Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Modellierung der frühen Schritte der Eierstockkrebs Verbreitung in einer organotypischen Kultur der Menschen Peritonealhöhle

26.6K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/53541

⸱

31. Dezember 2015

 ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Section of Gynecologic Oncology, University of Chicago

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Konstruktion eines dreidimensionalen in vitro Modells der Auskleidung der Bauchhöhle, bestehend aus primären menschlichen Mesothelzellen und Fibroblasten, die mit extrazellulärer Matrix überlagert sind, als Werkzeug zur Untersuchung der Adhäsion, Invasion und Proliferation von Eierstockkrebszellen.

Zusammenfassung

Das Muster der Metastasierung von Eierstockkrebs unterscheidet sich deutlich von dem der meisten anderen Epitheltumoren, da es sich selten hämatogen ausbreitet. Stattdessen werden Eierstockkrebszellen, die aus dem Primärtumor abgeblättert wurden, durch die Bauchfellflüssigkeit zu den Metastasen in der Bauchhöhle transportiert. Diese Stellen, vor allem das abdominale Peritoneum und das Omentum, sind Organe, die von einer mit Mesothel ausgekleideten Oberfläche bedeckt sind. Um die Prozesse der Ausbreitung von Eierstockkrebs zu untersuchen, haben wir ein komplexes dreidimensionales Kultursystem zusammengestellt, das die Auskleidung der Bauchhöhle in vitro rekonstruiert. Primäre humane Fibroblasten und Mesothelzellen wurden aus humanem Omentum isoliert. Die Fibroblasten wurden dann mit extrazellulärer Matrix gemischt und mit einer Schicht der primären menschlichen Mesothelzellen bedeckt, um die peritonealen und omentalen Oberflächen nachzuahmen, auf die metastasierende Eierstockkrebszellen stoßen. Das resultierende organotypische Modell wird, wie gezeigt, verwendet, um die frühen Schritte der Ausbreitung von Eierstockkrebs zu untersuchen, einschließlich der Adhäsion, Invasion und Proliferation von Krebszellen. Dieses Modell wurde in einer Reihe von Studien verwendet, um die Rolle der Mikroumgebung (zellulär und azellulär) bei der frühen Verbreitung von Eierstockkrebs zu untersuchen. Es wurde auch erfolgreich an das Hochdurchsatz-Screening angepasst und zur Identifizierung und Prüfung von Inhibitoren der Metastasierung von Eierstockkrebs eingesetzt.

Einleitung

Eierstockkrebs ist die tödlichste gynäkologische Malignität1. Die Mehrzahl der Patienten wird diagnostiziert, nachdem sich der Krebs in der gesamten Bauchhöhle ausgebreitet hat. Sobald sich der Krebs in der Bauchhöhle ausgebreitet hat, sind zytoreduktive Operationen und Chemotherapien oft keine ausreichende Behandlung, um ein Wiederauftreten des Krebses und eine Chemoresistenz zu verhindern, was zu einer 5-Jahres-Überlebensrate von weniger als 30 % führt. Die Metastasierung von Eierstockkrebs ist überwiegend auf die Bauchhöhle beschränkt, und mehrere andere Krebsarten, darunter Magen-, Bauchspeicheldrüsen- und Dickdarmkrebs, metastasieren an denselben anatomischen Stellen in der Bauchhöhle. Im Allgemeinen lösen sich Eierstockkrebszellen vom In-situ-Karzinom im Eileiter oder im primären Ovarialtumor, wandern in der Peritonealflüssigkeit als Einzelzellen oder Sphäroide und heften sich an mit Mesothel ausgekleidete Oberflächen des Omentums, des Darms und der Bauchdecke2.

Die Mikroumgebung des Tumors spielt eine wichtige Rolle beim Fortschreiten der Krankheit und bei der Chemoresistenz bei vielen Krebsarten3-6. Die Peritonealhöhle ist eine einzigartige Mikroumgebung, in der die meisten Oberflächen von einer mesothelialen Zellmonoschicht bedeckt sind (Abbildung 1A)7. Die mesotheliale Auskleidung fungiert als Barriere, die eine reibungsarme Oberfläche schafft, die tendenziell vor der Adhäsion von Krebszellen schützt8. Unmittelbar unter dieser mesothelial ausgekleideten Oberfläche befindet sich eine Schicht, die überwiegend aus Fibroblasten und extrazellulärer Matrix (EZM) besteht, die die Adhäsion und Invasion von Krebszellen fördern8. Eierstockkrebszellen sezernieren Faktoren, die Veränderungen in der mesothelialen Zellauskleidung induzieren, die die Adhäsion, Invasion und Metastasierung von Eierstockkrebszellen verbessern9,10. Eierstockkrebszellen haften über Integrin und CD44-vermittelte Mechanismen an der mesothelialen Oberfläche (Abbildung 1B)11-16.

Historisch wurden mehrere 3D-Modelle entwickelt, um die Wechselwirkungen von Eierstockkrebs mit der Mikroumgebung zu untersuchen. Einige der ersten Modelle untersuchten die Schnittstelle zwischen Eierstockkrebs und EZM17-21, die Kommunikation zwischen Eierstockkrebs und Mesothelzellen13, 14, 21-24 oder beides25 (von uns überprüft 26). Niedbala et al. entdeckten, dass Eierstockkrebszellen eine schnellere und festere Adhäsion an EZM aufweisen als an Mesothelzellen oder an Plastik allein25. Diese Modelle ähnelten jedoch histologisch nicht der peritonealen Mikroumgebung. Aus diesem Grund haben wir ein organotypisches 3D-Modell erstellt, um die Mikroumgebung des Eierstockkrebses gründlicher zu replizieren. Um die Rolle der Mikroumgebung und die Interaktion zwischen Krebs und Peritonealzellen bei der peritonealen Ausbreitung von Eierstockkrebs besser zu verstehen, haben wir ein organotypisches 3D-Kulturmodell der Peritonealhöhlenauskleidung in vitro entwickelt (schematisch in Abbildung 1C). Das vorgeschlagene Modell besteht aus primären humanen Fibroblasten und EZM, bedeckt mit einer Schicht primärer humaner Mesothelzellen - jeder Zelltyp wird aus dem menschlichen Omentum isoliert. Histologisch ähnelt dieses Modell der normalen Peritoneal- oder Omentalschleimhaut und bietet eine Oberfläche, auf der wir die Mikroumgebung des Tumors, die Interaktion zwischen Krebszellen und normalem Gewebe sowie die Prozesse der Adhäsion, Invasion und Proliferation von Krebszellen untersuchen können8.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Alle beschriebenen Forschungsprotokolle wurden von der University of Chicago Institutional Review Board (IRB) überprüft worden. Einverständniserklärung wurde von jedem Patienten vor der Operation erhalten, und die Studie wurde von der University of Chicago IRB zugelassen. Einem biologischen Sicherheitsschrank Typ 2 und Handschuhe sollten beim Umgang mit menschlichem Gewebe zum Schutz und zur Gefahr der Kontamination Zellen zu reduzieren.

1. Isolierung und Kultur der Primär Nicht transformierte Stromazellen

  1. Menschliches Gewebe Entnahme und Vorbereitung.
    1. Erhalten Proben menschlicher Omentum 2 cm 3, während einer Bauchoperation entfernt wird, und unmittelbar eint Gewebe in RT Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) (2A). Ein Stück Omentum 3 cm x 2 cm in der Regel ergibt 1 Million primären humanen Mesothelzellen (HPMC) und 200.000 primäre menschliche Fibroblasten oder normale omentalis Fibroblasten (NOF).
    2. Spin down die PBS wurde das Gewebe in 0,5 × g für 3 eingetauchtmin so bald wie möglich nach der Entnahme (<2 h in PBS) und übertragen das Gewebe frischen 20 ml PBS in einem 50 ml konischen Röhrchen. Cut up Gewebe in 5 mm 3 Stück durch Zerkleinern mit Skalpellen in einem Durchmesser von 15 cm, sterile Kulturschale (2B).
  2. Primäre humane Mesothelzellen Zellisolierung 8
    1. Um HPMC zu isolieren, übertragen Sie die zerkleinerte Gewebe in 50 ml konische Röhrchen und warten Sie 1 min für die festen Stücke, an die Spitze (2C & D) zu schweben. HPMC und rote Blutzellen (RBC) in der Flüssigkeit auf dem Boden vorhanden sein. Verwenden einer Pipette, um die Flüssigkeit vom Boden des Rohres und in ein neues konisches Rohr zu entfernen. Drehen Sie die Flüssigkeit nach unten bei 0,5 × g für 3 min und saugen Sie den Überstand aus der HPMC / RBC-Pellet.
      1. Wiederholen Sie den Vorgang drei Mal: ​​20 ml PBS zu dem zerkleinerten Gewebes ermöglichen Gewebe zu steigen, zu entfernen Flüssigkeit vom Boden mit einer Pipette und in die HPMC / RBC Rohr, Spin-down, und entfernen Sie dieÜberstand. Nachdem alle Spins abgeschlossen und der Überstand wird abgesaugt, wird das Pellet HPMC und RBC enthalten.
    2. Platte alle Zellen aus dem Pellet in einen 75 cm 2 -Kolben in 15 ml Vollwachstumsmedium (DMEM mit 10% fötalem Rinderserum [FBS], 1% MEM-Vitamine [93 mg / L], 1% MEM nichtessentiellen Aminosäuren [81,4 mg / L], 1% Penicillin-Streptomycin [Pen-Strep, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin]).
    3. Führen Sie eine sekundäre PBS zu waschen, um zusätzliche HPMCs isolieren.
      1. Für die Sekundär PBS waschen, schütteln Sie die verbleibende feste Gewebe mit 200 Upm, 37 ° C für 10 min in 20 ml PBS, dann warten 1 min für das Gewebe, um nach oben zu schweben. Entfernen der Flüssigkeit aus dem Boden des Rohrs in ein neues Gefäß, Zentrifuge bei 0,5 × g für 3 min, und den Überstand aspirieren.
      2. Teller alle HPMC / RBC aus der Sekundär PBS waschen in einem separaten 75 cm 2-Kolben in 15 ml Vollwachstumsmedium.
    4. Um jede r isolierenemaining HPMC, Schütteln des zerkleinerten Gewebes mit 200 Upm, 37 ° C Grad für 10 min in 20 ml einer 1: 1 0,25% Trypsin 25 mM EDTA: PBS-Lösung, bezogen auf das Volumen. Lassen Sie das Gewebe zu erheben, sammeln die Flüssigkeit am Boden des Röhrchens in eine neue 50-ml-Tube und Spin-down bei 0,5 gx 3 min.
      1. Saugen Sie den Überstand und die Platte alle HPMC / RBC in einem separaten 75 cm 2-Kolben in 15 ml Vollwachstumsmedium.
    5. Kultur die plattierten Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 in einer feuchten Umgebung. Vorschub plattierten Zellen durch Zugabe von 15 ml Vollwachstumsmedium an den Tagen 3 und 5 ohne Entfernen der verbrauchten Medien. HPMC kann für 5-7 Tage vor der Spaltung kultiviert werden.
      1. Verwenden Niedergang HPMC (bis Durchgang 2) bei allen Versuchen zur Entdifferenzierung und Änderung der ursprünglichen Phänotyp zu minimieren. Verwenden Sie ein Weitfeldmikroskop vorzugsweise mit einem 20x-Objektiv mit Kunststoff-Differential-Interferenz-Kontrast-Funktionen oder 4-20x Ziel mit Phasenkontrast capabilities (Phasenkontrastfilter auf Mikroskop) für die Aufnahme aller Bilder von Zellen und eine 10-fach Objektiv () in Hellfeld zu analysieren immunhistochemischen 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) Färbung.
    6. Bestätigen, dass die HPMC sind quaderförmig und Express Cytokeratin 8 und Vimentin, indem Immunhistochemie 8 (3A, C, E).
  3. NOF Isolierung 8
    1. Bereiten Sie 10 ml des Vorrates des Collagenase Typ III-Lösung (10x) durch die Kombination einer 1: 1: 1-Mischung von 100x Pen-Strep: 1.500 Einheiten Aktivität / ml Collagenase Typ III: 714 Units Aktivität / ml Hyaluronidase in PBS.
    2. Schütteln des zerkleinerten Omentum Gewebe, nachdem HPMC Isolation bleibt bei 200 rpm, 37 ° C für 6 Stunden in 10 ml des 10x Collagenase Typ III-Lösung in einem serumfreien Medium verdünnt (DMEM mit 1% MEM-Vitamine [93 mg / L], 1% MEM nichtessentiellen Aminosäuren [81,4 mg / L], 1% Penicillin-Streptomycin [Pen-Strep, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin]). Verdauten Gewebe undurchsichtigen schauen und kann einige faserige Ablagerungen (2E) haben.
    3. Zentrifugieren Sie die Lösung, die NOF-Zellen in Suspension bei 0,5 × g für 3 min bei RT, saugen Sie den Überstand und die Platte des Pellets in einem 75 cm 2-Kolben in 13 ml Vollwachstumsmedium.
    4. Entfernen Sie alte Medien und ersetzen Sie sie durch 15 ml frisches Vollwachstumsmedium nach 24 Stunden. NOF können für 1-3 Tage vor der Spaltung kultiviert werden. Hinweis Proliferation des NOF wird aufhören, wenn die Zellen Konfluenz erreichen.
    5. Bestätigen Sie, dass die primären menschlichen Fibroblasten sind flache, langgestreckte Zellen und exprimieren Vimentin aber nicht Cytokeratin-8 durch Ausführen Immunhistochemie 8 (3B, D, F). Verwenden Niedergang NOF für Experimente (im Idealfall vor dem Durchgang 3) Entdifferenzierung zu minimieren und Änderung der ursprünglichen Phänotyp. Verwenden Sie ein Weitfeld-Mikroskop mit einem 20x-Objektiv mit Kunststoff-DIC-Fähigkeiten dafür verantwortlich, alle Phasenbilder von Zellen,und eine 10-fach Objektiv in Hellfeld zu analysieren immunhistochemischen DAB-Färbung.

2. Überzug die organotypische Kultur 8

  1. Release NOF vom 75 cm Kulturkolben durch Spülen mit 10 ml PBS, gefolgt von 3 ml 0,25% Trypsin / 25 mM EDTA für nicht mehr als 5 min. Neutralisieren Trypsin mit mindestens 3-fache des Volumens der Vollwachstumsmedium.
  2. Übertragen Sie mit Trypsin-Zellen in einem 50 ml konischen Rohr und Spin-down bei 0,5 gx 3 min. Überstand entfernen und bringen Zellen wieder in 5 ml Vollwachstumsmedium. Verwenden Sie einen Zellenzähler, um die Zellen von der Kulturflasche gewonnen zu zählen.
  3. Verdünnte Zellen in dem entsprechenden Volumen der vollen Wachstumsmedien zu 2.000-4.000 NOF pro 100 & mgr; l auf eine schwarze, klarem Boden, 96-Well-Platte Platte. Mit 0,5 ug / 100 ul Rattenschwanzkollagen I zu dem Zellgemisch vor dem Plattieren. Lassen Zellen sitzen bei 37 ° C in 5% CO 2 in einer feuchten Umgebung für mindestens 4 Stunden, oder bis die Zellenan der Plattenoberfläche haftet.
  4. Lassen HPMC von der Kulturflasche mit den gleichen Schritten in 2.1 und 2.2 beschriebenen Methoden. Verdünnte Zellen in der entsprechenden Menge an Vollwachstumsmedium auf 10.000-20.000 HPMC pro 50 & mgr; l auf der Oberseite der NOF in 96-Well-Platten bereits mit Kollagen I überzogene Platte. Lassen Sie die Zellen sitzen bei 37 ° C in 5% CO 2 in einer feuchten Umgebung für mindestens 18 Stunden vor Beginn der Experimente.
  5. Kultur grün fluoreszierende Protein (GFP) exprimierenden HeyA8 Eierstockkrebszellen in vollem Wachstum Medien. HeyA8 Ovarkrebszellen fluoreszenz durch Expression von einem lentiviralen Vektor, der copepod CGFP (pcdh-CMV-MCS-EF1) markiert. HeyA8 Ovarkrebszellen sollte 80-90% konfluent waren am Tag der Verwendung (logarithmischen Phase) sein. Lassen Zellen von der Kulturplatte und zählen mit den gleichen in Schritten von 2,1 bis 2,2 für die Primärzellen beschriebenen Methoden.
  6. Lassen Sie Eierstockkrebszellen in Vollwachstumsmedium für 15-20 Minuten bei 37 ° C in eine erholenkonischen Röhrchen mit dem Deckel lose verschlossen.

3. Adhäsionsassay 8

  1. Nach der Wiederherstellung zu pelletieren, die Eierstockkrebszellen durch Spinnen für 3 min bei 0,5 xg und entfernen Sie den Überstand und verdünnt, die Zellen in das entsprechende Volumen von serumfreien Medien, um eine Konzentration von 50.000 Zellen / 100 ul zu erreichen.
  2. Kehren Sie die 96-Well-Platten mit den HPMC / NOF organotypischen Kulturen zu verbrauchten Medien zu entfernen, und fügen Sie 100 ul der Krebszellsuspension in Serum-freiem Medium in jede Vertiefung. Inkubieren der Platte bei 37 ° C in 5% CO 2 in einer feuchten Umgebung für 30 min bis 4 h.
  3. Kehren Sie die Platte mit 96 Vertiefungen, um Medien und nicht-anhaftende Zellen zu entfernen. Verwenden Sie ein Mehrkanalpipette mit geringer Leistung, um vorsichtig und sanft Je 100 ul PBS in jede Vertiefung, und invertieren Platte wieder. Wiederholen Sie die PBS waschen einmal.
  4. Kehren Sie zum PBS entfernen und 100 ul 4% Paraformaldehyd in jede Vertiefung. Damit die Platte für 20 mi sitzenn der Zellen zu reparieren. Nach 20 Minuten, die Platte umdrehen und fügen Sie 100 ul PBS.
  5. Man beachte, dass die Gesamtfluoreszenz Wells können gemeldet werden, oder die Anzahl von Zellen quantifiziert werden kann. Zur Quantifizierung erste Platte eine Standardkurve in Doppelbestimmung unter Verwendung HeyA8 Zellen bei einer Konzentration von 1 Million Zellen / ml.
    1. Stellen Sie die Standardkurve indem sie zum Stillstand 1 Million Zellen, Entfernen von Medien, und es ihnen ermöglicht, in 1 ml 4% Paraformaldehyd für 20 Minuten sitzen.
    2. Spin-Zellen wieder und bringen Sie in 1 ml PBS (Nachzählung Zellen 1 Million / ml-Konzentration, um zu bestätigen). Platte 50000, 40000, 30000, 20000, 10000, 5000, 1000 und 0 Zellen pro Vertiefung in doppelten und fügen PBS zur endgültigen Gesamtvolumen von 50 ul in jede Vertiefung.
  6. Unten lesen Sie die Kulturplatte auf einem Fluoreszenzplattenlesegerät (Anregung = 488 nm, Emission = 528 nm), Skalierung hohen Brunnen (50000 auf Standardkurve). Verwenden Sie die Standardkurve zu berechnen, wie viele Eierstockkrebszellen auf die organotyp haltenic Kultur in jeder Vertiefung (4A-C).

4. Proliferationstest 10

  1. Nachdem die Eierstockkrebszellen zu erholen (siehe Schritte 2.5 und 2.6 oben), pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugieren für 3 min bei 0,5 × g und dann zu verdünnen, die Zellen in das entsprechende Volumen von 1% FBS Medien (DMEM mit 1% FBS, 1% MEM Vitamine [93 mg / L], 1% MEM nichtessentiellen Aminosäuren [81,4 mg / L], 1% Penicillin-Streptomycin [Pen-Strep, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin]), um eine Konzentration von 4000 Zellen zu erreichen / 150 ul.
  2. Kehren Sie die 96-Loch-Platte mit den HPMC / NOF organotypischen Kulturen, um verbrauchte Medium in jede Vertiefung zu entfernen, und fügen Sie 150 ul der Krebszelle Suspension 1% FBS Medien. Inkubieren der Platte bei 37 ° C in 5% CO 2 in einer feuchten Umgebung für 72 Stunden.
  3. Unten lesen Sie die Kulturplatte auf einem Fluoreszenzplattenlesegerät einmal täglich (Anregung = 488 nm, Emission = 528 nm), um die relative Verbreitung bewertender Zellen. Weiterhin den Test 96 Stunden, wenn der Medien bei 48 h (5A-C). Achten Sie darauf, die Kultur zu stören beim Medienwechsel (Umdrehen der Platte ist bevorzugt).

5. Invasion Assay 8

  1. Vor der Beschichtung der 3D-Kultur, fügen 7,5 & mgr; g Rattenschwanz Kollagen I in 200 ul PBS auf eine 24-Well-Kulturplatte Einsatz (8 & mgr; m Porengröße). Lassen Sie die Platte Inkubat O / N, dann vorsichtig die PBS mit einer Pipette unmittelbar vor dem Beschichten des HPMC / NOF organotypische Kultur auf die Kollagen-beschichteten Einsätze (Schritt 2, oben).
  2. Bereiten Sie die Eierstockkrebszellen, wie in Schritt 3.1. Um die Eierstockkrebszellen auf die organotypischen Kulturen an den Einsätzen Platte vorsichtig mit einer Pipette, um überschüssiges Medium aus dem oberen der Einsätze zu entfernen. Zugabe von 100 ul der Ovarialkarzinom-Zellsuspension in serumfreien Medien in jede Kammer.
  3. Fügen Sie 750 ul Vollwachstumsmedium in das Bohrloch unterhalb des Einsatzes, um Krebszellen in induzierenvasion in den organotypischen Kulturen. Inkubieren der Platte bei 37 ° C in 5% CO 2 in einer feuchten Umgebung für 24 Stunden.
    Hinweis: Eierstockkrebszellen, die die organotypische Kultur wird der Einsatz zu überqueren und bleiben auf der unteren Seite des Einsatzes einzudringen.
  4. Nach 24 Stunden, fassen Sie den Einsatz mit einer Zange und kurz abspülen in einen Becher mit PBS, bewegen Sie dann den Einsatz in eine leere gut. Gestrüpp der Oberseite jeder Einsatz mit beidseitig einer Wattestäbchen für insgesamt 1 min. Stellen Sie schnell den Einsatz in eine Platte mit 750 & mgr; l 4% Paraformaldehyd in jede Vertiefung. Lassen Sie jeder Einsatz in Paraformaldehyd für 10 Minuten, bevor die Übertragung der Einlagen in Vertiefungen mit 750 & mgr; l PBS gefüllt sitzen.
  5. Sehen Sie sich die Invasion Zellen (geklebt und an der Unterseite des Inserts fixiert) mit einem Mikroskop bei 2,5-facher Vergrößerung. Wenn der gesamte Brunnen ist im Blickfeld, passen Sie die Vergrößerung auf 10-fach und nehmen Sie 5 Bildern, einer nahe dem Zentrum und 1 in jedem Quadranten des Brunnens, die VermeidungAufnehmen von Bildern, die zu nahe an den Kanten. Folgen dem gleichen Muster für jede Vertiefung.
  6. Verwenden der Herstellerprogramm, um die Anzahl der Zellen in jeder Bild zählen, eine durchschnittliche Anzahl an Zellen in jeder Vertiefung (6A-C) eingedrungen pro Feld entsprechend ihrem Protokoll zu erhalten.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Die organotypische Kultur wurde hergestellt durch zunächst Mischen primären humanen Fibroblasten, die mit Collagen Typ I und dann Überlagerung dieser Kultur mit der 5-fachen Anzahl von Mesothelzellen montiert. Die Kultur wurde für mindestens 18 Stunden inkubiert, bevor Eierstockkrebszellen wurden zugegeben, um die Adhäsion, Invasion oder Proliferation zu untersuchen. Jeder Test wurde mit mehrfachen wiederholten (n = 3-5) von verschiedenen Patienten und zahlreiche Vertiefungen erhaltenen 3D-Kulturen wurden in jeden Zusta...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Ein organModell der Bauchmikroumgebung wurde gegründet, um die individuellen und kollektiven Funktion (en) der beiden zellulären und angeborene Komponenten der Mikroumgebung bei Eierstockkrebs Verbreitung zu bewerten. Die spezielle Protokolle für die Beschichtung und das Anpassen der 3D organotypische Kultur zu Eierstockkrebs Zell-Adhäsion, Proliferation und Invasion zu untersuchen sind. Primäre humane omentalis Mesothelzellen und Fibroblasten wurden von Patienten isoliert und in einem frühen Durchgang verwendet, um nor...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Wir danken allen Assistenzärzten und behandelnden Ärzten, insbesondere Dr. A.F. Haney (Universität von Chicago, Abteilung für Geburtshilfe und Gynäkologie) für das Sammeln von Omentalbiopsien. Außerdem danken wir Stacey Tobin und Gail Isenberg für die sorgfältige Bearbeitung dieses Manuskripts. Diese Arbeit wurde unterstützt von Bears Care, dem gemeinnützigen Begünstigten des Chicago Bears Football Club, dem National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) R21 NS075702 und dem National Cancer Institute Grant R01 CA111882 an E.L.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Zellkultureinsätze (8um, 24-Well)BD Biosciences 353097 Wattestäbchen Wattestäbchen Wattestäbchen Mikroskop Zeiss Axiovert 200m Cell Profiler Public Domain 24-Well-Platte
Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1. Isolierung und Kultivierung von Primärzellen
PBSFisher ScientificSH3001304
Einschneidige RasierklingenFisher Scientific12-640
15 cm KulturschalenBD Biosciences353025
Glaskolben??
Fötales Rinderserum (FBS)Life Technologies16000044_3616914956
DMEM mit L-GlutaminCorning10-013-CV
MEM VitamineCorning25-020-Cl
MEM Nichtessentielle AminosäurenCorning25-025-CI
Penicillin-StreptomycinCorning30-002-CI
Schüttel Thermo-FisherMaxQ 4450
ZentrifugeEppendorf5702
InkubatorThermo-FisherForma Series II Wasserummantelter CO2-Inkubator Modell 3100
Trypsin EDTA, 1x (0,25%)Corning25-053-CI
HyaluronidaseWorthington BiochemischesLS002592
T-75 KolbenBD Biosciences
T-175 KolbenBD Biosciences353112
PipettenspitzenRaininP2, P10, P20, P200 und P1000
PipettenspitzenCorning GefilterteSpitzen P2, P10, P20, P200 und P1000
Name des Reagenzes/ Geräts<strong>UnternehmenKatalognummerKommentare/Beschreibung
2. Beschichtung 3D-Kultur
ZellzählerInvitrogenCountess Countess
Cell Counting Chamber SlidesInvitrogenC10313
Trypanblauer Farbstoff (0,4%)Gibco15250-061
Kollagen Typ I (Rattenschwanz)BD Biosciences354236
96-Well-Platte, klarer Boden, schwarzBD Biosciences353219
Name des Reagenzes/ AusrüstungUnternehmenKatalognummerKommentare/Beschreibung
3. Adhäsionsassay
MehrkanalpipetteEppendorfXplorer 300
Paraformaldehydlösung 4% in PBSSanta Cruz Biotechnologiesc-281692
PlattenleserMolekulare GeräteMinimax
Name des Reagenzes/ GerätsUnternehmenKatalognummerKommentare/Beschreibung
5. Invasionsassay
BD Biosciences353047
Name des Reagenzes/ AusrüstungUnternehmenKatalognummer<>strong>Kommentare/Beschreibung
6. Antikörper
Anti-Integrin & Alpha; VΒ 3 Antikörper, Klon LM609EMD MilliporeMAB1976
Beta 1 OncosynergyOS2966
Alpha 5 [CD49e]ID Pharmingen555615
Beta 4 [CD104]EMD MilliporeMAB 2058
353136

Referenzen

  1. Siegel, R., Ma, J., Zou, Z., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J. Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
  2. Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. Am. J. Pathol. 177, 1053-1064 (2010).
  3. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat. Med. 19, 1423-1437 (2013).
  4. Correia, A. L., Bissell, M. J. The tumor microenvironment is a dominant force in multidrug resistance. Drug Resist Updat. 15, 39-49 (2012).
  5. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: Functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21, 309-322 (2012).
  6. Nieman, K. M., et al. Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth. Nat. Med. 17, 1498-1503 (2011).
  7. Daya, D., McCaughy, W. T. Pathology of the peritoneum: A review of selected topics. Semin. Diagn. Pathol. 8, 277-289 (1991).
  8. Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells. Int. J. Cancer. 121, 1463-1472 (2007).
  9. Kenny, H. A., Kaur, S., Coussens, L. M., Lengyel, E. The initial steps of ovarian cancer cell metastasis are mediated by MMP-2 cleavage of vitronectin and fibronectin. J. Clin. Invest. 118, 1367-1379 (2008).
  10. Kenny, H. A., et al. Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion. J. Clin. Invest. 124, 4614-4628 (2014).
  11. Strobel, T., Cannistra, S. A. β1-integrins partly mediate binding of ovarian cancer cells to peritoneal mesothelium in vitro. Gynecol. Oncol. 73, 362-367 (1999).
  12. Strobel, T., Swanson, L., Cannistra, S. A. In vivo inhibition of CD44 limits intra-abdominal spread of a human ovarian cancer xenograft in nude mice: A novel role for CD 44 in the process of peritoneal implantation. Cancer Res. 57, 1228-1232 (1997).
  13. Iwanicki, M., et al. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discov. 1, 144-157 (2011).
  14. Lessan, K., Aguiar, D., Oegema, T. R., Siebenson, L., Skubitz, A. P. CD44 and β1 integrin mediate ovarian carcinoma cell adhesion to peritoneal mesothelial cells. Am. J. Pathol. 154, 1525-1537 (1999).
  15. Ahmed, N., Riley, C., Rice, G., Quinn, M. Role of integrin receptors for fibronectin, collagen and laminin in the regulation of ovarian carcinoma functions in response to a matrix microenvironment. Clin. Exp. Metastasis. 22, 391-402 (2005).
  16. Kaur, S., et al. β3-integrin expression on tumor cells inhibits tumor progression, reduces metastasis, and is associated with a favorable prognosis in patients with ovarian cancer. Am. J. Pathol. 175, 2184-2196 (2009).
  17. Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. In vitro degradation of extracellular matrix by human ovarian carcinoma cells. Clin. Exp. Metastasis. 5, 181-197 (1987).
  18. Kanemoto, T., Martin, G. R., Hamilton, T. C., Fridman, R. Effects of synthetic peptides and protease inhibitors on the interaction of a human ovarian cancer cell line (NIH:OVCAR-3) with a reconstituted basement membrane (matrigel). Invasion Metastasis. 11, 84-92 (1991).
  19. Rieppi, M., et al. Mesothelial cells induce the motility of human ovarian carcinoma cells. Int. J. Cancer. 80, 303-307 (1999).
  20. Barbolina, M. V., Adley, B. P., Ariztia, E. V., Liu, Y., Stack, M. S. Microenvironmental regulation of membrane type 1 matrix metalloproteinase activity in ovarian carcinoma cells via collagen-induced EGR1 expression. J. Biol. Chem. 282, 4924-4931 (2007).
  21. Burleson, K. M., et al. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).
  22. Suzuki, N., et al. HMOCC-1, a human monoclonal antibody that inhibits adhesion of ovarian cancer cells to human mesothelial cells. Gynecol. Oncol. 95, 290-298 (2004).
  23. Kishikawa, T., et al. Two distinct pattern of peritoneal involvement shown by in vitro and in vivo ovarian cancer dissemination models. Invas. Metast. 15, 11-21 (1995).
  24. Casey, R. C., et al. Establishment of an in vitro assay to measure the invasion of ovarian carcinoma cells through mesothelial cell monolayers. Clin. Exp. Metastasis. 20, 343-356 (2003).
  25. Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. Interactions of human ovarian tumor cells with human mesothelial cells grown on extracellular matrix. Exp. Cell Res. 160, 499-513 (1985).
  26. White, E. A., Kenny, H. A., Lengyel, E. Three-Dimensional modeling of ovarian cancer. Adv. Drug Deliv. Rev. 79-80, 184-192 (2014).
  27. Kenny, H. A., et al. Quantitative high throughput screening using a primary human three-dimensional organotypic culture predicts in vivo efficacy. Nature Comm. , (2015).
  28. Sawada, K., et al. c-Met overexpression is a prognostic factor in ovarian cancer and an effective target for inhibition of peritoneal dissemination and invasion. Cancer Res. 67, 1670-1680 (2007).
  29. Kenny, H. A., Lengyel, E. MMP-2 functions as an early response protein in ovarian cancer metastasis. Cell cycle. 8, 683-688 (2009).
  30. Sawada, K., et al. Loss of E-cadherin promotes ovarian cancer metastasis via alpha 5-integrin, which is a therapeutic target. Cancer Res. 68, 2329-2339 (2008).
  31. Mitra, A. K., et al. Ligand-independent activation of c-Met by fibronectin and α(5)β(1)-integrin regulates ovarian cancer invasion and metastasis. Oncogene. 30, 1566-1576 (2011).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Tags

Peritonealhöhlenmodellprimäre humane Mesothelzellennormale Omentum-FibroblastenKrebszelladhäsionKrebszellinvasionKrebszellproliferationRGD-Peptid-InhibitionIntegrin-Blockierantikörper
Modellierung der frühen Schritte der Eierstockkrebs Verbreitung in einer organotypischen Kultur der Menschen Peritonealhöhle
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.