Zellen 1. Eine weitere Gruppe von Krankheitserregern, bezeichnet hemibiotrophs beginnt ihre Infektion natürlich mit der biotrophen Bühne und verschiebt sich nach nekrotrophe Stufe bei Erreichen einer bestimmten Schwelle von pathogenen Ansammlung 2. Um sich gegen diese Mikroorganismen wirksam zu verteidigen, haben Pflanzen einen komplizierten angeborenen Immunsystems mit mehreren Überwachungsmechanismen ausgestattet, um den Erreger Angriff zu erkennen und auslösen entwickelt lokalisiert programmierten Zelltod 3 sowie Systemische Akquirierte Resistenz (SAR) 4. Die aktuelle Forschung auf die Charakterisierung der wesentlichen sig konzentriertnaling Komponenten und Quer Gespräche innerhalb der Anlage Immunsystem 5.

Wie in der "Zig-Zag" Modell 5 vorgeschlagen, die erste Schicht der Anlage angeborenen Immunantwort erfordert die Anwesenheit von Plasmamembran lokalisierte pattern recognition receptors (PRR), um die Invasion einer Mikrobe zu erkennen. PRRs können Microbe-associated molecular patterns (mAmps) zu erkennen und zu etablieren MAMP-Triggered Immunity (MTI) 6. Neben Induktion eines Transkriptions-Hochregulierung von Genen antimikrobielle PR-Proteinen 7 kodiert, führt MTI auf eine Vielzahl von Ereignissen, die das Wachstum des Pathogens, einschließlich der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und reaktive Stickstoffspezies (RNS), Abscheiden Callose an die Zellwand zu verhaften sowie die Aktivierung von mehreren Kinase Signalwege 8.

Bis jetzt wurden mehrere MAMPS identifiziert MTI in Arabidopsis auslösen, einschließlich bakterieller flg22 9 (Ein 22 Aminosäurefragment von Flagellin abgeleitet) elf18 10 (18 Aminosäuren aus dem bakteriellen Elongationsfaktor Tu Übersetzung) und einem strukturellen Zellwandkomponente Peptidoglykane 11. Um eine erfolgreiche Infektion zu etablieren, haben einige spezielle Krankheitserreger die Möglichkeit, geheime Virulenz Effektor-Proteine ​​in die intrazelluläre oder interzellulären Räumen entwickelt und damit zu unter MTI und lösen Effektor-Triggered Anfälligkeit (ETS) 12,13. Zum Beispiel können die Virulenz Effektoren Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK) Phosphorylierungskaskaden MTI zu inaktivieren, um die Entwicklung der Erkrankung in dem infizierten Gewebe 14-16 induzieren. Während der dynamischen Koevolution zwischen Hosts und Krankheitserreger, Pflanzen entwickelte auch die Gegenstrategie, die Effektor-Proteine ​​erkennen und dämpfen das Pathogen Virulenz Moleküle 17. Diese direkte oder indirekte Effektor Erkennung durch Krankheitsresistenz (R) 18-Proteine ​​vermittelt wird. Meiste tSaum sind Mitglieder der NB-LRR (Nukleotid-Bindungs ​​und Leucin-reichen Wiederholungen) Familie 19. Die Wahrnehmung eines avirulenten Effektorzellen durch ein R-Protein löst eine stärkere und breitere Immunantwort charakterisiert als Effektor-Triggered Immunity (ETI) 20. Neben der Induktion der Expression von Abwehrgene 21 und die Produktion von Verteidigungsmetaboliten 22, ETI führt oft zu einer raschen lokalisierten programmierten Zelltod als hypersensible Reaktion (HR) bekannt, die Pathogen-Ausbreitung in das benachbarte Gewebe 3 zu beschränken.

Neben der lokalisierten programmierten Zelltods 23, sind Pflanzen der Lage, eine langfristige und systemweiten Immunantwort bezeichnet Systemische Akquirierte Resistenz (SAR) 4. Bei Provokation mit einem biotrophe Erreger, Pflanzenzellen auszulösen, die Biosynthese und Akkumulation eines endogenen Phytohormon Salicylsäure (SA) und PR-Proteinen sowohl in lokalen und systemischen Geweben 24. Durch tsein Verfahren ein gesteigertes Zustand der Bereitschaft in den nicht-infizierten Blättern, die für die Montage schneller Abwehrreaktionen bei einer nachfolgenden Infektion durch ein breites Spektrum von Erregern 24 ermöglicht erreicht. SA und ihre synthetischen Analoga, wie Benzo (1,2,3) thiadiazol-7-thiocarbonsäure-S-methyl ester (BTH) und 2,6-Dichlorisonicotinsäure (INA) in der Lage sind, chemisch zu induzieren Salicylsäure (SA) -Triggered Immunity (STI) bei der externen Anwendung 24. Nonexpressor der Pathogenese-Assoziierte Gene 1 (NPR1) wird vorgeschlagen, einer der SA-Rezeptoren und wirkt als Haupttranskriptionsregulator während SA-vermittelte Abwehrreaktion sowohl in lokalen und systemischen Geweben 21,25,26 sein. Es hat sich eindeutig gezeigt, dass NPR1 für SAR Einrichtung erforderlich ist, und der Verlust von NPR1 führt zu dramatischen Anfälligkeit gegenüber Pseudomonas syringae 25.

Um umfassend charakterisieren die molekularen Beitrag der PflanzenKomponenten in den Pflanzen-Pathogen-Interaktionen, mehrere Biotests wurden entwickelt, um spezifische Abwehr Veranstaltungen zu messen, einschließlich ROS Burst 27, Kallose-Abscheidung 28, Verteidigung Gene Expression und Anhäufung von ihrer Proteinprodukte 21. Während diese Einzeltests können Einblicke in eine spezifische Form der Pflanze Immunantwort bereitzustellen, keiner von ihnen ist jedoch in der Lage sind, das komplette Abwehrreaktion an der gesamten Pflanze Ebene darstellen. Umgekehrt ist die Quantifizierung der Pathogen Wachstum nach der Infektion bietet eine Gesamtschätzung der Immunantwort auf der organismischen Ebene. Daher ist die Entwicklung und Optimierung von einem präzisen und hoch standardisierte Erreger Inokulation Assay kritischen Kraftstoff den Forschungen und Entdeckungen auf den Arabidopsis Immunantworten.

Pseudomonas syringae, ein Gram-negatives Bakterium, wurde als Phytopathogen Lage verursacht Krankheit in einem Bereich von Wirten, einschließlich Pflanzen Arabidops identifiziertenist 29. Als Modellpflanze-Pathogen-System, das Arabidopsis - P. syringae Interaktion wurde in großem Umfang angewendet, um die molekularen Mechanismen zugrunde liegenden Pflanzenabwehrreaktionen 29 zu verstehen. Bisher über 50 P. syringae Pathovare wurden basierend auf ihrer Fähigkeit, verschiedene Pflanzenarten infizieren 30 identifizierten . P. syringae pv. tomato DC3000 (Pst DC3000) 31 und P. syringae pv. maculicola ES4326 (PSM ES4326) 32 sind die beiden am weitesten verbreitete und umfassend charakterisiert virulenten Stämmen. Abgesehen davon, dass durch die Pflanze erkannt und Auslösen des MTI Reaktion Pst DC3000 und PSM ES4326 sind zur Sekretion virulenten Effektorproteine ​​MTI drücken und lösen ETS, das Wachstum des Pathogens 31,33 begünstigen.

Funktionell sezieren die Interaktion zwischen Arabidopsis und P. syringae, multiple0; Pathogeninfektion Methoden wurden auf der Grundlage des Erregers Liefer Ansatz entwickelt. Für Bodenkultur Pflanzen, können Krankheitserreger mit einer Spritze Infiltration, Vakuuminfiltration, Tauch Inokulation und Sprühinokulation 29,34 geliefert werden. Vor kurzem wurde Sämling Flut Inokulation Assay entwickelt, um große Bildschirme auf Gewebekulturplatten durchführen wachsenen jungen Arabidopsis-Pflanzen 35. Syringe Infiltration, als einer der am häufigsten verwendeten Ansatz, manuell liefert die Erreger in den Apoplasten durch die natürlichen Blattöffnungen bezeichnet Spaltöffnungen 29. Durch diesen Ansatz, gleiche Mengen von P. syringae in die befallenen Blatt infiltriert werden und die Stärke der pflanzlichen Immunantwort ist umgekehrt an die das Wachstum des Pathogens Niveaus korreliert. Daher dient die Quantifizierung der Pathogen Wachstum als eine optimale Vorgehensweise, um die Immunfunktion im gesamten Werksebene zu bewerten. Darüber hinaus können Spritzen Infiltration der lokalen und systemischen Gewebe zu unterscheiden, worin B kanne in der Charakterisierung der molekularen Mechanismen SAR 36 erhoben.

In dem folgenden Protokoll beschreiben wir eine optimierte Spritze Infiltration Assay mit Psm ES4326 um Arabidopsis-Mutanten für erhöhte Krankheitsanfälligkeit (EDS) zu screenen. Dieses Protokoll wird zwei Arabidopsis-Genotypen zu beschäftigen: ein Wildtyp-Ökotyp Columbia-0 (Col-0), Pflanzen (Kontrolle) und npr1-1 loss-of-function-Mutanten (hypersusceptible) das wird mit virulenten Bakterienstamm Psm ES4326 37 infiziert werden. Die npr1-1 Mutante trägt eine Punktmutation in der Ankyrin-Repeat-Consensussequenz des NPR1 Molekül, das die hoch konservierten Histidin zu Tyrosin verändert und macht das Protein nicht-funktionellen 25. Darüber hinaus ist eine Anzahl von Modifikationen der Spritze Infiltration Assay beschrieben, die die Quantifizierung von Fehlern in den spezifischen Schichten aus Immunantwort, einschließlich MTI und STI ermöglichen.

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Protokoll

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Der folgende Text beschreibt eine schrittweise Protokoll optimiert Psm ES4326 Spritze Infiltration Assays in Arabidopsis. Haupt Verfahren dieses Assays sind in einem vereinfachten Ablaufplan (Figur 1) dargestellt.

1. Pflanzenwachstumsbedingungen

  1. Aussaat der Samen
    1. Bereiten Sie 2 Töpfen (4 im Durchmesser, 3,75 in hoch) lose mit Boden und Wasser Töpfe durch Einweichen von unten O gefüllt / N vor dem Ablassen des überschüssigen Wassers.
    2. Säen 50-100 Arabidopsis Samen, Wildtyp Col-0 oder npr1-1 Mutante, auf jeden Topf mit einem gefalteten Blatt mit einem Gewicht von 70 mm oder andere Papier.
    3. Bedecken Sie den Topf mit einem mit Wasser besprüht transparenten Kuppel, um die relative Luftfeuchtigkeit um 80-90% (2A) zu erhöhen.
  2. Inkubieren Sie den Topf bei 4 ° C für 72 h bis zur vollständigen Schichtung und synchrone Keimung zu ermöglichen.
  3. Bringen Sie den Topf zu den Standard-Wachstumsbedingungen (12 Stunden Licht/ 12 Stunden Dunkelheit, 21 ° C, Lichtintensität von 100 & mgr; mol / m 2 / sec, relative Feuchte 40%), damit die Samen zu keimen. Knacken Sie den Dome, eine 2-3 in unmittelbar nach der Übertragung auf dem Wachstumsraum, die zur Vermeidung von Kondenswasserbildung wird die Öffnung zu erzeugen.
  4. Wenn das erste echte Blatt der Größe von 2-3 mm in der Länge erreicht, die Sämlinge aus dem Topf auf eine 72-Mulden-Wohnung mit Erde gefüllt.
    1. Verwenden Sie einen Finger oder einem 1 ml Pipettenspitze, um eine 1-in tiefe Depression in der Mitte der Bodenoberfläche in der Ebene erstellen.
    2. Vorsichtig trennen einzelnen Sämlinge mit so wenig Wurzelschäden wie möglich. Sorgfältig abholen Sämlinge, die intakten Wurzeln mit einer Pinzette zu haben.
    3. Legen Sie eine einzelne getrennte Keimling zusammen mit der anhaftenden Erde Klumpen der Transplantation Schock in die Vertiefung zu minimieren und sanft pat Sie den umgebenden Boden, um die Depression zu füllen. Entsorgen Sie die zusätzliche Jungpflanzen und Boden in biohazard Abfallbehälter und entsorgen gemäßmit den lokalen biohazard Entsorgungsrichtlinien.
    4. Wasser übertragen Sämlinge von oben und vollständig bedecken die Wohnung mit einem mit Wasser besprüht transparenten Kuppel auf 80-90% Feuchtigkeit zu halten. Halten Sie die Kuppel auf 3 Tage, dann brechen die Kuppel am Morgen von Tag 4 und vollständig zu entfernen, es bis zum Ende des Tages.
      Anmerkung: Säen kann alternativ durch die Schichtung Samen in 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen mit 1 ml 0,1% Agar für 48 Stunden bei 4 ° C gefolgt von Übertragen 2-3 Samen mit einer Glaspipette auf eine 72-Mulden flach mit Erde gefüllt, durchgeführt werden. Wohnungen müssen mit einer transparenten Kuppel, die 1 Woche entfernt werden kann nach der Keimung abgedeckt werden. Zusätzliche Sämlinge können entfernt werden, um nur ein Sämling pro Vertiefung zu verlassen.
  5. Wasserpflanzen alle zwei Tage durch Einweichen Wohnungen 1-in Wasser für 20 Minuten, dann lassen Sie das überschüssige Wasser.
    Hinweis: Das Zeitintervall für die Bewässerung von Pflanzen hängt von der Wachstumsraumfeuchte und muss entschlossen sein Basisd auf eine kontinuierliche Beobachtung des Pflanzenwachstums Anlage Benutzers. Überprüfen Pflanzen täglich um sicherzustellen, dass sie gut bewässert werden. Wenn nur wenige Stellen trocknen, Wasser solche Pflanzen von oben mit einer Spritzflasche.
  6. Zuführen Pathogeninfektion Tests (Schritt 3-5), die auf Pflanzen, die an oder nahe Entwicklungsstadium # 3.50 (wenn Rosette Größe beträgt 50% Endgröße), die je nach Wachstumsbedingungen (Photoperiode, Temperatur) auf 3-5 Wochen alt sind, entspricht. Infizieren nicht Pflanzen nach Blütenstände (Stufe # 5) durch Einsetzen der altersbedingten Widerstands 38,39.

2. Herstellung von Kultur, Medien und Platten

  1. Stellen Sie 1 l Königs B (KB) flüssiges Medium. Vorsichtig umrühren 20 g Proteosepepton und 2 g Kaliumhydrogenphosphat-Trihydrat mit einem magnetischen Rührstab mit 1000 ml entionisiertem H 2 O bis keine sichtbare Pellet. Aliquot 100 ml in 150 ml Glasflaschen und Autoklaven auf einem 20-min Flüssigkeitskreislauf.
  2. BereitenKulturplatten mit KB festen Medium.
    1. Vorsichtig umrühren 20 g Proteosepepton, 2 g dibasisches Kaliumphosphat-Trihydrat und 15 g Agar mit 1000 ml entionisiertem H 2 O Autoklaven.
    2. Cool down das Medium auf einer magnetischen Rührplatte, bis es kühl anfühlen, um zukünftige Kondensation zu minimieren und den Abbau von Antibiotika zu vermeiden. Hinzuzufügen 18 ml steriles 80% Glycerin und 5 ml sterilem 1 M MgSO 4 und dem Medium. Da Psm ES4326 trägt Beständigkeit gegen Streptomycin, hinzuzufügen Streptomycin in das gekühlte Medium auf eine Endkonzentration von 50 ug ml - 1.
    3. Gießen Sie die Platten. Bereiten Sie zwei verschiedene Größen von KB Medienplatten: 100 mm x 15 mm und 150 mm x 15 mm Petrischalen. Der kleinere Petrischale mit Medium dient als primäre Bakterienkulturplatten, und die größere Petrischale dient als Bakterienzählvorrichtung Platte.
      Hinweis: Für den Bakterien zu zählen Platten können rechteckige Platten verwendet werden, um das zu reduzierenVerbrauchskosten, da doppelt so viele Behandlungen können pro Platte aufgetragen Vergleich zu traditionellen Ronden werden.
      1. Gießen Sie die Platten vor der Infektionsversuch. Speicher KB Medium-Platten bei 4 ° C für bis zu 2-3 Monaten seit Streptomycinsulfat verliert allmählich die antibiotische Aktivität 40.

3. Erhöhte Krankheitsanfälligkeit (EDS)

  1. Tag 1 - Streak Bakterien auf Platte
    1. Zwei Tage vor dem EDS-Test, streak Psm ES4326 von -80 ° C Glycerolstammlösung auf einem KB-Strep Bakterienkultur Platte und Inkubation bei 28 ° C für 24-48 Stunden.
  2. Tag 2 - Einleitung Flüssigkultur und Wasserpflanzen
    1. Initiieren Sie die Flüssigkultur in einem sterilen Reagenzglas mit 4 ml Flüssigkeit KB-Medium, das 50 ug ml - 1 Streptomycin und schütteln mit 250 Upm, 28 ° CO / N.
      Hinweis: Für die EDS-Infektion-Test unter Verwendung von 6 Pflanzen pro Genotyp empfehlened. Für STI und MTI Assays werden 6 Pflanzen pro Genotyp pro Behandlung empfohlen. Für die Bakterien-Inokulum, ist es empfehlenswert, einen frischen Flüssigkeitskultur mit der optischen Dichte bei λ 600 nm zwischen 0,3 und 0,6 zu verwenden.
    2. Markieren Sie die Blattstiele der Blätter Nummer 5 und 6 mit einem stumpfen Enden wasserdichte Marker zur einfachen Identifizierung von infiziertem Gewebe bei der Probenahme (Abbildung 1). Um die Öffnung der Stomata zu verbessern und in das Blatt zu erleichtern das Eindringen von Pathogen-Lösung, Wasser die Pflanzen auch durch Eintauchen der Flach von unten für 20 Minuten, dann lassen Sie das überschüssige Wasser.
      Hinweis: Alternativ, decken Sie die Wohnung mit einer transparenten Kuppel und genießen sie in Wasser für 2-4 Stunden, um die Stomata Öffnung zu erhöhen.
    3. Tag 3 - Pathogen Verdünnung und Spritze Infiltration
      Hinweis: Pathogen-Infektion während der Morgenstunden ist optimal für Erreger Verbreitung und Entwicklung der ausgeprägtesten Krankheitssymptome an anfälligen Genotypen. Alle Anstrengungen unternehmen, um den Infekt zu haltenIonen-Timing im Einklang, um die Wirkung der zirkadianen Rhythmen und tageszeitlichen Genregulation 41,42, die Verringerung der Unterschiede zwischen den experimentellen Wiederholungen hilft dabei.
      1. Pellet die Bakterienkultur in einer Mikro 1,5 ml Röhrchen bei 9.600 × g für 2 min bei RT und den Überstand verwerfen. Resuspendieren Bakterienpellet mit 1 ml sterilem 10 mM MgCl 2.
        Anmerkung: Magnesiumkationen können die Motilität und Adhäsion von P. erweitern syringae 43. Alternativ können MgSO 4 bei der gleichen Konzentration. Steriles Wasser ist ein akzeptabler Ersatz für die Mg-Salz-Lösungen.
      2. Verdünne die Bakteriensuspension mit 9 ml 10 mM MgCl 2 in einem 50 ml-Zentrifugenrohr und Messen der optischen Dichte (OD) von Bakterien, die mit einem Spektrophotometer bei λ = 600 nm. Verdünnen Sie die Bakterien, die mit 10 mM MgCl 2 auf die endgültige OD 600nm = 0,0002 für die EDS-Infektion-Test.
      3. Infiltrieren die Blattmit einer 1 ml stumpfen Ende nadellose Spritze (allgemein bekannt als der Insulinspritze bekannt), die die verdünnten Bakterienlösung enthält.
      4. Haben Sie die Spritze bis zu seiner vollen Kapazität zu füllen nicht. Füllen Sie es mit 0,5-0,6 ml, für eine viel bessere Kontrolle während des Infiltrationsprozess zu ermöglichen.
      5. Setzen die untere Oberfläche des Blattes auf der Oberseite der Zeigefinger, und dann sanft Einstellen der Blattposition mit Hilfe des Daumens. Positionieren Sie die Spritze senkrecht gegen die Blattoberfläche, um sicherzustellen, dass der Druck gleichmäßig verteilt wird. Versuchen Sie, die Mittelrippe Bereich während der Infiltration zu vermeiden zu Blattschäden zu reduzieren.
      6. Langsam drücken Sie den Kolben, um die Bakterienlösung zu infiltrieren; Flüssigkeitseintritt in das Blatt Mesophyll wird sichtbar gemacht werden, wie durch die dunklere Blattfarbe gekennzeichnet. Versuchen, die gesamte Oberfläche des Blattes zu infiltrieren. Wird dies nicht in einem einzigen Versuch erreicht, wählen Sie einen anderen Ort Infiltration und wiederholen Sie die oben, bis die gesamte Blattfläche abgedeckt beschriebenen Aktionen.
      7. Einmal vollendet, tupfen Sie leicht den Blatt mit saugfähigen Tuch, um die zusätzliche Erreger Lösung zu entfernen. Sichtprüfung der infizierten Blattgewebe auf Beschädigungen.
        Hinweis: Die kreisförmige Spritze Eindruck sollte nicht sichtbar sein, nachdem die Infiltration abgeschlossen ist.
      8. Lassen Sie die infiltrierten Pflanzen für 1-2 Stunden trocknen, bevor sie dann wieder in ihre ursprüngliche Wachstumsbedingungen. Weiter, Spray eine klare Kuppel mit Wasser und decken die infizierten Pflanzen für 2 Stunden, dann reißen die Kuppel, um eine 2-3 in der Öffnung zu erzeugen, und lassen Sie es auf den Rest des Infektionsversuch.
        Hinweis: Da P. syringae ist keine Luft Pathogen, besteht keine Gefahr einer Ausbreitung des infektiösen Mittels auf andere Pflanzen in der gleichen Anlage gezüchtet. Jedoch als zusätzliche Vorsichtsmaßnahme zu vermeiden physischen Kontakt zwischen infizierten Pflanzen und anderen Versuchsanlagen in der Nähe. Abdecken der Wohnung mit einer transparenten Kuppel wird das Pathogen Virulenz zu erhöhen und zu beschleunigen, Fortschreiten der Krankheit. Dasmüssen für diesen Schritt und die optimale Dauer der Deckperiode muss auf der Grundlage der Feuchtigkeit von Pflanzenwachstumsmöglichkeiten des Benutzers bestimmt werden.
    4. Tag 5 - Pre-trocknen die Medien Platten
      1. Nehmen Sie die 150 mm x 15 mm KB-Platten aus dem Kältespeicher und trocknen bereits vorhandene Wasserkondensation auf der Platte. Trockenplatten, indem man sie bei Raumtemperatur für etwa 24 Stunden. Um diesen Prozess zu beschleunigen, legen Sie sie in einer Sterilbank mit ihren Deckeln für 30-60 Minuten geknackt.
        Anmerkung: Dieser Schritt ist kritisch für die Bildung kreisförmiger Tropfens auf der Oberfläche der Platte in dem nächsten Schritt.
    5. Tag 6 - Quantifizierung der Pathogen Wachstum
      Hinweis: Die folgende Pathogen Quantifizierungsverfahren kann zu früheren Zeitpunkten nach der Infektion durchgeführt, um gleiche Mengen von Bakterien in das Blatt zugeführt, insbesondere bei Pflanzen Blattmorphologie verändert bestätigen.
      1. Verarbeiten Sie die infizierten Gewebe nach der EntstehungChlorose durch die Gelbfärbung der infizierten Gewebe in den empfänglichen Genotypen gezeigt, aber vor der Entwicklung nekrotischer Läsionen (2B).
        Hinweis: Empfohlene Abtastzeit ist drei Tage nach der Inokulation des Erregers. Da jedoch Pathogen Wachstum hängt von einer Reihe von Umweltfaktoren, die Länge der Inkubation kann in einem Bereich von 2 ½-3 ½ Tagen variieren und muss durch sorgfältige Beobachtungen der Infektion Progression in Pflanzenwachstumsmöglichkeiten des Benutzers bestimmt werden.
        1. Vorzubereiten 6 Probenröhrchen für jeden Genotyp (Abbildung 1). Setzen Sie einen Edelstahl Mahlkugel und fügen Sie 500 ul sterilem 10 mM MgCl 2 in die jedes Röhrchen.
        2. Nehmen Sie den infizierten Blatt von der Pflanze und Punsch ein Blattscheibe mit einem 1-Loch-Locher (Abbildung 1).
          Hinweis: Um den Stichprobenfehler zu minimieren, versuchen, jede abgetastete Blatt an der gleichen Stelle zu stanzen. Sampling der Blattscheibe von obender Blatt empfohlen.
        3. Zufällig Platz 2 Blattscheiben (aus zwei verschiedenen Pflanzen) in jedem Schleifrohr mit einer Pinzette.
        4. Abdichten des Rohres und Homogenisieren des Gewebes mit einer Hochdurchsatz-Homogenisators bei maximaler Geschwindigkeit (1600 Hübe pro Minute) für 10 min. Wiederholen Sie diesen Vorgang, wenn nötig, bis Gewebe gut homogenisiert und die Lösungen werden grün durch Chlorophyll-Freisetzung aus den infizierten Blättern.
      2. Während der Wartezeit für die Homogenisierung, füllen die ersten 6 Zeilen einer 96-Well-Kulturplatte mit 180 & mgr; l 10 mM MgCl 2 unter Verwendung einer Mehrkanal-Pipette und eine Pipettiervorrichtung Reservoir.
      3. Nach dem Schleifen übertragen 20 ul Grundgewebesuspension in die erste Reihe der 96-Well-Platte und mischen durch mehrmaliges Pipettieren der Flüssigkeit nach oben und unten. Wenn kleine Fragmente von Gewebe verstopfen die Spitze, Clip es um 2-3 mm zu helfen, erwerben die richtige Volumen der Lösung.
        1. Um ausreichend Platz für den Tröpfchen auf die Oberseite o liefernf die Platte den Raum der Gewebe von verschiedenen Genotypen in alternativen Reihen (Abbildung 1). Um eine zehnfache Verdünnungsreihe vorzubereiten, übertragen 20 ul Flüssigkeit in der zweiten Zeile und wiederholen Sie den Vorgang, bis der sechsten Verdünnung.
      4. Transfer 20 ul Lösung aus der 96-Well-Platte auf die 150 mm x 15 mm-Platte unter Verwendung KB aufgeteilt Pipettenspitzen (Abbildung 1). Arbeiten aus dem die meisten verdünnten Suspension auf die am stärksten konzentrierten.
        Anmerkung: Ausgehend von den meisten für die meisten konzentrierten verdünnt macht es unnötig, Pipettenspitzen zwischen den Verdünnungen ändern. Wenn die Platte gut vorgetrocknet, sollte die übertragenen Tröpfchen intakt auf der Oberseite des Mediums bleiben, bis absorbiert (in der Regel 15 bis 30 min). Die Trocknungszeit variiert mit der RT und der Luftfeuchtigkeit.
      5. Trocknen Sie die Platte bei RT mit Deckel geknackt. Sobald keine Flüssigkeit mehr kann auf der Plattenoberfläche beobachtet werden, schließen Sie den Deckel, Invertzucker und inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur oder 28 ° C Inkubator.
      6. Inkubation erfolgt während 40 bis 60 Stunden, bis die Kolonien sichtbar werden. Zu bestätigen, dass das Wachstum auf den Platten reflektiert die vorhersagbare 10fachen Abfall der koloniebildenden Einheiten (cfu) (2C). Zählen Sie die Bakterien, bevor sie überwuchern und Kolonien zu verschmelzen. Bestimmen Sie die Anzahl der Bakterien in der niedrigsten Verdünnung, die keine überlappenden Kolonien. In der Regel ist das bevorzugte Verdünnungs gezählt werden zwischen 10-50 Kolonien enthalten.
        Hinweis: Variation kann unter technische Replikate vorhanden sein; daher sollte die niedrigste Verdünnung für jede Wiederholung gesondert zu ermitteln.
      7. Um das Niveau der Bakterienvermehrung zu berechnen, dokumentieren Sie die Nummer der Reihe (R) sowie die Anzahl der Bakterien in jedem technischen replizieren (T) schriftlich. Bestimmung der Anzahl der koloniebildende Einheit - cfu / Blattscheibe durch die Formel: KBE / Blattscheiben = (T × R 10/20) · 500/2
      8. Geben Sie die Daten in der folgenden Tabellenvorlage zu produce eine Grafik (Abbildung 1) (für Tabellenkalkulationsdatenanalyse Vorlage-Datei, siehe Tabelle 2). Jeder Datenpunkt wird als Mittelwert aus sechs technische Replikate auf einer logarithmischen Skala dargestellt. Fehlerbalken stellen 95% -Konfidenzintervall des Mittelwertes (n = 6).
        Anmerkung: Die Berechnung der 95% -Konfidenzintervalle muss auf der Grundlage der Anzahl der technische Replikate eingestellt werden.

4. SA-Triggered Immunity (STI)

  1. Tag 1: Folgen Sie dem gleichen Verfahren wie in Schritt 3.1 beschrieben.
  2. Tag 2: Zusätzlich zur Bewässerung der Pflanzen und die Einleitung des flüssigen Bakterienkultur (Schritt 3.2), induzieren Widerstand durch äußere Anwendung von SA-Derivat Sodium Salicylate 21.
    Hinweis: Reine SA hat eine schlechte Wasserlöslichkeit und bedarf der vorherigen pH-Einstellung, so dass es nicht für diesen Test empfohlen.
    1. Um SA-vermittelten Abwehr gegen P. induzieren syringae und Prime die Pflanzen für die zukünftige Infektion 21,24, Spritzanlagen mit einem feinen Nebel von 1 mM Natriumsalicylat oder H 2 O (als mock) 16-24 h vor der Pathogeninfektion.
  3. Tag 3: Bereiten Erreger Verdünnung auf OD 600nm = 0.001 und drücken Sie die Bakterien in der gesamten Blattoberfläche mit einer Spritze Infiltration (Schritt 3.3).
  4. 6. Tag: Für Erreger Quantifizierung und Zählvorgang, folgen Sie den Anweisungen wie für die EDS-Test (Schritte 3.4 und 3.5) beschrieben. Platte und zähle die H 2 O und Sodium Salicylate - vorbehandelten Proben getrennt. Vorbehandelten Pflanzen - für Wildtyp-Arabidopsis wird ein 1-2 log Reduktion in Pathogen Wachstum in den Sodium Salicylate erwartet.

5. MAMP-Triggered Immunity (MTI)

Hinweis: Bei diesem Test verwenden wir Arabidopsis-Wildtyp Col-0 und mutierten FLS2 und EFR Pflanzen. FLS2 und EFR sind Plasmamembran lokalisierte pattern recognition receptors (PRR), die flg22 und elf18 erkennen können, welche nach Süctively 9,10. Verlust jeder PRR ergibt die Unempfindlichkeit auf die spezifische Art von MAMP, die von dem unveränderten Wachstum des Pathogens in der Mutante folgenden externen MAMP Vorbehandlung und Spritze Infiltration mit Psm ES4326 deutet ist.

  1. Tag 1 und 2: Folgen Sie dem gleichen Verfahren wie in Schritt 3.1 und 3.2 beschrieben.
  2. Tag 3: MAMP Vorbehandlung und Pathogeninfektion
    1. Um den MAMP-Triggered Immunität aufzubauen, bereiten 1 uM Lösung von Flagellin Epitop flg22 oder EF-Tu-Epitop elf18 und Spritze-zu infiltrieren sie in der gesamten Blattoberfläche 4 h vor der Pathogeninfektion (Schritte 3.3.3-3.3.6). Dies wird für die Induktion der MAMP-vermittelten Abwehr gegen P. ermöglichen syringae und Prime die Pflanzen für zukünftige Infektionen 6,37.
      Hinweis: Öffentlich zugängliche Microarray-Daten ergab die maximale Transkriptions Umprogrammierung der MAMP-responsive Gene geschieht, 4 h nach flg22 oder elf18 Behandlung 37,44. Somit ist 4 Stunden die empfohleneDauer des MAMP Vorbehandlung, die bei der Verwirklichung einer klaren Unterschied in der Pathogen Wachstum zwischen MAMP behandelten Col-0 und FLS2 und EFR-Mutanten führt.
    2. Entfernen Sie die zusätzlichen MAMP-Lösung mit saugfähigen Tuch und lassen Sie die Pflanzen aufgedeckt, um das flüssige Absorptionsprozess innerhalb des Blattes zu beschleunigen. Um sich für die Verwundung Wirkung vom Spritzendruckinfiltration Konto, zu infiltrieren H 2 O in den Blättern von Kontrollpflanzen.
    3. Bereiten Erreger Verdünnung auf OD 600nm = 0.001 und drücken Sie die Bakterien in der gesamten Blattoberfläche von MAMP / H 2 O vorbehandelt Blatt mit einer Spritze Infiltration (Schritt 3.3).
  3. 6. Tag: Für Erreger Quantifizierung und Zählvorgang, folgen Sie den Anweisungen wie in Schritt 3.4 und 3.5 beschrieben. Platte und zählen Sie die H 2 O und MAMP-vorbehandelten Proben getrennt. In Wildtyp-Arabidopsis, eine 1-2 log Reduktion der Pathogen Wachstum in den MAMP-vorbehandelten Pflanzen zu erwarten, mit etwas starker Reduktion durch flg22 vermittelten Vergleich zu elf18.

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Ergebnisse

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Das Protokoll beschreiben wir hier stellt eine optimierte P. syringae Spritze Infiltration Assay eine quantitative Bewertung der Immunantwort in Arabidopsis-Pflanzen. Wie in Figur 1 dargestellt ist, ist die Spritze Infiltration Psm ES4326 von Pathogen-Extraktion und Quantifizierung über serielle Verdünnungen und Kolonien Aufzählung folgt.

Wie in Schritt 3 im Protokolltext beschrieben, kann Verbesserte Krankheitsanfälligkeit (EDS) gegen Psm...

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Diskussion

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Mit abnehmender verfügbaren Ackerland und wachsende Bevölkerung, sind die Forscher auf der ganzen Welt mit der dringendsten Bedürfnisse für die Verbesserung von Kulturpflanzen in Frage gestellt. Die Ausbeute kann stark durch verschiedene biotische und abiotische Stressfaktoren beeinflusst werden. Unter ihnen ist Pathogeninfektion eine der führenden Ursachen für Ernteertragsreduktion, für ca. 12% Verluste allein in den USA 45 verantwortlich. Um dieses Problem zu beheben, hat massive Forschung im Modell Arabido...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

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Wir danken Dr. Shahid Mukhtar für die Kritik am Manuskript und Dr. Xinnian Dong für die Beispieldatenanalysedatei. Diese Arbeit wird durch einen NSF-CAREER-Preis (IOS-1350244) der KPM und des UAB Biology Department unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
MetroMix 360 GrosouthSNGMM360
Große TöpfeGrosouthTEKUVCC10TC
12 x 6 EinsätzeGrosouthLM1206
11x 21 Flats ohne LöcherGrosouthLM1020
11x 21 Flats mit LöchernGrosouthLM1020H
Vinyl-AnzuchtkuppelnGrosouthCW-221
Proteose PeptonFisher ScientificDF0122-17-4
Kaliumphosphat Dibasisches Trihydrat MP Biomedicals151946
Agar Fisher ScientificA360-500
StreptomycinsulfatBio Basic IncSB0494
100 x 15 mm PetrischalenFisher ScientificFB0875713
150 x 15 mm PetrischalenFisher ScientificR80150
Rechteckige PlatteFisher Scientific12-565-450 
MgCl2 HexahydratBio Basic IncMB0328
GlycerolBio Basic IncGB0232
MgSO4  Bio Basic IncMN1988
1 ml SpritzeFisher ScientificNC9992493 
KimwipeFisher Scientific06-666-A
Mahlrohre Denville ScientificB1257
Kappen zum Schleifen von RöhrchenDenville ScientificB1254
Edelstahl-SchleifkugelFisher Scientific2150
96-Well-Platte Fisher Scientific12-556-008
NatriumsalicylatSigma Aldrichs3007-1kg
flg22 (QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA)GenescriptAuf Bestellung
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)GenescriptAuf Bestellung
LocherKlammern146308
Biophotometer plusEppendorf
PowerGen Hochdurchsatz-HomogenisatorFisher Scientific02-215-503
Akku-Spin-MikrozentrifugeFisher Scientific13-100-675
Mehrkanalpipette (10-100 & Mikro; l)Eppendorf3122 000.043
Mehrkanalpipette (30-300 & Mikro; l)Eppendorf3122 000.060
Pipette (20&Mikro; l)Eppendorf3120 000.038
PipettenspitzenFisher Scientific3552-HR
Sharpie PermanentMarker Staples507130
1,5 ml TubeEppendorf22363204
PinzetteFisher Scientific08-890
952000006

Referenzen

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  1. Glazebrook, J. Contrasting mechanisms of defense against biotrophic and necrotrophic pathogens. Annu. Rev. Phytopathol. 43, 205-227 (2005).
  2. Hammond-Kosack, K. E., Jones, J. D. Plant disease resistance genes. Annual review of plant biolog. 48, 575-607 (1997).
  3. Pontier, D., Balague, C., Roby, D. The hypersensitive response. A programmed cell death associated with plant resistance. C R Acad Sci II. 321, 721-734 (1998).
  4. Ryals, J. A., et al. Systemic Acquired Resistance. Plant Cel. 8, 1809-1819 (1996).
  5. Jones, J. D., Dangl, J. L. The plant immune system. Natur. 444, 323-329 (2006).
  6. Newman, M. A., Sundelin, T., Nielsen, J. T., Erbs, G. MAMP (microbe-associated molecular pattern) triggered immunity in plants. Front Plant Sc. 4, 139(2013).
  7. Fritig, B., Heitz, T., Legrand, M. Antimicrobial proteins in induced plant defense. Curr Opin Immuno. 10, 16-22 (1998).
  8. Nicaise, V., Roux, M., Zipfel, C. Recent advances in PAMP-triggered immunity against bacteria: pattern recognition receptors watch over and raise the alarm. Plant Physio. 150, 1638-1647 (2009).
  9. Zipfel, C., et al. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Natur. 428, 764-767 (2004).
  10. Kunze, G., et al. The N terminus of bacterial elongation factor Tu elicits innate immunity in Arabidopsis plants. Plant Cel. 16, 3496-3507 (2004).
  11. Gust, A. A., et al. Bacteria-derived peptidoglycans constitute pathogen-associated molecular patterns triggering innate immunity in Arabidopsis. J Biol Che. 282, 32338-32348 (2007).
  12. Alfano, J. R., Collmer, A. Type III secretion system effector proteins: double agents in bacterial disease and plant defense. Annu Rev Phytopatho. 42, 385-414 (2004).
  13. Tyler, B. M. Entering and breaking: virulence effector proteins of oomycete plant pathogens. Cell Microbio. 11, 13-20 (2009).
  14. He, P., et al. Specific bacterial suppressors of MAMP signaling upstream of MAPKKK in Arabidopsis innate immunity. Cel. 125, 563-575 (2006).
  15. Gimenez-Ibanez, S., et al. AvrPtoB targets the LysM receptor kinase CERK1 to promote bacterial virulence on plants. Curr Bio. 19, 423-429 (2009).
  16. Zhang, Z., et al. Disruption of PAMP-induced MAP kinase cascade by a Pseudomonas syringae effector activates plant immunity mediated by the NB-LRR protein SUMM2. Cell Host Microb. 11, 253-263 (2012).
  17. Chisholm, S. T., Coaker, G., Day, B., Staskawicz, B. J. Host-microbe interactions: shaping the evolution of the plant immune response. Cel. 124, 803-814 (2006).
  18. Jones, D. A., Takemoto, D. Plant innate immunity - direct and indirect recognition of general and specific pathogen-associated molecules. Curr Opin Immuno. 16, 48-62 (2004).
  19. Elmore, J. M., Lin, Z. J., Coaker, G. Plant NB-LRR signaling: upstreams and downstreams. Curr Opin Plant Bio. 14, 365-371 (2011).
  20. Gassmann, W., Bhattacharjee, S. Effector-triggered immunity signaling: from gene-for-gene pathways to protein-protein interaction networks. Mol Plant Microbe Interac. 25, 862-868 (2012).
  21. Wang, D., Weaver, N. D., Kesarwani, M., Dong, X. Induction of protein secretory pathway is required for systemic acquired resistance. Scienc. 308, 1036-1040 (2005).
  22. Bednarek, P. Chemical warfare or modulators of defence responses - the function of secondary metabolites in plant immunity. Curr Opin Plant Bio. 15, 407-414 (2012).
  23. Heath, M. C. Hypersensitive response-related death. Plant Mol Bio. 44, 321-334 (2000).
  24. Fu, Z. Q., Dong, X. Systemic acquired resistance: turning local infection into global defense. Annu Rev Plant Bio. 64, 839-863 (2013).
  25. Cao, H., Glazebrook, J., Clarke, J. D., Volko, S., Dong, X. The Arabidopsis NPR1 gene that controls systemic acquired resistance encodes a novel protein containing ankyrin repeats. Cel. 88, 57-63 (1997).
  26. Wu, Y., et al. The Arabidopsis NPR1 protein is a receptor for the plant defense hormone salicylic acid. Cell Re. 1, 639-647 (2012).
  27. Smith, J. M., Heese, A. Rapid bioassay to measure early reactive oxygen species production in Arabidopsis leave tissue in response to living Pseudomonas syringae. Plant Method. 10, 6(2014).
  28. Nomura, K., et al. A bacterial virulence protein suppresses host innate immunity to cause plant disease. Scienc. 313, 220-223 (2006).
  29. Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. The Arabidopsis book/American Society of Plant Biologist. 1, (2002).
  30. Sawada, H., Suzuki, F., Matsuda, I., Saitou, N. Phylogenetic analysis of Pseudomonas syringae pathovars suggests the horizontal gene transfer of argK and the evolutionary stability of hrp gene cluster. J Mol Evo. 49, 627-644 (1999).
  31. Xin, X. F., He, S. Y. Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000: a model pathogen for probing disease susceptibility and hormone signaling in plants. Annu Rev Phytopatho. 51, 473-498 (2013).
  32. Dong, X., Mindrinos, M., Davis, K. R., Ausubel, F. M. Induction of Arabidopsis defense genes by virulent and avirulent Pseudomonas syringae strains and by a cloned avirulence gene. Plant Cel. 3, 61-72 (1991).
  33. Mackey, D., Holt 3rd, B. F., Wiig, A., Dangl, J. L. RIN4 interacts with Pseudomonas syringae type III effector molecules and is required for RPM1-mediated resistance in Arabidopsis. Cel. 108, 743-754 (2002).
  34. Tornero, P., Dangl, J. L. A high‐throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana. The Plant Journa. 28, 475-481 (2001).
  35. Ishiga, Y., Ishiga, T., Uppalapati, S. R., Mysore, K. S. Arabidopsis seedling flood-inoculation technique: a rapid and reliable assay for studying plant-bacterial interactions. Plant Method. 7, 32(2011).
  36. Zheng, X. Y., et al. Coronatine promotes Pseudomonas syringae virulence in plants by activating a signaling cascade that inhibits salicylic acid accumulation. Cell Host Microb. 11, 587-596 (2012).
  37. Pajerowska-Mukhtar, K. M., et al. The HSF-like transcription factor TBF1 is a major molecular switch for plant growth-to-defense transition. Curr Bio. 22, 103-112 (2012).
  38. Rusterucci, C., et al. Age-related resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato is associated with the transition to flowering in Arabidopsis and is effective against Peronospora parasitica. Physiological and molecular plant patholog. 66, 222-231 (2005).
  39. Boyes, D. C., et al. Growth stage–based phenotypic analysis of Arabidopsis a model for high throughput functional genomics in plants. The Plant Cell Onlin. 13, 1499-1510 (2001).
  40. Regna, P. P., Wasselle, L. A., Solomons, I. A. The stability of streptomycin. Journal of Biological Chemistr. 165, 631-638 (1946).
  41. Wang, W., et al. Timing of plant immune responses by a central circadian regulator. Natur. 470, 110-114 (2011).
  42. Hua, J. Modulation of plant immunity by light, circadian rhythm, and temperature. Current opinion in plant biolog. 16, 406-413 (2013).
  43. Cuppels, D. A. Chemotaxis by Pseudomonas syringae pv. tomato. Appl Environ Microbio. 54, 629-632 (1988).
  44. Qutob, D., et al. Phytotoxicity and innate immune responses induced by Nep1-like proteins. The Plant Cell Onlin. 18, 3721-3744 (2006).
  45. Pimentel, D., Lach, L., Zuniga, R., Morrison, D. Environmental and economic costs of nonindigenous species in the United States. BioScienc. 50, 53-65 (2000).
  46. Zeng, W., Melotto, M., He, S. Y. Plant stomata: a checkpoint of host immunity and pathogen virulence. Current opinion in biotechnolog. 21, 599-603 (2010).
  47. Ton, J., Flors, V., Mauch-Mani, B. The multifaceted role of ABA in disease resistance. Trends in plant scienc. 14, 310-317 (2009).
  48. Mahajan, S., Tuteja, N. Cold salinity and drought stresses: an overview. Archives of biochemistry and biophysic. 444, 139-158 (2005).
  49. León, J., Rojo, E., Sánchez‐Serrano, J. J. Wound signalling in plants. Journal of Experimental Botan. 52, 1-9 (2001).

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Spritzen Infiltrationsmethodeerh hte Krankheitsanf lligkeitSalicyls ure Immunit tMAMP ausgel ste Immunit tQuantifizierung des PathogenwachstumsHomogenisierung von Blattgewebe

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