Methodenartikel

Physische Isolierung von Endospores aus Umweltproben durch gezielte Lyse von vegetativen Zellen

DOI:

10.3791/53411

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21. Januar 2016

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1Department of Biological Sciences, Macquarie University, 2Vital-IT group, Swiss Institute of Bioinformatics, 3Laboratory of Microbiology, University of Neuchatel

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Es wurde eine Methode entwickelt, um bakterielle Endosporen aus komplexen mikrobiellen Gemeinschaften herauszufiltern, um maßgeschneiderte Kultur- oder molekulare Studien dieser Bakteriengruppe durchzuführen.

Zusammenfassung

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Die Endosporenbildung ist eine Überlebensstrategie, die bei einigen Bakterien aus dem Stamm der Firmicutes zu finden ist. Während der Endosporenbildung gehen diese Bakterien in einen morphophysiologischen Ruhezustand über, der das Überleben unter widrigen Umweltbedingungen verbessert. Obwohl endosporbildende Firmicutes in Kultivierungsstudien zu den am häufigsten angereicherten und isolierten Bakteriengruppen gehören, fehlen sie in Diversitätsstudien, die auf molekularen Methoden basieren. Die Resistenz des Sporenkerns gilt als einer der Faktoren, die die Rückgewinnung von DNA aus Endosporen einschränken. Wir haben eine Methode entwickelt, die sich die höhere Resistenz von Endosporen zunutze macht, um sie mit physikalischen, enzymatischen und chemischen Lysemethoden von anderen Zellen in einer komplexen mikrobiellen Gemeinschaft zu trennen. Das so gewonnene reine Endosporenpräparat kann für die Rekultivierung oder zur Durchführung von Downstream-Analysen verwendet werden, wie z. B. maßgeschneiderte DNA-Extraktion, die für Endosporen optimiert ist, und anschließende DNA-Sequenzierung. Diese Methode, die auf Sedimentproben angewendet wird, hat die Anreicherung von Endosporen ermöglicht und nach der Sequenzierung eine große Vielfalt an Endosporenbildnern in Süßwasserseesedimenten aufgedeckt. Wir gehen davon aus, dass die Anwendung dieser Methode auf andere Proben zu einem ähnlichen Ergebnis führen wird.

Einleitung

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Das Ziel dieser Arbeit besteht darin, ein Protokoll für die Abtrennung von bakteriellen Endosporen aus vegetativen Bakterienzellen in Umweltproben bereitzustellen. Die Bildung von bakteriellen Endosporen ist eine Überlebensstrategie, in der Regel durch Verhungern ausgelöst, in einer Anzahl von Bakteriengruppen zum Stamm Firmicutes 1 gehör gefunden. Endosporen-bildende Bakterien sind gut untersucht, vor allem, da eine Reihe von Stämmen sind Krankheitserreger und folglich der medizinischen Bedeutung (zB Bacillus anthracis oder Clostridium difficile). Umwelt Stämme von Endosporen-bildenden Bakterien wurden aus nahezu jedem Umfeld (Boden, Wasser, Sediment, Luft, Eis, menschlichen Darm, Tiere gut, und mehr) 1-3 isoliert. Daher sind Firmicutes das zweithäufigste Stamm in Stammsammlungen 4.

Wegen ihrer hardy äußeren Rinde und Schutzkernproteine ​​können Endosporen extremen Umweltbedingungen im Bereich fr überlebenom Austrocknung zu hohe Strahlungs, extreme Temperaturen und schädliche Chemikalien 5. Diese bemerkenswerte Widerstandsfähigkeit macht es eine Herausforderung, DNA von Endosporen 6-8 extrahieren. Dies erklärt wahrscheinlich, warum sie in der Umweltsequenzierungsstudien 9,10 sehen worden. Andere Verfahren, wie die Zielrichtung Endosporen in Umweltproben durch fluoreszierende Antikörper 11, Quantifizierung von Dipicolinsäure (DPA) im Boden 12 und Sediment 13, Durchflusszytometrie 14 oder Pasteurisierung und anschließende Kultivierung 15,16 verwendet worden, um in abzurufen oder zu quantifizieren Endosporen Umweltproben. In den letzten Jahren optimierten DNA-Extraktionsverfahren als auch spezifische molekulare Primer zielen Endosporen spezifischer Gensequenzen wurden entwickelt 10,17-20. Dies hat dazu beigetragen, mehr Biodiversität in dieser Gruppe von Bakterien 21 offenbaren und hat sich auch auf Anwendungen in Industrie und Medizin zum Nachweis von Endosporen geführtZum Beispiel in Milchpulver 19.

Das hier vorgestellte Protokoll basiert auf dem Unterschied in der Beständigkeit gegenüber Schad physikochemischen Bedingungen (wie Wärme und Reinigungsmittel) von bakteriellen Endosporen verglichen mit Zellen, vegetativen basiert. Vegetativen Zellen in einer Probe zu zerstören wir nacheinander erhitzen, Lysozym und niedrigen Konzentrationen von Detergentien. Die Zeit und die Kraft dieser Behandlungen sind optimiert worden, um nicht-Sporen zu zerstören, sondern um alle vegetativen Zellen lysieren. Einige Zellen in einer Umweltzellpool sind widerstandsfähiger als andere, so, um die Wahrscheinlichkeit der Zerstörung aller vegetativen Zellen zu erhöhen, verwenden wir drei verschiedene Behandlungen. Der Vorteil und die Neuheit dieses Verfahrens ist, dass die Endosporen nach der Behandlung noch intakt und kann für weitere Downstream-Analysen verwendet werden. Dazu gehören DNA-Extraktion, quantitative PCR (qPCR) und Amplikon oder Metagenom-Sequenzierung (Targeting gezielt die Gruppe der Endosporen und damit Reduzierung diversity, bei gleichzeitiger Erhöhung Deckung). Die Endosporen könnte auch für die nachgeschalteten Anbau oder die Quantifizierung durch Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden, Durchflusszytometrie oder Detektion von DPA. Ein wichtiges Merkmal dieses Verfahrens ist, dass durch Vergleichen eines unbehandelten Probe mit einer behandelten Probe, kann man die Menge und Vielfalt von Endosporen in einer Umweltprobe zusätzlich zu der Komponente, die Zellen vegetativen abzuleiten.

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Protokoll

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1. Herstellung von Chemikalien und Geräte

  1. Bilden 500 ml einer 1% Natriumhexametaphosphat (SHMP) (NaPO 3) n-Lösung und durch Autoklavieren sterilisieren.
  2. Sterilisieren Nitrocellulose (NC) Filter (Porengröße 0,22 um, Durchmesser 47 mm) durch Autoklavieren in geschlossenen Glaspetrischalen.
  3. Sterilisieren NC-Filter (Porengröße 0,22 um, Durchmesser 25 mm) durch Autoklavieren in geschlossenen Glaspetrischalen.
  4. Wiegen und beachten Sie das Leergewicht von sterilen 50-ml-Röhrchen (mit Kappe auf) (ein Röhrchen je Probe).
  5. Vorbereitung Tris-EDTA-Puffer (TE-Puffer) 1x: make Lösung von 10 mM Tris (Tris (hydroxymethyl) aminomethan) und 1 mM EDTA Puffer. PH-Wert auf 8 und durch Autoklavieren sterilisieren.
  6. Vorbereitung Lysozymlösung (20 mg / ml) durch Auflösen von 0,02 g Lysozym in 1 ml TE-Puffer. Im Idealfall machen frische jeder Zeit. Lagerung bei 4 ° C für nicht mehr als 1 Woche.
  7. Vorbereitung physiologischen Lösung durch Lösen von 8 g / l Natriumchlorid(NaCl) in destilliertem Wasser. Durch Autoklavieren sterilisieren.

2. Trennung von Biomasse aus Sediment

  1. In 3 g Sedimentprobe, um vorher gewogenes steriles 50-ml-Röhrchen unter Verwendung von Ethanol-geflammt Metall Messlöffel. Führen Sie dies in einer sauberen, UV sterilisiert Biosicherheitswerkbank, um Verunreinigungen zu vermeiden.
  2. 15 ml einer 1% igen sterilen (autoklaviert) SHMP Lösung zu der Probe unter Verwendung eines sterilen Bürette gefüllt. Die SHMP Lösung kann auch gefiltert, um Verunreinigungen zu vermeiden.
  3. Homogenisieren das Sediment und SHMP-Lösung mit einer Flüssigkeit Dispergierer / Homogenisator (zB Ultra-Turrax-Homogenisator). 70% Ethanol-sterilisiert oder autoklaviert Dispergierlaufrades vor der Verwendung. Führen Sie die Homogenisierung für 1 min bei 17.500 Umdrehungen pro Minute. Ließ die Probe für 2 Minuten ruhen und wiederholen die Homogenisierung für 1 min bei der gleichen Rotordrehzahl.
  4. Lassen Sie die Probe stehen für 10 min. Bei diesem Schritt werden die schwersten Teilchen (Mineralien) zu begleichen. Die Zellen und alle organischen Bestandteile der Probe jedoch wschlecht in Lösung bleiben. Danach den Überstand (enthaltend Zellbiomasse) in ein sauberes 50-ml-Tube, während kümmert sich nicht um das Sediment Pellet stören.
  5. Um das Sediment Pellet hinzuzufügen erneut 15 ml einer 1% igen sterilen (autoklaviert) SHMP-Lösung mit einem sterilen Bürette. Dann wiederholen Sie die Schritte 2.3 und 2.4. Diese Wiederholung sorgt für die Trennung von der maximalen Anzahl von Zellen und organische Teilchen aus der Mineralkomponente des Sediments. Der Überstand dieser zweiten Trennung kann mit dem Überstand aus der ersten Trennzusammengeführt werden.
    Hinweis: Die folgenden Schritte werden alle auf dem Überstand durchgeführt (die Zellbiomasse). Die mineralische Komponente (Sediment Pellet) kann verworfen werden.
  6. Zentrifugieren Sie die Probe bei 20 g für 1 min. Dieser Schritt erhöht die Beschleunigungskraft genug, um kleine Mineralpartikel absetzen, während die biologischen Zellmaterials noch in Lösung bleibt. Nach dem Zentrifugieren den Überstand (enthaltend Zellbiomasse) in einesauberes 50-ml-Tube. Entsorgen Sie die Mineral Pellet.
  7. Bestimmen das endgültige Volumen der Lösung, die Biomasse durch Wiegen der Probe. Die Gewichtsbestimmung wird vermieden, daß die Probe in einem Messzylinder übertragen und reduziert die Gefahr einer Kontamination.

3. Sammlung von Biomasse auf Filter Membrane

  1. Bereiten Filtrationseinheit (47 mm Durchmesser Membranen) und Vakuumpumpe. Sterilisieren Sie die Filtereinheit entweder durch Autoklavieren oder (wenn Pyrexglas) durch Besprühen mit 70% Ethanol und flamm es mit einem Bunsenbrenner. Abkühlen lassen, bevor Sie mit dem Protokoll.
  2. In sterilen NC-Membran in die Filtrationseinheit unter Verwendung von Ethanol-geflammt sterilisierten Pinzette.
  3. Die Hälfte des Überstandsprobe (aus Schritt 2.6) auf der Membranfiltrationseinheit und sammeln Zellen auf der Membran unter Verwendung der Vakuumpumpe.
  4. Wenn die Flüssigkeit vollständig durch den Filter geleitet, stoppen Sie die Vakuumpumpe und entfernen Sie vorsichtig die Membran unter Verwendung von Ethanol-Flamme sterilisierten Pinzette. Legen Sie die Membran in einer sterilen Petrischale.
    1. Schneiden Sie die Membran in die Hälfte unter Verwendung von Ethanol-geflammt sterilisierte Schere. Fügen Sie jede Hälfte der Membran in eine separate 2-ml-Tube. Eine Hälfte der Membran für die DNA-Extraktion und Analyse der gesamten Bakteriengesellschaft verwendet werden. Die andere Hälfte der Filter wird bei -80 ° C gelagert werden und dient als eine Sicherung.
  5. Zeigen neuen NC-Membran auf die Filtrationseinheit und sammeln Biomasse aus der zweiten Hälfte des Probenvolumens (aus Schritt 2.6) mit der Vakuumpumpe.
  6. Wenn die Flüssigkeit vollständig durch den Filter geleitet, stoppen Sie die Vakuumpumpe und entfernen Sie vorsichtig die Membran unter Verwendung von Ethanol-geflammt sterilisierten Pinzette. Legen Sie die gesamte Membran in eine separate 2-ml-Tube. Diese Probe wird für die Behandlung, um Endosporen von vegetativen Zellen getrennt verwendet werden. Die Probe kann bei -20ºC bis zur Verwendung gelagert werden.

4. Lyse von vegetativen Zellen

  1. Führen Sie dieBehandlung Endosporen aus vegetativen Zellen auf der zuvor auf einem NC-Membran (Schritt 3.6) gesammelt Biomasse abzutrennen.
    1. Wenn die Membran war gefroren, lassen Sie es bei Raumtemperatur für 10 Minuten auftauen. Dann legen Sie die Membran in einer sterilen Petrischale und schneiden Sie es (etwa 4 mal) in kleinere Stücke unter Verwendung von Ethanol-geflammt sterilisierte Schere. Dann legen Sie alle Membranfilterstücke in ein steriles 2 ml-Tube.
  2. Fügen Sie 900 ul 1x TE (Tris-EDTA) Puffer (siehe 1.5) auf das Rohr, das die Probenmembran und mischen durch Wirbel. Bei diesem Schritt wird die Biomasse von der Membran in der TE-Pufferlösung entfernt.
  3. Das Röhrchen wird in einen Inkubator bei 65 ° C für 10 min und 80 min. Danach entfernen Sie den Schlauch aus dem Inkubator und abkühlen lassen für 15 Minuten.
  4. 100 ul frisch hergestelltes Lysozym (siehe 1.5), um eine Endkonzentration von 2 mg / ml zu erreichen. Nicht das Lysozym nicht hinzufügen, bevor die Probe auf 37 ° C abgekühlt, da dies könnte degrade des Enzyms.
  5. Inkubieren der Probe bei 37 ° C für 60 min und 80 min werden die optimalen Bedingungen für die Lysozym vegetative Zellen zu lysieren.
  6. Nach kompletter Lyse, fügen 250 ul 3 N Natriumhydroxid (NaOH) und 250 & mgr; l 6% Natriumdodecylsulfat (SDS) Lösung zu der Probe. Durch das Hinzufügen dieses, das Probevolumen 1,5 ml erreicht und es besteht eine Endkonzentration von 0,5 N NaOH und einer Endkonzentration von 1% SDS.
  7. Inkubieren dieser Mischung bei RT für 60 min und 80 min. Zugabe der Base und Reinigungsmittel werden in endgültige Zell-Lyse zu helfen. Die Konzentration dieser Reinigungsmittel hat, um nicht die Endosporen schaden optimiert, während Lysieren vegetativen Zellen.
  8. Bereiten Sie eine sterile Filtrationseinheit, die Durchmesser von 25 mm Membranen hält durch Autoklavieren, oder (wenn Pyrexglas) Besprühen mit 70% Ethanol und flamm es mit einem Bunsenbrenner. Abkühlen lassen.
  9. Legen Sie eine 0,2 um NC-Membran (Durchmesser 25 mm) an der Filtrationseinheit unter Verwendung von Ethanol-Flamme sterilisierten Pinzette.
  10. Hinzufügen der Probe aus Schritt 4.7 auf die Membran und Filtern der Flüssigkeit unter Verwendung der Vakuumpumpe. Wenn Flüssigkeit durchlaufen hat, schalten Sie Vakuumpumpe. Bei diesem Schritt wird die lysierte vegetative Zellmaterial entfernt wird, da es nicht auf die Membran zurückgehalten. Nur Endosporen auf der Membran verbleiben.
  11. 2 ml steriler physiologischer Lösung zu waschen Rest Wasch- und filtern Sie die Flüssigkeit mit Hilfe der Vakuumpumpe.
  12. Wenn Flüssigkeit vollständig gefiltert wurde, schalten Sie die Vakuumpumpe. Verlassen die Membran auf der Filtrationseinheit.

5. DNase-Behandlung

Hinweis: Führen Sie die DNase-Behandlung direkt auf der Filtermembran. Es ist wichtig, dass die Filtereinheit nicht auslaufen und die Vakuumpumpe wird abgeschaltet.

  1. Fügen Sie 450 ul sterilem Wasser, 50 ul DNase-Reaktionspuffer (1x) und 0,5 ul DNase Enzym direkt auf der Filtermembran und lassen Sie es für 15 Minuten stehen gelassen. Wenn möglich, tun dies die Verdauung in einem Raum, der leicht ist Kriegmer als durchschnittliche RT, da das Enzym arbeitet besser bei Temperaturen von 25 ° C und darüber.
    Anmerkung: Halten des Bunsenbrenners Seite der Filtereinheit erhöht auch die Temperatur und hat den zusätzlichen Vorteil, halten die Umgebung steril daher reduzierten Risiko der Kontamination der Proben.
  2. Wenn die DNase-Verdau beendet ist, schalten Sie Vakuumpumpe, um das Enzym aus der Probe zu entfernen.
  3. Abzuwaschen restliche Enzym durch Zusatz und Filtrieren von 1 ml physiologischer Lösung.
  4. Wenn Flüssigkeit vollständig durchlaufen hat, schalten Sie Vakuumpumpe und entfernen Sie die Filtermembran, Endosporen mit einer sterilen Pinzette und legen Sie sie in eine sterile Petrischale.
    Hinweis: Die Probe getrennt Endosporen ist nun bereit für Downstream-Analyse. Lagerung bei -20 ° C, wenn für die DNA-Extraktion oder alternativ bei 4 ° C verwendet werden, wenn für die Keimung und Kultivierung verwendet.

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Ergebnisse

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Die hier vorgestellten Ergebnisse wurden bereits veröffentlicht 10,21. Bitte für die Umwelt Interpretation und Diskussion der Daten beziehen sich auf diesen Artikel.

Das Gesamtverfahren ist in Figur 1 zusammengefaßt und entspricht drei Hauptschritten: Zuerst wird die Trennung von Biomasse aus Sediment oder andere umwelt Matrix; Zweitens ist die Zerstörung von vegetativen Zellen; und drittens die nachgeschaltete Analyse der getrennten Endosporen. D...

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Diskussion

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Der Widerstand der Endosporen externe aggressive physikochemische Faktoren (zB Temperatur oder Waschmittel) wurde verwendet, um ein Verfahren, um bakterielle Endosporen von vegetativen Zellen in Umweltproben getrennt entwickeln. Dies ist die erste umfassende Methode, um Endosporen aus Umweltproben in einem zerstörungsfrei zu isolieren. Früheren Methoden zu quantifizieren ist, nachzuweisen oder zu analysieren Endosporen Proben wurden über die Messung des spezifischen Proxies für Endosporen wie Dipicolinsäure ode...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

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Die Autoren danken dem Schweizerischen Nationalfonds Grant No. 31003A-132358/1, 31003A_152972 und No. 151948 und Fundation Pierre Mercier Pour La Science.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Whatman Nitrozellulose-Membranfilter, 0,2 μ m Porengröße, 47 mm DurchmesserSigma-AldrichWHA7182004 Aldrich 
Tris(hydroxymethyl)aminomethanSigma-Aldrich252859 Sigma-AldrichCAS 77-86-1
EDTASigma-AldrichE9884 Sigma-AldrichCAS  60-00-4 
Lysozym aus HühnereiweißSigma-Aldrich62971 FlukaPulver, CAS  12650-88-3 
Ultra-Turrax Homogenisator T18 basicIKA3720000
Glasfilterhalter für 47  mm Membranen, PyrexglasEMD MilliporeXX10 047 00
Vakuumpumpe für chemische AnwendungenMilliporeWP6122050220 V/50 Hz
Verteiler-Probenahmefiltration für 25  mm MembranenMillipore1225 ProbenahmeverteilerPolypropylen
DnaseNew England BiolabsM0303SRNASE-frei
NaOHSigma-AldrichS5881 Sigma-AldrichCAS  1310-73-2 
Natriumdodecylsulfhut (SDS)Sigma-AldrichL3771 Sigma 
Whatman Nitrozellulose-Membranfilter, 0,2 μ m Porengröße, 25 mm DurchmesserSigma-AldrichWHA7182002 Aldrich

Referenzen

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Endosporen IsolierungLysis vegetativer ZellenEndosporen AufreinigungVerarbeitung von SedimentprobenMembranfiltrationLysozym BehandlungNatriumhydroxid SDSDNase BehandlungEndosporen AnreicherungNachweis von Firmicutes

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