Eine Methode zur Lineage Tracing von Hornhautzellen mit Multi-Farben-Fluoreszenz-Reporter-Mäuse

Zusammenfassung

In diesem Artikel beschreiben wir die Prinzipien für das Entwerfen und Durchführen eines mehrfarbigen Abstammungsverfolgungsexperiments mit R26R-Confetti-Mäusen. Wir bieten ein spezifisches Protokoll für die Verfolgung von Hornhautepithelzellen an, das für andere Gewebe von Interesse modifiziert werden kann.

Zusammenfassung

Experimente zur Abstammungsverfolgung definieren den Ursprung, das Schicksal und das Verhalten von Zellen in einem bestimmten Gewebe oder Organismus. Diese Technik wird seit vielen Jahrzehnten erfolgreich angewendet und hat bahnbrechende Erkenntnisse in der Entwicklungsbiologie hervorgebracht. In jüngerer Zeit wurde es von Stammzellbiologen eingesetzt, um verschiedene Stammzellpopulationen mit minimalen experimentellen Eingriffen zu identifizieren und zu verfolgen. Die jüngsten Entwicklungen in der Mausgenetik, die Verfügbarkeit einer großen Anzahl von Mausstämmen und die Fortschritte in der Fluoreszenzmikroskopie ermöglichen die unkomplizierte Entwicklung leistungsstarker Abstammungsverfolgungssysteme für verschiedene Gewebe mit grundlegender Expertise unter Verwendung kommerziell verfügbarer Werkzeuge. Wir haben uns kürzlich diese leistungsstarke Methodik zunutze gemacht, um die Herkunft und das Schicksal von Stammzellen an der Augenoberfläche mit Hilfe von R26R-Konfetti-Mäusen zu untersuchen. Dieses Modell bietet ein mehrfarbiges genetisches System für die zufällige Expression von 4 fluoreszierenden Genen. Hier beschreiben wir die Prinzipien dieser Methodik und stellen ein anpassungsfähiges Protokoll für die Gestaltung von Experimenten zur Herkunftsverfolgung zur Verfügung. speziell für das Hornhautepithel sowie für andere Gewebe.

Einleitung

Während der Embryonalentwicklung, Gewebe- und Organ Morphogenese statt durch eine genaue Programm, das in Bezug auf die Zellproliferation, Zellmigration und Abstammungslinie Spezifikation ^1-4 beschrieben werden kann. Diese biologischen Prozesse werden auch bei der Aufrechterhaltung der Erwachsenen Gewebehomöostase, die Stammzell-Regeneration erfordert beteiligt. Linienverfolgung, die Identifizierung und Verfolgung der Nachkommen einer bestimmten Art von Zellpopulation, stellt ein wichtiges Werkzeug für die Untersuchung der Embryogenese und Stammzellen Homöostase. Tatsächlich ist es in zunehmendem Maße in vielen Bereichen der Forschung eingesetzt. Insbesondere wurde Lineage Tracing ein wichtiges Instrument bei der Identifizierung der Herkunft und das Schicksal von Stammzellen in der Homöostase und der Entwicklung von Krebs. Dies liegt daran, dass es wesentliche Informationen, wie die Zelle im Kontext des intakten Gewebes oder Organismus verhält, mit minimalem experimentellen Eingriff zu schaffen, im Gegensatz zu Zellisolierung und in vitro-Kultur oder transplantatiauf, dass kann es zu ungewollten Verzerrung führen.

Traditionell Farbstoffe wie lipidlöslich Carbocyanin, die in die Plasmamembran von Zellen integrieren, wurden Linienverfolgung eingesetzt. Obwohl diese Arten von Experimenten wurden erfolgreich zu wichtigen Entdeckungen und geformt Samen Konzepte in der Entwicklungsbiologie ^5,6 geführt, einige Einschränkungen auf, einschließlich der Schwierigkeit, die Spezifität der Zielzellen zu steuern, die unerwünschte Wirkung des Farbstoffs auf das Zellverhalten und dem Verdünnungs müssen sie des Etiketts über die Zeit. Nukleotidanalogon Kennzeichnung Ansätze aktiviert dokumentieren die Existenz von Slow-Cycling "Etiketthaltezellen", die vermutlich entsprechen Stammzellen ^7,8 ruhenden. Obwohl diese Technik das Vorhandensein der langsamen zyklierenden Zellen basierend auf Proliferation Kinetik über einen begrenzten Zeitraum zeigen, konnte sie keine wesentliche Erkenntnisse über die Funktionalität von Stammzellen. Eine optimale Linie Tracing methdik sollte die Wirkung der Markierung auf die Eigenschaften der markierten Zelle seinen Nachkommen oder seinen Nachbarn zu minimieren. Zusätzlich wäre es vorteilhaft, um die Kontrolle über die Kennzeichnung Induktion haben, nämlich die Fähigkeit, die Zellpopulation in einem Stadium, und zeitabhängigen Art und Weise sowie in einer einzelnen Zelle (klonale) Weise zu markieren, zu haben. Eine stabile, irreversible Markierungsverfahren, die auf an alle Nachkommen des Gründerzelle übergeben wird, wichtig, so daß das Etikett im Lauf der Zeit zurückgehalten werden, und nicht auf Nachbarzellen übertragen.

In jüngerer Zeit genetische Ansätze der Markierung von Zellen entwickelt. In diesen Systemen können die zellspezifische Promotoren verwendet werden, wie beispielsweise grün fluoreszierendes Protein oder Β-Galactosidase Reportergene ^9-13 zur Cre-Rekombinase-Expression um einen loxP-flankierten Hindernis beseitigt wird, sodass die Expression von Reportergenen auszulösen. Dieser Ansatz ermöglicht nicht nur die Verfolgung von Zellen und deren Nachkommen, sondern erlaubt auch ZelleBildung von Ol und molekulare Charakterisierung. Zellverfolgung in der Einzelzellebene wurde durch Induktion der Expression eines einzelnen fluoreszierenden Reportergens möglich ist. Eine wichtige Beschränkung dieses Systems ist die Tatsache, dass nur bei sehr geringen Prozentsatz an Zellen, markiert es möglich ist, zu trennen und Spuren individuelle Klone. Um diese Einschränkung zu multicolor Reporter verwendet werden überwunden. Bei Verwendung von Mehrfarben-Markierung kann das Tracking von Differential Schicksal von benachbarten Zellen in der gleichen Nische effizient ^14-17 erreicht werden. In jüngster Zeit wurden eine Vielzahl von Brainbow (Br) Allele für Linienverfolgung Experimente entwickelt, so dass eine stochastische Expression multipler Fluoreszenzreportergene unter Verwendung des Cre / lox-System. Das Cre / lox-System besteht aus dem Enzym Cre-Rekombinase, erkennt und bindet an spezifische DNA-Sequenzen, wie loxP Sites. Im Anschluss an die Bindung von Cre-Rekombinase, ortsspezifische Rekombination stattfindet, die die Entfernung der loxP-Sequenzen flankiert resulting in zufälliger Ausdruck unterschiedlicher Fluoreszenzproteine ​​(der Mechanismus wird unten beschrieben). Eine Vielzahl von Br Linien stehen zur Verfügung (siehe Bewertungen ^16,18,19). Die Hauptunterschiede zwischen den Br Stämme umfassen (i) Unterschiede in der Anzahl der fluoreszierenden Gene in der Kassette enthalten ist, im Bereich von 2 (Br 2,0), 3 (Br1.0) bis 4 (Br1.1, Br2.1) Fluoreszenzgene , (ii) die Anwesenheit von wechselseitig orientiert lox-Stellen, um Gen-Inversion (Br2.0-2.1) zu ermöglichen, (iii) die Art der lox-Stellen verwendet wird, und (iv) der Ausdruck oder die Stille des fluoreszierenden Genexpression vor Cre-Aktivierung. Die kürzlich gegründete Br3 bietet ein verbessertes Verfahren zur Mehrfarben-Darstellung von Neuronen. Eines der wichtigsten Merkmale dieser Niederschrift ist, dass es einen neuen Satz von photo farnesyliert fluoreszierende Proteine, die eine gleichmäßige Färbung der schönsten neuronale Prozesse ²⁰ ermöglichen, enthält.

Wichtig ist, kann verschiedene Versionen von Br Kassetten die neuronale spezifische enthalten Thy1 promoter oder ubiquitär exprimiert CAG (CMV) -Promotors. Schließlich, während einige der Br transgenen Mäusen kann eine einzige Br Transgen enthalten, andere können von mehreren Transgenkopien bestehen, wodurch die Produktion einer Unzahl von Möglichkeiten für die Farbkombinationen, die in jeder Zelle exprimiert werden (siehe zum Beispiel ^16).

In unserer Studie haben wir die R26R-Confetti-Maus, die die Br 2,1 ^Kassette 21 enthält. Br2.1 ist einzigartig entworfen, um eine Cre-vermittelte DNA Inversionen und nicht nur Exzisionen wegen der gegenseitigen Orientierung der loxP-Stellen (Figur 1) zu ermöglichen. Somit können diese Inversion / Exzision Ereignisse, die Farbänderung führen, solange Cre vorliegenden ¹⁶ fortzusetzen. Aus diesem Grund ist ein zeitlicher induzierbaren Cre Expressionssystem Voraussetzungen für den sicheren Zellverfolgung mit Br2.1. Wie in Abbildung gezeigt. 1, die Br2.1 enthält eine allgegenwärtige CAG-Promotor, gefolgt von loxP-flankierten Neo ^R -cassette, das als Transkriptionsstraßensperre wirkt, wird dieser um 4 fluoreszierenden Reporter-Gene-Codierung für grün (GFP), Gelb (YFP), rot (RFP) und Cyan (GFP) fluoreszierende Proteine, in zwei Tandems positioniert gefolgt. Keine Fluoreszenz vor der Cre Aktivierung exprimiert. Induktion der Cre-Rekombinase bewirkt, dass die Entfernung des Neo-R-Kassetten ermöglicht die zufällige Expression von einem der 4 fluoreszierenden Proteinen in einer gegebenen Zelle. Das erste Segment enthält loxP-flankierten GFP und YFP umgekehrt, während das zweite Segment enthält loxP-flankierten RFP und GFP umgekehrt. Diese DNA-Segmente können kontinuierlich invertiert werden (unter Verwendung von loxP, die in umgekehrter Orientierung ist) oder herausgeschnitten, so lange wie Cre-Rekombinase anwesend ist. Daher sollte eine vorübergehende und kontrollierte Cre-Transgen verwendet werden. Die Br2.1 Kassette bietet ein ausgezeichnetes System für die Unterscheidung zwischen überlappenden Emissionssignal auf Standort: die Expression von YFP und RFP ist zytoplasmatisch, das GFP ist Kern- und die GFP an die Zellmembran gebunden. GFPund RFP Emissionen lassen sich leicht nach herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopie getrennt. Um YFP / GFP / CFP Emissionen zu trennen, wird eine spektrale konfokale Abbildungssystem erforderlich. Insgesamt ermöglicht die Br2.1 Kassette die zufällige, induzierbare und Gewebe-spezifische Expression einer von vier unterschiedlichen fluoreszierenden Gene in der Zielzelle. In der Tat, wenn eine größere Anzahl von Farbkombinationen erforderlich ist, kann man homozygote Mäuse, die 2 Allele Br2.1 enthalten erzeugen, wodurch die Expression von 2 Farbmarkierungen für jede Zelle und bei der Erhöhung der Anzahl der möglichen Farbkombinationen zu 10 ^22. Einige der Br Mausstämmen zu ermöglichen, die Expression eines viel größeren Anzahl von Farbkombinationen möglich, da mehrere Kopien der Kassette wurden in ihr Genom ^{16 integriert.} Doch in den meisten Fällen sind die vier Farbkombinationen durch eine einzige Br2.1 Allel bereitgestellt ausreichend. Nach dem Protokoll hier vorgesehen ist, kann man diese Methode mit einem relativ einfachen Aufbau spectr etablierenal Mikroskopie mit wenig oder gar keine Notwendigkeit für die Kalibrierung.

Hier stellen wir eine anpassbare Protokoll für die Verwendung der R26R-Konfetti-Mäusen, die eine einzelne Br2.1 Allel enthalten, Lineage Verfolgungsexperimente des Hornhautepithels. Diese transgenen Mausstamm wurde für die Untersuchung der Entstehung und das Schicksal von Dick ^21,23 und Hornhautepithelzellen Stammzellen ^22,24 verwendet wurde, die Gegenwart von Stammzellaktivität in Darmkrebs ^{25 und} zur Charakterisierung von Nieren podocyte in Fokal segmentale Glomerulosklerose (FSGS) ^17.

Protokoll

Ethics Statement: In dieser Studie Tierpflege und Verwendung wurden der ARVO Erklärung für die Nutzung von Tieren in der Ophthalmologie und Vision Research entsprach. Alle Experimente wurden von der lokalen Ethikkommission genehmigt.

1. Wählen Sie einen geeigneten Cre-Rekombinase exprimierenden Mausstamm wählen

1. Aus der großen Vielzahl von Cre transgene Linien für den Kauf ^{26 und} in Abhängigkeit von der Zielgewebe zur Verfügung, um untersucht werden, wählen Sie eine Cre-transgenen Mausstamm, in der die Cre-Rekombinase-Gen wird durch einen Promotor, der spezifisch für das Gewebe von Interesse ist, gesteuert. Bei zeitliche Steuerung benötigt wird, wählen Sie einen induzierbaren Cre Linie.
   Anmerkung: Wir wählten das Tamoxifen induzierbaren K14-Cre-Transgen ^ERT spezifisch zu markieren limbalen und Hornhautepithelzellen Stammzellen / ^{Vorläuferzellen} 24. Beachten Sie, dass es Unterschiede zwischen den Stämmen, wie Di Girolamo und Mitarbeiter berichteten Limbus Spezifität ohne Hornhaut Ausdruck für ihre K14-Cre ^{ERT 22.} Ein Vorteil der Verwendung von induzierbaren transgenen Mäusen Cre ist, dass es die Induktion der Linie Tracing in vielseitiger Zeitrahmen.

2. Wählen Sie einen geeigneten Br Mausstamm

1. Wählen Sie die entsprechende Br Kassette nach dem Forschungsfrage und zur Verfügung Cre Linie ^16,18,20.
   1. Wenn ein nicht-induzierbaren Cre Mausstamm verwendet wird, wählen Sie eine Br Kassette, die nicht zulässt, dass kontinuierliche DNA-Inversionen / Exzisionen und damit Anlass zu Dead-End-Produkte (zB Br1.0 oder Br1.1) ^16.

3. Überqueren Sie den transgenen Linien Sehenswürdigkeit

1. Für die hier gezeigten Protokoll, über die homozygot R26R-Confetti-Stamm (Br2.1 / Br2.1) mit der homozygot Cre ^ERT Stamm (Cre ^ERT / Cre ^ERT) zu hemizygot Nachkommen zu erhalten (Br2.1 / +; Cre / +) die bereit sind für Mono-Allel-Linie verfolgen, da sie alle eine einzige Br2.1 Allel enthalten und aEinzel Cre-Allel.
   Hinweis: Um die Effizienz der Kennzeichnung zu steigern, könnte man Mäuse, die zwei Cre-Allele (Br2.1 / +; Cre / Cre) enthalten, zu erzeugen, während zwei Br2.1 Allele (Br2.1 / Br2.1; Cre / +) würde erhöhen Farbkombinationen (wie in ²² beschrieben).

4. Cre-Rekombinase Induction

Anmerkung: Die Verabreichung von Tamoxifen in diesen Experimenten wurde durch tägliche intraperitoneale Injektion durchgeführt wird, für die Dauer von 3-4 Tagen, um die Translokation des Cre ^ERT Rekombinase in den Zellkern und kornealen Limbus basalen K14-positive Stammzellen / Vorläufer induzieren Epithelzellen. Das folgende Protokoll kann für die Injektion von vier Mäusen verwendet werden. Alternativ topische Anwendung von Tamoxifen auf die Augenoberfläche ergibt einen höheren Wirkungsgrad. Das Tamoxifen-Lösung kann in der Dunkelheit bei 4 ° C für bis zu eine Woche aufbewahrt werden. Wärmen Sie die Lösung vor dem Gebrauch.

1. Wiegen 100 mg Tamoxifen und löst ihn in 5 ml Maisöl zubilden eine 20-mg / ml-Lösung Tamoxifen.
2. Injizieren 200 ul Tamoxifen (4 mg) Lösung intraperitoneal 8 Wochen alten Mäusen für 3-4 aufeinander folgende Tage.
   Hinweis: Das Tamoxifen-Lösung kann in der Dunkelheit bei 4 ° C für bis zu eine Woche aufbewahrt werden. Wärmen Sie die Lösung vor dem Gebrauch.
3. Für die topische Anwendung: wiegen 60 mg Tamoxifen und löst ihn in 1 ml Maisöl, eine 60 mg / ml Tamoxifen Lösung zu bilden. Vortex und stellen Sie die Lösung in einem Schüttelwasserbad bei 65 gehalten ° C, bis klar wird, lassen Sie es in das Bad bis zum Gebrauch.
   1. 100 ul des Tamoxifen-Lösung vorsichtig auf der Augenoberfläche jedes der Maus.

5. Gewebepräparation für Imaging

1. Sacrifice Tiere mit Isofluran-Narkose (überprüfen Sie die ordnungsgemäße Betäubung durch das Fehlen von Reflexen), gefolgt von _CO 2 Inhalation zu geeigneten Zeitpunkten nach Tamoxifen Einspritzung und col (2% in Sauerstoff verdampft)Lect das entsprechende Gewebe.
   1. Für diese Experimente entkernen Augen an folgenden Zeitpunkten: 1, 4, 8, 12 und 16 Wochen nach Tamoxifen Injektion. Erreichen Enukleation unter Verwendung einer gebogenen Pinzette. Drücken Sie die Augenlider verursacht der Augapfel aus der Augenhöhle Pop. Legen Sie die Pinzette hinter dem Augapfel halten den Sehnerv. Ziehen Sie den Augapfel und abnehmen.
      Anmerkung: In diesem Stadium, wie unten beschrieben, Gewebe für Wholemount Analyse der markierten Zellen hergestellt werden. Regelmäßige Gefrierschnitte können ebenfalls hergestellt werden, in PFA fixiert und abgebildet wird, wie unten beschrieben (siehe Abschnitt 6 ^und 22).
2. Legen Sie jedes Auge in einem 60 mm-Schale mit PBS gefüllt.
3. Unter einem Stereomikroskop mit einer Pinzette halten Sie die Augen in der Nähe des Sehnervs mit der Hornhaut nach unten und mit einem Skalpell, um den Sehnerv, Muskeln und Bindegewebe zu entfernen und einen kleinen Schnitt im hinteren Teil des Auges.
4. Verwendung von Feder Schere sorgfältig zu vergrößern dieschneiden lassen die Linse springt heraus und entfernen Sie die Blende mit einer Pinzette.
5. Abflachen der Kornea, indem 4-5 Radialschnitte ausgehend von der Mitte in Richtung der Peripherie mit einem Skalpell.
6. Verwenden Sie ein Skalpell, um überschüssige peripheren Gewebe außerhalb des Limbus geschnitten.
7. Fix Hornhäute in 4% PFA für 10 Minuten, dann kurz waschen Sie sie mit PBS.
8. Proben inkubieren mit DAPI für 10 Minuten und kurz mit PBS waschen.
9. Berg Hornhäute auf Glasobjektträger mit der epithelialen Seite nach oben. Geben Sie einen Tropfen Eindeckmittel oben auf der Hornhaut und der Deckel mit einem Deckglas. Lassen Sie Folien trocknen O / N in RT. Folien bleiben bei 4 ° C.

6. Die konfokale Mikroskopie und Imaging-Analyse

1. Verwenden Sie einen spektralen konfokalen System, das die Trennung von YFP / GFP / CFP-Emissionen ermöglicht. Set Fluoreszenzanregung und Emissionswellenlängen in Abhängigkeit der fluoreszierenden Proteine ​​der Br Kassette. Wählen, die am besten geeignete Anregungswellenlänge für jedes Protein mit dem Ziel zu minimieren QuerErregung. Wählen schmale Emissionsbereiche aus, um das Leck von Signalen von den verschiedenen Proteinen minimieren.
   1. Für die Br2.1 Kassette, verwenden Sie aus Fluoreszenzanregung (ex) und Emission (em) als Ausgangspunkt, den folgenden Satz: DAPI - ex 405 nm / em 420-480 nm, CFP - ex 458 nm / em 470-500 nm, GFP - ex 488 nm / em 497-508 nm, YFP - ex 514 nm / em 529-540 nm und RFP - ex 561 nm / em 575-615 nm.
2. Um große Gewebebereiche mit hoher Auflösung zu visualisieren, zu erwerben Fliesen Bildgebung. Für die in 2A & ndash; B, Bild die gesamte Hornhaut durch Erhalten einer Anordnung von 12 x 12 Bilder, dh gezeigten Ergebnisse erhalten 144 Felder (512 x 512) unter Verwendung von 4 Fluoreszenzkanälen in jedem Feld. Insgesamt sammeln 576 Bildern und dann verschmelzen.
3. Um die Lokalisierung der markierten Zellen in verschiedenen Tiefen und Strukturen des Gewebes zu erforschen, zu erwerben Z-Stapel-Aufnahmen der verschiedenen Regionen von Interesse. Um to Bild die volle Tiefe der Hornhaut, zu erwerben 8 optische Schnitte bei 3 & mgr; m Abständen. Orthogonalen Ansichten der ebenso gesammelt wie Bildprojektionen der Grundlage der Höchstintensitäten Abschnitte können mit konventionellen bildgebenden Software ²⁴ aufgebaut werden.

7. Verletzung der Hornhaut in Kombination mit Tamoxifen Induction

1. Betäuben Mäuse mit Isofluran (2% in Sauerstoff verdampft) und verwalten Analgetika (10 mg / kg Carpofen, subkutan). Überprüfen Sie die ordnungsgemäße Betäubung durch Teilnahmslosigkeit bis zu den Zehen Prise.
2. Wiegt 1 g Tamoxifen Pulver und löst ihn in 5 ml sterilem DMSO zu 200 mg / ml Konzentration Lösung herzustellen.
3. Erwärmen Sie die Tamoxifen-Lösung auf 65 ° C in einem Wasserbad, bis die Lösung klar wird. Halten Lösung in das Bad bis zum Gebrauch.
4. Bewerben Augensalbe zur unbehandelten kontralateralen Auge zu Austrocknung während der Narkose zu verhindern. Haben ein Tier nicht unbeaufsichtigt lassen, bis es ausreichend con wiederBewusstsein um Brustlage zu halten. Mäuse, die Augen zu verletzen, um der Gesellschaft von anderen Mäusen unterzogen hatten, bis vollständig erholt zurückkehren Sie nicht. Mäuse sollten genau nach der Verletzung beobachtet werden. Im Fall verlieren sie mehr als 10% ihres Körpergewichts, leiden an Hornhauterosion oder Beschwerden, sollte der Versuch abgebrochen werden. Analgetika Verwaltung Wiederholung alle 24 Stunden während des ganzen Experiments.
5. Verwendung einer sterilen Spritze ohne Nadel, um sie gebunden sind; gelten 200 ul Tamoxifen Lösung topisch über die ganze Hornhautoberfläche eines Auges jeder Maus.
   Anmerkung: Die flüssige Lösung erstarrt schnell auf der Augenoberfläche bei RT. Die Wirkung von Verletzungen der Hornhaut abhängig von der Schwere der Wunde. Im Anschluss an eine Anwendung von Tamoxifen / DMSO-Lösung keine unerwünschten Wirkungen sind in den Mäusen beobachtet. Im Falle von wiederholten Anwendungen können Hornhauttrübung beobachtet werden.
6. Fahren Sie mit Gewebepräparation und Imaging (siehe PositionIonen 5 und 6) zu relevanten Zeitpunkten. Für die hier gezeigten Ergebnisse, opfern die Mäuse eine Woche nach der Verwundung (Abbildung 2 ^und 24) (wie in Stufe 5.1 beschrieben).

Ergebnisse

In jüngster Zeit richtet man die Ermittlung der Herkunft, das Überleben und die Migration von Stammzellen und Vorläuferzellen des Hornhautepithels ^24. Vermehrt Hinweise unterstützt das Dogma, dass das Hornhautepithel von Stammzellen ausschließlich im Limbus Nische einer ringförmigen Zone an der Hornhautperipherie befindet regeneriert. Diese Theorie wird durch in vitro- und in vivo-Daten, und durch klinische Beweise, die die Basis für eine erfolgreiche Pionier Limbus-Stammzellen-Therapie bereitgestellt ^27-29 unterstützt. Doch dieses Thema blieb in hohem Grade in den letzten Jahren aufgrund einer Studie basierend auf Limbus Pfropfen Experimente, die vorgeschlagen, dass die Maus Limbus nicht in Hornhauterneuerung ³⁰ teilnehmen diskutiert. Um dieses interessante Hypothese zu testen, um die Abstammung Tracing Experimente mit R26R-Confetti Mäusen durchgeführt wurden, das Schicksal des Limbus und Hornhautepithels Stamm- / Vorläuferzellen unter stationären Bedingungen für bis zu 120 Tage ²⁴ zu folgen.Die Augen wurden enukleiert und Flachhalterung Hornhäute wurden von spektralen konfokalen Laser-Scanning-Fluoreszenzmikroskopie analysiert 10 und 120 Tage nach der Tamoxifen-Injektion. Wie erwartet, wurden kleine sporadische Cluster von fluoreszierenden Zellen in der gesamten Augenoberfläche 10 Tage nach der Injektion beobachtet, während die 1-4 Monate später (2B ^und 24), langgestreckten Streifen, die vom Limbus in Richtung des Hornhautmitte erstrecken langsam entwickelt. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Hornhaut wird von Zellen, die von dem Limbus in Richtung der Mitte der Cornea wandern regeneriert. Weiter, Hornhautregeneration unter Verwundung Bedingungen untersucht. Um das Schicksal der K14-positive Limbus / Hornhautzellen unter Bedingungen, Verwundung, während Induktion effiziente Zellverfolgung zu testen, gelöst wir die Tamoxifen in Dimethylsulfoxid (DMSO), die Hornhautverletzung bei topischer Anwendung verursacht. Auf diese Weise gelang es uns, milde Verwundung zu induzieren, wenn eine einzige topische Anwendung angewendet wurde (2C), mo Leistungsminderung zu verwunden, wenn zusätzliche DMSO Behandlung wurde am Tag vor der Tamoxifen Induktion oder schwere Wunde, wenn DMSO wurde topisch in 2 aufeinanderfolgenden Tagen vor der Tamoxifen Induktion angelegt.

Im Gegensatz zu den dünnen Limbus Streifen, die sich langsam entwickelt und erreichte die Hornhautmitte innerhalb von 4 Monaten unter stationären Bedingungen, Zellmigration nach der Verletzung war schnell. Bemerkenswert ist, lang und dick Limbus-Streifen wurden bereits unter diesen Bedingungen innerhalb von 7 Tagen entwickelt. Interessanterweise war Farbenvielfalt manchmal minimal (2D). In unseren Händen, gelegentlich, vor allem roten Zellen wurden in der gesamten Hornhaut identifiziert, was darauf hinweist, dass die Farbvielfalt kann auf bestimmte Fluorophore vorgespannt werden. Diese unerwünschte Vorspannung kann durch Dosis-Antwort-Tests kalibriert werden, wie zuvor in Br1.0L ^{31 und} in Br2.1 ²¹ gemeldet.

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Abbildung 1. Schematische Darstellung der R26R-Confetti Konstrukt. (A) Die R26R-Konfetti Konstrukt einen CAG-Promotor für hohe Expressionsniveaus enthält, ein loxP (schwarzes Dreieck) -flanked Neo ^R -roadblock und Brainbow2.1 Kassette am Rosa26 Locus ^16,21. Die Brainbow2.1 Kassette enthält zwei Kopf-Schwanz-loxP-flankierten Dimere. Ein Dimer besteht aus atomar lokalisierten grün fluoreszierende Protein (GFP) und einer Rückwärtsorientierten zytoplasmatischen gelb fluoreszierendes Protein (YFP, die umgekehrte Orientierung bezeichnet - PJ). Die zweite Dimer enthält zytoplasmatische RFP und einen Rückwärtsorientierte Membran-gebundenen cyan fluoreszierende Protein (GFP, die umgekehrte Orientierung bezeichnet wird - PFC) ^16. (B - E) Nach Cre-Rekombinase-Aktivierung können verschiedene Exzision und Inversion Ereignisse auftreten; mögliche Ergebnisse sind exemplified in B - E. Die Cre-Aktivität induziert stochastischen Umlagerung der Kassette, die zu Gen Umzüge und / oder Inversionen und führt somit zu der zufälligen Expression von einem der vier Fluoreszenzproteine. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2. Corneal Linienverfolgung unter Homöostase und Verletzungen. R26R-Konfetti / K14-Cre-Mäusen wurden mit 4 mg Tamoxifen injiziert wie in dem Protokoll beschrieben. In den angegebenen Zeitpunkten nach der Induktion abgeflachten Hornhäute wurden bebildert (A - B). Hornhaut Verwundung in Verbindung mit Cre Induktion wurde durch topische Anwendung von Tamoxifen in DMSO gelöst (C - D). Mosaikbilder erhaltendurch Mehrkanalkacheln spektraler Konfokalmikroskopie gezeigt (A - D). In Homöostase, radial Limbus Streifen langsam wandernden Zellen verlängert zwischen Limbus und der Hornhautmitte. Diese Streifen langsam entwickelt, das Erreichen der Hornhautmitte innerhalb von 4-5 Monaten (B). Cluster von Hornhautzellen erkennbar waren sowie (weiße Pfeile, B). Im Gegensatz dazu erschienen große limbal Streifen innerhalb einer Woche nach der Verwundung Bedingungen (C). Ein Beispiel für die Vorspannung der Farbenvielfalt in Richtung roten Zellen (D). Der Limbus-Hornhaut Grenze durch eine gestrichelte Linie gekennzeichnet. Maßstabsleiste ist 500 um. Abkürzungen: CFP, cyan fluoreszierendes Protein; GFP, green fluorescent protein; RFP, rot fluoreszierendes Protein; YFP, gelb fluoreszierendes Protein. Diese Zahl hat sich von ²⁴ modifiziert worden ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version zu sehendiese Figur.

Diskussion

Linienverfolgungsexperimente sind seit vielen Jahren durchgeführt worden. Die jüngsten technologischen Verbesserungen und die Entstehung der Confetti Mausstämme eröffnet neue Wege für die Forschung. Heute können Forscher aus einer großen Anzahl von kommerziell verfügbaren gewebespezifische Cre Linien-Knockout-Mäusen und transgenen Mäusen profitieren. Dies bietet die Möglichkeit für die Gestaltung vielseitige experimentelle Systeme für die Bewältigung wissenschaftlicher Fragestellungen mit grundlegenden Know-how, die Vermeidung mühsamen Praxis und bietet robuste und zuverlässige Daten.

R26R-Confetti-Mäuse sind ein elegantes Werkzeug für die effiziente Verfolgung und das Studium der Natur und das Verhalten von Zellen in einem lebenden Organismus. Das System ist leicht festzustellen und erlaubt es nicht invasive Linienverfolgung einzelner Zellen während der Embryogenese, der Stammzellregeneration unter Homöostase oder unter anderen Umständen, wie beispielsweise Verletzungen, Entzündungen und Krebs. Die erzielbare Daten bietet eine robuste descriptIonen des Überlebens der angezielten Zellen, klonale Zellausdehnung und Zellmigration in einer quantifizierbaren Weise. Ein entscheidender Schritt wäre, um die entsprechende genetische Mausstamm, der zuverlässig erlauben können effiziente Gewebe spezifische Markierung an einer präzisen Entwicklungsstufe zu wählen. Eine Einschränkung bei diesem System ist, dass zur Überwachung eines lebenden Organismus, das Gewebe zugänglich und transparent sein. Ebenso Tracking ein dickes Gewebe in einem lebenden Tier nur durch Zwei-Photonen-oder Multi-Photonen-Mikroskopie ermöglicht werden. Jedoch Zellverfolgung möglich Obduktion Gewebeschnitten und vielleicht das intakte Gewebe untersucht, nachdem sie umgewandelt worden transparent durch die Klarheit Methode ^32,33 zu werden werden. Eine weitere Einschränkung ist zu berücksichtigen, dass, obwohl benachbarten Zellen, die dieselbe Fluorophor Eil gehören wahrscheinlich zu demselben klonalen Linie, ist es auch möglich, dass sie von unabhängigen Zellen zurückzuführen, die zufällig dasselbe fluoreszierende Gen exprimiert ableiten. Diese Mögty wird sehr unwahrscheinlich, wenn mehrere Br Allele zu zahlreichen Farbkombinationen ermöglichen.

In der Zukunft, die Kombination der Confetti-System mit verfügbaren genetischen Werkzeugen (dh Knockout, Knockin und transgenen Mausmodellen) wird die Untersuchung von Genen und deren Mutationen in Gesundheit und Pathologie zu ermöglichen. Ebenso Lineage Tracing unter verschiedenen Netzrückwirkungen (dh Stammzellnische Zerstörung, Laser-vermittelte Zell-Ablation, medikamentöse Behandlung) wird neue Erkenntnisse auf die Beteiligung der Signalwege in Zellschicksal Entscheidungen zu bringen. Letztlich ist die kombinatorische Verwendung von fluoreszierenden und Biolumineszenz-Kennzeichnung, genetische Reporter von Signalwegen und Schneide-Mikroskopie werden die Forscher bieten ein robustes System zu lernen, wie einzelne Zellen auf ihre Umgebung in ihrer natürlichen Umgebung zu reagieren.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
R26R-Confetti transgene Mäuse homozygot für die Brainbow 2.1 Kassette	Jackson	Stamm #013731
K14-CreERT Mäuse	Jackson	Stamm #005107
Tamoxifen	Sigma	T5648
Isofluran USP Terrell	Piramal Intensivpflege
Carprieve 30	b.wt
DMSO	Sigma	D2650
DAPI	Sigma	D9542	bei einer Konzentration von 4  &Mikro; g/ml
Immu Montierung	Thermo Scientific	9990402
LSM 510 Meta konfokales Laserscanning-System, das an ein inverses motorisiertes Mikroskop (Axiovert 200M) angeschlossen ist, das mit einem motorisierten Tisch ausgestattet	Zeiss		Die spektrale Überlappung zwischen GFP, YFP und CFG erfordert die Verwendung von spektraler Bildgebung, die die Trennung der Emissionsspektren der fluoreszierenden Proteine ermöglicht. Hier verwenden wir das Zeiss LSM 510 Meta spektralkonfokale Mikroskop. Der Meta-Detektor, der in diesem System enthalten ist, besteht aus 32 Detektorelementen, die jeweils Strahlung aus einem 10-Nanometer-Wellenbereich sammeln. Diese Technik, die als "spektraler Fingerabdruck" bezeichnet wird, ermöglicht es dem Benutzer, die am besten geeigneten Grenzwerte für die Wellenbandfilterung festzulegen. Es gibt eine Vielzahl von spektralen konfokalen Systemen, die verwendet werden können, darunter Leica SP5 (Ref #21), SP8, Zeiss LSM 780 (Ref #22).
Zen 2009 Imaging Software	Zeiss
Duratears-Augensalbe	Alcon