Methodenartikel

Bakterielle Blatt Infiltration Assay für Bildende Charakterisierung pflanzlicher Abwehrreaktionen mit Hilfe der Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

DOI:

10.3791/53364

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1. Oktober 2015

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1Department of Biology, University of Alabama at Birmingham

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Die Quantifizierung des Erregerwachstums ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Charakterisierung verschiedener Immunantworten von Arabidopsis thaliana (im Folgenden: Arabidopsis). Das hier beschriebene Verfahren stellt einen optimierten Spritzeninfiltrationsassay zur Quantifizierung der Pseudomonas syringae pv dar. Maculicola ES4326-Wachstum in adulten Arabidopsis-Blättern.

Zusammenfassung

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In Abwesenheit von spezialisierten mobilen Immunzellen, Pflanzen nutzen ihre lokalisierten programmierten Zelltod und Systemische Akquirierte Resistenz, sich gegen Pathogenbefall verteidigen. Der Beitrag einer speziellen Arabidopsis Gens an der Gesamtanlage Immunantwort spezifisch und quantitativ durch Bestimmung des Wachstum des Pathogens im infizierten Gewebe bewertet. Seit über drei Jahrzehnten, die hemibiotrophe Bakterium Pseudomonas syringae pv. Maculicola ES4326 (PSM ES4326) wurde weithin als Modell Erreger, die molekularen Mechanismen der Arabidopsis Immunantwort zugrunde liegenden Untersuchung angewendet. Um Krankheitserreger in das Blattgewebe zu liefern, haben mehrfache Impfung Verfahren festgelegt, beispielsweise Spritzen Infiltration, dip Inokulation, Spray, Vakuuminfiltration, und Hochwasser Inokulation. Das folgende Protokoll beschreibt eine optimierte Spritze Infiltrationsverfahren zu virulenten Psm ES4326 in Blätter von erwachsenen liefernBodenkultur Arabidopsis-Pflanzen und genau Bildschirm für erhöhte Krankheitsanfälligkeit (EDS) gegenüber diesem Erreger. Zusätzlich kann dieses Protokoll mit mehreren Vorbehandlungen, ergänzt werden, um spezifische Immundefekten weiter zerlegen innerhalb unterschiedlicher Schichten des pflanzlichen Abwehr einschließlich Salicylsäure (SA) -Triggered Immunity (STI) und MAMP-Triggered Immunity (MTI).

Einleitung

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Aufgrund ihrer sessilen Natur werden Pflanzen ständig von einer Vielzahl von Krankheitserregern, die verschiedene Lebensweisen und Ernährungsstrategien 1 bedroht. In erster Näherung, biotrophen Erreger behalten ihre Gastgeber, am Leben zu Nährstoffen abzurufen, während nekrotrophe Krankheitserreger aktiv geheime Giftstoffe und Enzyme, um Wirtsgewebe töten und ernähren sich von den toten Zellen 1. Eine weitere Gruppe von Krankheitserregern, bezeichnet hemibiotrophs beginnt ihre Infektion natürlich mit der biotrophen Bühne und verschiebt sich nach nekrotrophe Stufe bei Erreichen einer bestimmten Schwelle von pathogenen Ansammlung 2. Um ....

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Protokoll

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Der folgende Text beschreibt eine schrittweise Protokoll optimiert Psm ES4326 Spritze Infiltration Assays in Arabidopsis. Haupt Verfahren dieses Assays sind in einem vereinfachten Ablaufplan (Figur 1) dargestellt.

1. Pflanzenwachstumsbedingungen

  1. Aussaat der Samen
    1. Bereiten Sie 2 Töpfen (4 im Durchmesser, 3,75 in hoch) lose mit Boden und Wasser Töpfe durch Einweichen von unten O gefüllt / N vor dem Ablassen des überschüssigen Wassers.
    2. Säen 50-100 Arabidopsis Samen, Wildtyp Col-0 oder npr1-1 Mutante, auf jeden Topf mit einem gefalteten Blatt mit einem Gewicht von 70 mm oder and....

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Ergebnisse

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Das Protokoll beschreiben wir hier stellt eine optimierte P. syringae Spritze Infiltration Assay eine quantitative Bewertung der Immunantwort in Arabidopsis-Pflanzen. Wie in Figur 1 dargestellt ist, ist die Spritze Infiltration Psm ES4326 von Pathogen-Extraktion und Quantifizierung über serielle Verdünnungen und Kolonien Aufzählung folgt.

Wie in Schritt 3 im Protokolltext beschrieben, kann Verbesserte Krankheitsanfälligkeit (EDS) gegen Psm.......

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Diskussion

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Mit abnehmender verfügbaren Ackerland und wachsende Bevölkerung, sind die Forscher auf der ganzen Welt mit der dringendsten Bedürfnisse für die Verbesserung von Kulturpflanzen in Frage gestellt. Die Ausbeute kann stark durch verschiedene biotische und abiotische Stressfaktoren beeinflusst werden. Unter ihnen ist Pathogeninfektion eine der führenden Ursachen für Ernteertragsreduktion, für ca. 12% Verluste allein in den USA 45 verantwortlich. Um dieses Problem zu beheben, hat massive Forschung im Modell Arabido.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

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Wir danken Dr. Shahid Mukhtar für die Kritik am Manuskript und Dr. Xinnian Dong für die Beispieldatenanalysedatei. Diese Arbeit wird durch einen NSF-CAREER-Preis (IOS-1350244) der KPM und des UAB Biology Department unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
MetroMix 360 GrosouthSNGMM360
Große TöpfeGrosouthTEKUVCC10TC
12 x 6 EinsätzeGrosouthLM1206
11x 21 Flats ohne LöcherGrosouthLM1020
11x 21 Flats mit LöchernGrosouthLM1020H
Vinyl-AnzuchtkuppelnGrosouthCW-221
Proteose PeptonFisher ScientificDF0122-17-4
Kaliumphosphat Dibasisches Trihydrat MP Biomedicals151946
Agar Fisher ScientificA360-500
StreptomycinsulfatBio Basic IncSB0494
100 x 15 mm PetrischalenFisher ScientificFB0875713
150 x 15 mm PetrischalenFisher ScientificR80150
Rechteckige PlatteFisher Scientific12-565-450 
MgCl2 HexahydratBio Basic IncMB0328
GlycerolBio Basic IncGB0232
MgSO4  Bio Basic IncMN1988
1 ml SpritzeFisher ScientificNC9992493 
KimwipeFisher Scientific06-666-A
Mahlrohre Denville ScientificB1257
Kappen zum Schleifen von RöhrchenDenville ScientificB1254
Edelstahl-SchleifkugelFisher Scientific2150
96-Well-Platte Fisher Scientific12-556-008
NatriumsalicylatSigma Aldrichs3007-1kg
flg22 (QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA)GenescriptAuf Bestellung
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)GenescriptAuf Bestellung
LocherKlammern146308
Biophotometer plusEppendorf
PowerGen Hochdurchsatz-HomogenisatorFisher Scientific02-215-503
Akku-Spin-MikrozentrifugeFisher Scientific13-100-675
Mehrkanalpipette (10-100 & Mikro; l)Eppendorf3122 000.043
Mehrkanalpipette (30-300 & Mikro; l)Eppendorf3122 000.060
Pipette (20&Mikro; l)Eppendorf3120 000.038
PipettenspitzenFisher Scientific3552-HR
Sharpie PermanentMarker Staples507130
1,5 ml TubeEppendorf22363204
PinzetteFisher Scientific08-890
952000006

Referenzen

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  1. Glazebrook, J. Contrasting mechanisms of defense against biotrophic and necrotrophic pathogens. Annu. Rev. Phytopathol. 43, 205-227 (2005).
  2. Hammond-Kosack, K. E., Jones, J. D. Plant disease resistance genes. Annual review of plant biolog. 48, 575-607 ....

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Schlagwörter

Spritzen Infiltrationsmethodeerh hte Krankheitsanf lligkeitSalicyls ure Immunit tMAMP ausgel ste Immunit tQuantifizierung des PathogenwachstumsHomogenisierung von Blattgewebe

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