Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Konstruktion eines dreidimensionalen in vitro Modells der Auskleidung der Bauchhöhle, bestehend aus primären menschlichen Mesothelzellen und Fibroblasten, die mit extrazellulärer Matrix überlagert sind, als Werkzeug zur Untersuchung der Adhäsion, Invasion und Proliferation von Eierstockkrebszellen.
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Methodenartikel
Modellierung der frühen Schritte der Eierstockkrebs Verbreitung in einer organotypischen Kultur der Menschen Peritonealhöhle
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Das Muster der Metastasierung von Eierstockkrebs unterscheidet sich deutlich von dem der meisten anderen Epitheltumoren, da es sich selten hämatogen ausbreitet. Stattdessen werden Eierstockkrebszellen, die aus dem Primärtumor abgeblättert wurden, durch die Bauchfellflüssigkeit zu den Metastasen in der Bauchhöhle transportiert. Diese Stellen, vor allem das abdominale Peritoneum und das Omentum, sind Organe, die von einer mit Mesothel ausgekleideten Oberfläche bedeckt sind. Um die Prozesse der Ausbreitung von Eierstockkrebs zu untersuchen, haben wir ein komplexes dreidimensionales Kultursystem zusammengestellt, das die Auskleidung der Bauchhöhle in vitro rekonstruiert. Primäre humane Fibroblasten und Mesothelzellen wurden aus humanem Omentum isoliert. Die Fibroblasten wurden dann mit extrazellulärer Matrix gemischt und mit einer Schicht der primären menschlichen Mesothelzellen bedeckt, um die peritonealen und omentalen Oberflächen nachzuahmen, auf die metastasierende Eierstockkrebszellen stoßen. Das resultierende organotypische Modell wird, wie gezeigt, verwendet, um die frühen Schritte der Ausbreitung von Eierstockkrebs zu untersuchen, einschließlich der Adhäsion, Invasion und Proliferation von Krebszellen. Dieses Modell wurde in einer Reihe von Studien verwendet, um die Rolle der Mikroumgebung (zellulär und azellulär) bei der frühen Verbreitung von Eierstockkrebs zu untersuchen. Es wurde auch erfolgreich an das Hochdurchsatz-Screening angepasst und zur Identifizierung und Prüfung von Inhibitoren der Metastasierung von Eierstockkrebs eingesetzt.
Einleitung
Eierstockkrebs ist die tödlichste gynäkologische Malignität1. Die Mehrzahl der Patienten wird diagnostiziert, nachdem sich der Krebs in der gesamten Bauchhöhle ausgebreitet hat. Sobald sich der Krebs in der Bauchhöhle ausgebreitet hat, sind zytoreduktive Operationen und Chemotherapien oft keine ausreichende Behandlung, um ein Wiederauftreten des Krebses und eine Chemoresistenz zu verhindern, was zu einer 5-Jahres-Überlebensrate von weniger als 30 % führt. Die Metastasierung von Eierstockkrebs ist überwiegend auf die Bauchhöhle beschränkt, und mehrere andere Krebsarten, darunter Magen-, Bauchspeicheldrüsen- und Dickdarmkrebs, metastasieren an denselben anato....
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Protokoll
Alle beschriebenen Forschungsprotokolle wurden von der University of Chicago Institutional Review Board (IRB) überprüft worden. Einverständniserklärung wurde von jedem Patienten vor der Operation erhalten, und die Studie wurde von der University of Chicago IRB zugelassen. Einem biologischen Sicherheitsschrank Typ 2 und Handschuhe sollten beim Umgang mit menschlichem Gewebe zum Schutz und zur Gefahr der Kontamination Zellen zu reduzieren.
1. Isolierung und Kultur der Primär Nicht transformierte Stromazellen
- Menschliches Gewebe Entnahme und Vorbereitung.
- Erhalten Proben menschlicher Omentum 2 cm 3, während ein....
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Ergebnisse
Die organotypische Kultur wurde hergestellt durch zunächst Mischen primären humanen Fibroblasten, die mit Collagen Typ I und dann Überlagerung dieser Kultur mit der 5-fachen Anzahl von Mesothelzellen montiert. Die Kultur wurde für mindestens 18 Stunden inkubiert, bevor Eierstockkrebszellen wurden zugegeben, um die Adhäsion, Invasion oder Proliferation zu untersuchen. Jeder Test wurde mit mehrfachen wiederholten (n = 3-5) von verschiedenen Patienten und zahlreiche Vertiefungen erhaltenen 3D-Kulturen wurden in jeden Zusta.......
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Diskussion
Ein organModell der Bauchmikroumgebung wurde gegründet, um die individuellen und kollektiven Funktion (en) der beiden zellulären und angeborene Komponenten der Mikroumgebung bei Eierstockkrebs Verbreitung zu bewerten. Die spezielle Protokolle für die Beschichtung und das Anpassen der 3D organotypische Kultur zu Eierstockkrebs Zell-Adhäsion, Proliferation und Invasion zu untersuchen sind. Primäre humane omentalis Mesothelzellen und Fibroblasten wurden von Patienten isoliert und in einem frühen Durchgang verwendet, um nor.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Wir danken allen Assistenzärzten und behandelnden Ärzten, insbesondere Dr. A.F. Haney (Universität von Chicago, Abteilung für Geburtshilfe und Gynäkologie) für das Sammeln von Omentalbiopsien. Außerdem danken wir Stacey Tobin und Gail Isenberg für die sorgfältige Bearbeitung dieses Manuskripts. Diese Arbeit wurde unterstützt von Bears Care, dem gemeinnützigen Begünstigten des Chicago Bears Football Club, dem National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) R21 NS075702 und dem National Cancer Institute Grant R01 CA111882 an E.L.
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Materialien
Zellkultureinsätze (8um, 24-Well)BD Biosciences 353097 Wattestäbchen Wattestäbchen Wattestäbchen Mikroskop Zeiss Axiovert 200m Cell Profiler Public Domain 24-Well-Platte
353136
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1. Isolierung und Kultivierung von Primärzellen | |||
| PBS | Fisher Scientific | SH3001304 | |
| Einschneidige Rasierklingen | Fisher Scientific | 12-640 | |
| 15 cm Kulturschalen | BD Biosciences | 353025 | |
| Glaskolben | ? | ? | |
| Fötales Rinderserum (FBS) | Life Technologies | 16000044_3616914956 | |
| DMEM mit L-Glutamin | Corning | 10-013-CV | |
| MEM Vitamine | Corning | 25-020-Cl | |
| MEM Nichtessentielle Aminosäuren | Corning | 25-025-CI | |
| Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Schüttel | Thermo-Fisher | MaxQ 4450 | |
| Zentrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Inkubator | Thermo-Fisher | Forma Series II Wasserummantelter CO2-Inkubator Modell 3100 | |
| Trypsin EDTA, 1x (0,25%) | Corning | 25-053-CI | |
| Hyaluronidase | Worthington Biochemisches | LS002592 | |
| T-75 Kolben | BD Biosciences | ||
| T-175 Kolben | BD Biosciences | 353112 | |
| Pipettenspitzen | Rainin | P2, P10, P20, P200 und P1000 | |
| Pipettenspitzen | Corning Gefilterte | Spitzen P2, P10, P20, P200 und P1000 | |
| Name des Reagenzes/ Geräts< | strong>Unternehmen | Katalognummer | Kommentare/Beschreibung |
| 2. Beschichtung 3D-Kultur | |||
| Zellzähler | Invitrogen | Countess Countess | |
| Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10313 | |
| Trypanblauer Farbstoff (0,4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Kollagen Typ I (Rattenschwanz) | BD Biosciences | 354236 | |
| 96-Well-Platte, klarer Boden, schwarz | BD Biosciences | 353219 | |
| Name des Reagenzes/ Ausrüstung | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare/Beschreibung |
| 3. Adhäsionsassay | |||
| Mehrkanalpipette | Eppendorf | Xplorer 300 | |
| Paraformaldehydlösung 4% in PBS | Santa Cruz Biotechnologie | sc-281692 | |
| Plattenleser | Molekulare Geräte | Minimax | |
| Name des Reagenzes/ Geräts | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare/Beschreibung |
| 5. Invasionsassay | |||
| BD Biosciences | 353047 | ||
| Name des Reagenzes/ Ausrüstung | Unternehmen | Katalognummer | <>strong>Kommentare/Beschreibung |
| 6. Antikörper | |||
| Anti-Integrin & Alpha; VΒ 3 Antikörper, Klon LM609 | EMD Millipore | MAB1976 | |
| Beta 1 | Oncosynergy | OS2966 | |
| Alpha 5 [CD49e] | ID Pharmingen | 555615 | |
| Beta 4 [CD104] | EMD Millipore | MAB 2058 |
Referenzen
- Siegel, R., Ma, J., Zou, Z., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J. Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
- Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. Am. J. Pathol. 177, 1053-1064 (2010).
- Quail, D. F., Joyce, J. A.
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Nachdrucke und Genehmigungen
