Methodenartikel

High Yield Expression von rekombinanten humanen Proteinen mit der transiente Transfektion von HEK293 Zellen in Suspension

DOI:

10.3791/53568

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28. Dezember 2015

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1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University, 2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

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Zusammenfassung

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Die Produktion von eukaryotischen Proteinen im Labormaßstab mit entsprechender posttranslationaler Modifikation stellt ein erhebliches Hindernis dar. Hier ist ein robustes Protokoll mit schneller Etablierung und Durchlaufzeit für die Proteinexpression unter Verwendung eines Säugetier-Expressionssystems. Dieses System unterstützt die selektive Aminosäuremarkierung, die selektive Markierung von Proteinen und die kleinmolekulare Modulatoren der Glykanzusammensetzung.

Zusammenfassung

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Die Kunst der Herstellung von rekombinanten Proteinen mit komplexen post-translationale Modifikationen stellt eine große Herausforderung für die Untersuchung der Struktur und Funktion. Die rasche Einrichtung und hohe Rückgewinnung aus transient transfizierten Säugerzelllinien adressiert diese Barriere und ist ein wirksames Mittel zur Expression von Proteinen, die natürlicherweise durch das ER und Golgi-vermittelte sekretorischen Weg geleitet werden. Hier ist ein Protokoll für die Proteinexpression mit Hilfe der menschlichen HEK293F und HEK293s Zelllinien mit einem Säugetier-Expressionsvektor für hohe Proteinausbeuten entwickelt transfiziert. Die Anwendbarkeit dieses Systems wird gezeigt, unter Verwendung von drei repräsentativen Glycoproteine, die mit Ausbeuten zwischen 95 bis 120 mg gereinigtes Protein gewonnen pro Liter Kultur ausgedrückt. Diese Proteine ​​sind die menschlichen FcγRIIIa und die Ratte α2-6 Sialyltransferase, ST6GalI, beide mit einem N-terminalen GFP-Fusions zum Ausdruck, ebenso wie das unmodifizierte humanen Immunglobulins G1 Fc. Das robuste System utilizes ein serumfreies Medium, das für die Expression von isotopisch angereicherten Proteine ​​und Kohlenhydrate für Strukturuntersuchungen unter Verwendung von Massenspektrometrie und Kernspinresonanzspektroskopie anpassungsfähig ist. Weiterhin kann die Zusammensetzung des N-Glycan durch Zugabe einer kleinen Moleküls an bestimmten Glycans Modifikationen in einer Weise, die Ausbeute nicht verringert verhindern abgestimmt werden.

Einleitung

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Hohe Ausbeuten an in geeigneter Weise gefaltet und posttranslational modifiziert Humanproteinen für die detaillierte Analyse von Struktur und Funktion wie vor eine große Herausforderung. Eine große Anzahl von Expressionssystemen zur Verfügung, die von rekombinanten Proteinen mit nativ-ähnlichen Funktion und Verhalten zu erzeugen. Bakterielle Expressionssysteme, überwiegend Escherichia coli-Stämme, repräsentieren die am leichtesten zugänglichen und am häufigsten verwendeten Werkzeuge in der Forschung Arena, wegen der Einfachheit dieser Expressionssysteme, obwohl Hefe-, Pflanzen-, Insekten- und Säugersystemen werden ebenfalls beschrieben 1-4. Die meisten dieser Systeme sind jedoch nicht in der Lage geeignete posttranslationale Modifikation der Zielproteine. Ein grundlegendes Interesse der Barb und Moremen Labors produziert eukaryotischen Proteinen mit entsprechenden Glykosylierung. Viele menschliche Proteine ​​erfordern entsprechende Glykosylierung für die richtige Funktion (siehe 5).

Der eukaryotischeGlykosylierungsmaschinerie ist umfangreich und der Lage, eine breite Palette von Modifikationen, einschließlich sowohl Asparagin (N) - und Serin / Threonin (O) -verknüpften komplexer Glykane 6. Es wird geschätzt, dass> 50% der menschlichen Proteine ​​sind N-glycosyliert. 7 Glykane sind wesentliche Bestandteile von vielen Proteinen, einschließlich therapeutischer monoklonaler Antikörper, Erythropoietin und Blutgerinnungsfaktoren, wie Faktor IX, um einige zu nennen. Obwohl mehrere Methoden existieren, um in geeigneter Weise N-glycosylierte Proteine ​​vorzubereiten und reichen von rein synthetischen 8-10, um Chemoenzymatische 11-14 oder Erholung von gentechnisch rekombinanten Systemen 15-20, nicht überraschend, menschliche Expressionssysteme sind bisher bewährt die robusteste zu sein Verfahren zur Erzeugung von menschlichen Proteinen.

Viele therapeutische Human Glykoproteine ​​in rekombinanten Systemen, die Säugetierzellen produziert. Systeme Bemerkenswert sind die Chinese Hamster Ovary (CHO), Maus-Myelom (NS0), Baby-Hamster Niereny (BHK), menschliche embryonale Nieren (HEK-293) und die menschliche Netzhaut-Zelllinien, die in der Haftung oder Suspensionskultur für die Proteinproduktion 4,21,22 eingesetzt werden. Allerdings haben Säugerproteinexpressionssysteme die Erzeugung von stabilen Zelllinien, teure Nährmedien und Substrat unterstützte Transfektion Verfahren 23 erforderlich.

Säugerzelle Transfektion wird mit Hilfe einer Vielzahl von Mitteln, einschließlich Kalziumphosphate 24,25, kationische Polymere (DEAE-Dextran, Polybren, Polylysin, Polyethylimin (PEI)) oder positiv geladene kationische Liposomen 26-29 erreicht. PEI ist ein polykationisches, geladene, lineares oder verzweigtes Polymer (25 kDa) 26, die einen stabilen Komplex bildet mit DNA und wird durch Endozytose. Beim Ansäuern des Endosoms wird PEI gedacht zu quellen, was zu dem Bruch der Endosomen und Freisetzung der DNA ins Zytoplasma 26,30.

Bis vor kurzem war die transiente Transfektion in Sperre wiederauf Kultur wurde durch vorherigen DNA / PEI-Komplexbildung, gefolgt von der Zugabe zu der Zellkultur 29 durchgeführt. Allerdings Würm und Mitarbeiter berichteten über eine hocheffiziente Protokoll für die Produktion rekombinanter Proteine ​​in HEK293-Zellen, die eine DNA / PEI-Komplex in situ gebildet 31,32 optimiert. Dies vermieden Herstellung, Sterilisation der Anlage und Pufferaustausch in einem Kulturmedium. Weitere Optimierung, indem die Expression steigernde Plasmiden führte zu deutlichen Ertragssteigerungen 33. Hierin ist eine Methode, die auf diesen Fortschritten baut und ist breit anwendbar. Expressionsbedingungen können ebenfalls verändert werden, um das N-Glycan-Zusammensetzung auswirken.

Die HEK293s Zelllinie mit einem Gen-Deletion, das N-Glycan Verarbeitung stoppt in einer Zwischenstufe, zur Expression von Proteinen mit einheitlichen N-Glycanen, die aus 2-N-Acetylglucosamin-Reste plus fünf Mannosereste (Man 5 GlcNAc 2) 34, 35. Diese Zellenfehlt das N-Acetylglucosaminyl Transferase I (GntI) Gen, das für nachfolgende N-Glycan Verarbeitungs 36,37 erforderlich. Die Verwendung von Glycosyltransferase-Inhibitoren, einschließlich kifunensine Sialinsäure-Analogen und dem Fucose analogen und 2-Deoxy-2-fluor-Fucose hat ähnliche Wirkungen und Grenzen N-Glycan Verarbeitungs 38-41.

Das Protokoll verwendet die hier berichteten pGEn2 Vektors wie in Figur 1 gezeigt, 42,43, PEI stützten transiente Transfektion in Säugetierzelllinien (HEK293F oder HEK293s Zellen) und die Rückgewinnung von hohen Ausbeuten von geeignet glykosylierte Protein. Das System ist robust und kann von verschiedenen Faktoren, einschließlich Isotopenmarkierung und Glycan Technik für die Herstellung von großen Titern an rekombinante Proteine ​​unterzubringen.

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Protokoll

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Dieses Protokoll ist ausreichend für die Expression entweder HEK293F oder HEK293s Zellen.

1. Zell Establishment

  1. Kultur Inokulation
    Hinweis: Alle Kultur Manipulation Vorgänge in einer Anlage BSL-2 durchgeführt werden und jedes Einzelteil, die in das Biosicherheitswerkbank muss durch Besprühen mit einer 70% Ethanol in Wasser-Lösung sterilisiert werden.
    1. Betrieb des Inkubationsschüttler bei 135 UpM, 80% Feuchte und 8,0% CO 2 und 37 ° C. Schalten "auf" der UV-Lampe der Biosicherheitswerkbank mindestens 1 h vor dem Training. Vorwärmen die versiegelten Medium A und Medium B Flaschen im Wasserbad bei 37 ° C für 1 Stunde.
    2. Sterilisieren 125 ml Erlenmeyerkolben mit einer Wachstums belüftete Kappe, Pipetten, Pipetten und vorgewärmten Medien Flaschen durch Spritzen mit der 70% Ethanol in Wasser-Lösung. Legen Sie diese Dokumente in der Biosicherheitswerkbank. Hinweis: Sterilisieren Sie nur die äußere Kunststoffabdeckung des 125 ml-Erlenmeyer-Kulturflasche und entfernen Sie dann nur, wenn sie is in der Biosicherheitswerkbank.
    3. Für einen 30-ml-Kultur, zurückzutreten 26 ml Medium A und 3 ml Medium B (10% der Gesamtkultur) und Überführung in den 125 ml-Erlenmeyer-Kulturflasche und vorsichtig schütteln (im Folgenden als frisches Kulturmedium bezeichnet).
    4. Transfer eine Ampulle von Zellen, die HEK293F Zellen, bei -80 ° C eingefroren, auf Eis und bewegen sich im Kulturraum. Anmerkung: HEK293F Zellen werden in einer Dichte von 1 x 10 7 Zellen / ml geliefert.
    5. Erwärmen Sie die Durchstechflasche vorsichtig im Wasserbad bei 37 ° C, um die Zellen teilweise auftauen (es dauert etwa eine Minute, und die Zellen nicht vollständig aufgetaut werden). Sterilisieren Sie die außerhalb des Fläschchens mit der 70% Ethanol in Wasser-Lösung und verschieben Sie sie in die Biosicherheitswerkbank.
    6. Unter Verwendung von 1 ml-Pipette, ziehen Sie die Zellsuspension (etwa 0,7 ml) und Transfer in das 125 ml Erlenmeyerkolben mit 29 ml frischem Kulturmedium. Schließen Sie die Abdeckung der Kulturflasche und verschieben Sie sie in die inkubiert Shaker.
  2. Zell Wartung: Überprüfen Zelldichte, Lebensfähigkeit und Zellpassagen
    1. Überprüfen Sie die Zellen Dichte nach 24 Stunden nach dem Auftauen der Kultur mit Hilfe der nachstehenden Protokoll. Anmerkung: Die Zellen werden für 24 h nach dem Auftauen zu wesentlichen Zellen Wachstum und die Lebensfähigkeit von> 80% zu gewährleisten gezüchtet.
    2. Sterilisieren Sie die Kulturflasche mit 70% Ethanol in Wasser-Lösung und verschieben Sie sie in die Biosicherheitswerkbank.
    3. Unter Verwendung einer 1 ml Pipette und Pipetten langsam zurückziehen 100 ul der Suspensionskultur und Transfer in ein steriles 0,5 ml Eppendorf-Röhrchen. Schließen und sobald die Kulturflasche in den Shaker Transfer zurück wie möglich.
    4. Mischen Sie 7,5 ul einer Trypanblau-Lösung mit 7,5 ul der Zellen. Mischen kräftig mit 7,5 ul der Zell / Trypanblau Gemischs und überträgt es auf das Zählen Rutsche.
    5. Aktivieren Sie die automatische Zellzähler und legen Sie das Zählen Rutsche in den Laderaum. Die Auto-Leser wird aktiviert und die Zellen werden automatisch in den Einheiten gezähltder Anzahl der Zellen pro ml und prozentuale Lebensfähigkeit
    6. Bestimmen das Volumen des für die Übertragung in ein frisches Kulturmedium in den Zellen Dichte von 0,3 × 10 6 lebende Zellen / ml benötigt Spenderkultur.
      Hinweis: Sehen Sie eine Beispielrechnung im ergänzenden Materialien.
    7. Wiederholen Sie die Schritte 1.1.2 und 1.1.3 der "1.1 Kultur Impfung" Protokoll über den Materialien für frisches Kulturmedium erforderlich vorzubereiten.
    8. Übertragungsmedium A (23 ml) und Medium B (3 ml) zu einer frischen 125 ml Kulturflasche. Entfernen Sie die Vorratsflaschen von Medium A und Medium B von der Biosicherheitswerkbank.
      Hinweis: Die Bestände an Medienflaschen dürfen nicht in der Biosicherheitswerkbank zur gleichen Zeit wie die HEK 293F-Zellen gehalten werden. Dies schränkt die Möglichkeit der Verunreinigung der Lager Medium Flaschen.
    9. Entfernen Sie die HEK293 Zellkultur aus dem Inkubator und Spray mit der 70% Ethanol in Wasser-Lösung. Mit Hilfe einer neuen Pipette herausziehen Aliquot von Zellen (4 ml, dieses Volumen bestimmt wurde, nach to Schritt 1.2.6) aus der Kultur und übertragen sie in den Kolben mit frischem Kulturmedium.
    10. Bringen Sie beide Kulturen aus der Biosicherheitswerkbank in den Inkubator Schüttler Satz nach 1.1.1. Wachsen Zellen auf eine ungefähre Dichte von 2-3 x 10 6 lebende Zellen / ml.
      Anmerkung: Die ungefähre Verdopplungszeit der Zellen 32 h. Es dauert 3-4 Tage, um diese Dichte zu erreichen. Inkubieren der Zellen für 3-4 Durchgänge mit einem stabilen Wachstum Muster von Zellen vor der ersten Transfektion haben.

2. Bereiten Sie Materialien für die Transfektion

  1. Vorbereiten HEK293-Zellen (Tag 1)
    1. Subkultur-Zellen bis zu einer Dichte von 1 x 10 6 Zellen / ml in frisches Medium B 24 h vor der Transfektion gemäß Schritt 1.2.
      Hinweis: das Volumen der Transfektion Kultur hängt von der Anzahl von Zellen sein. Transfektion größeren Mengen (> 20 ml) wird ein größeres Volumen der Kultur in dieser Phase erforderlich.
  2. Vorbereiten Stocks of Materials
    1. Vorbereitung Stammlösung Lineares Polyethylenimin (PEI) mit einer Konzentration von 1 mg / ml in einem Puffer, der 25 mM 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure (HEPES) und 150 mM NaCl (pH 7,5). Löse PEI vollständig; Dies kann 30-60 min bei RT zu nehmen. Sterilisieren durch 0,22 um Spritzenfilter und bei -20 ° C für die langfristige Nutzung.
    2. Bereiten Sie sterile Plasmid-DNA (entsprechend den Schritten 2.2.2.1-2.2.2.4). Die Plasmid-Konstruktionsverfahren wird an anderer Stelle 42 beschrieben. Eine kurze Verfahren zur DNA-Präparation wird hier erklärt:
      1. Wachsen, eine Kultur von chemisch kompetente Escherichia coli-Zellen mit dem Vektor pGEn2 in 1 l LB-Medium (Tryptone- 10 g / l, Hefe Ausschnitt- 5 g / l und Natriumchlorid-10 g / l), ergänzt mit 100 ug / transformierten ml Ampicillin. E. coli bei 37 ° C in einer nicht befeuchteten, Schüttelinkubator gezüchtet.
      2. Reinige den pGEn2 kodierenden Vektor Zielplasmid DNA gemäß der manulers DNA Reinigungsprotokoll.
      3. Um eine vollständige Sterilität der Plasmid-DNA zu gewährleisten, führen Sie die endgültigen Isopropanolfällung und Resuspension Schritte der DNA-Extraktionsverfahren in der Biosicherheitswerkbank.
      4. Fügen Sie das Volumen Isopropanol (im Plasmid Vorbereitung Kit angegeben) auf die eluierte DNA und Zentrifuge bei 10.000 x g für 10 min. Sterilisieren Sie die Außenseite des DNA-Behälter mit 70% Ethanol in Wasser-Lösung und überträgt es in der Biosicherheitswerkbank. Entsorgen Sie die Isopropanol Überstand mit einer Pipette und der Luft trocknen die DNA-Pellet. Einmal trocken, das Pellet in sterilem 10 mM Tris-Puffer, pH 8,0.
    3. Vorbereitung Stammlösung von 220 mM Valproinsäure (VPA) Säure in Wasser und Sterilisieren mittels Durchleiten durch einen sterilen 0,22 um Filter. Bewahren Sie die Lösung bei -20 ° C bis zur weiteren Verwendung.

3. Aufbau einer Transiente Transfektion

  1. Transfektion (Tag 0)
    1. Überprüfen Sie die Zelldichte durch folgende Schritte 1.2.2 bis 1.2.5 "1.2. Cell Wartung" weiter oben. Bestimmung der Anzahl der Zellen für die Transfektion (2,5-3,0 × 10 6 lebende Zellen / ml mit der Lebensfähigkeit> 95%). Hier finden Sie eine Beispielrechnung im ergänzenden Materialien.
    2. Übertragung des Volumens der Suspensionskulturzellen in dem vorherigen Schritt (hier 67 ml) in einen 250 ml-Zentrifugenröhrchen unter Verwendung eines sterilen serologischen Pipette. Sammeln Zellen durch Zentrifugation für 5 min bei 100 x g.
    3. In der Zwischenzeit eine frische Transfektion Kulturmedium nach Schritt 1.1.3 nach "1.1. Kulturinokulation" oben. Siehe die Zusatzmaterialien für ein Rechenbeispiel. Auch Transfer 5 ml frisches Kulturmedium in ein steriles 15 ml-Tube und beiseite stellen.
    4. Übertragungsrohren, die die pelletierten Zellen in die Biosicherheitswerkbank nach Sterilisieren des Außenseite der Rohre mit der 70% Ethanol in Wasser-Lösung und mit einer sterilen Pipette Dekantier-the Stand aus verbrauchten Kulturmedium.
    5. Kräftig Resuspendieren der pelletierten Zellen durch Auf- und Abpipettieren mit 10 ml frischem Kulturmedium und Transfer in den Kolben mit frischem Transfektion Kulturmedium (in Schritt 3.1.3 oben hergestellt). Schrauben Sie die Kappe auf der Zellkulturflasche entlüftet und der Kolben zu bewegen, um den Brutschrank (wie in 1.1.1 festgelegt) für 15 min-1 h mit Schütteln.
    6. Während dieser Zeit verdünnt das Plasmid-DNA und PEI Bestände mit frischem Kulturmedium (mit der 5 ml Volumen aus Schritt 3.1.3 oben zurückgezogen) zu einer Endkonzentration von 0,5 ug / ul. Siehe Beispielrechnungen in ergänzende Materialien, die Menge an DNA und PEI bestimmen. Übertragen Sie die Kulturflasche mit den dispergierten Zellen in der Biosicherheitswerkbank.
    7. In Plasmid-DNA (300 & mgr; l von 0,5 ug / ul) zu der Kultur unter Verwendung von Mikropipette und mischen durch vorsichtiges manuelles Schütteln. In PEI (900 ul 0,5 ug / ul) zu der Kultur, mischen durch vorsichtiges Schütteln. In 3,8 ml frischem culture Medium aus Schritt 3.1.3 vor und Übertragungskolben in den Inkubator Schüttler für 24 Stunden.
    8. Reinigen Sie die Biosicherheitswerkbank gemäß Schritt 1.1.
  2. Verdünnung (Tag 1) (für eine 50 ml Transfektion Volumen)
    1. Inkubieren Sie die transfizierten Kultur für 24 Stunden.
    2. Zurückzuziehen 1 ml vorgewärmten 220 mM Valproinsäure (VPA; gemäß Schritt 2.2.3 vorbereitet.) Mit einer sterilen 1 ml serologische Pipette und übertragen sie in eine sterile 50-ml-Tube.
    3. Zurückzuziehen 5,0 ml vorgewärmtem Medium B und 44 ml vorgewärmtem Medium A und addieren sie zum VPA Lösung mit einer sterilen Pipette in serologischen 50 ml frisches Kulturmedium mit einer Endkonzentration von 4,4 mM VPA vorzubereiten.
    4. Bewegen Sie den transfizierten Kultur in die Biosicherheitswerkbank nach Sterilisieren des Äußeren der Kolben mit 70% Ethanol in Wasser-Lösung, fügen Sie die vorbereiteten Verdünnungsmedium und der Kolben Transfer zurück zum inkubiert Shaker.
  3. Expression und Harvest (Tage 2-6)
    1. Inkubieren Sie die Zellen für weitere 4-5 Tage (5-6 Tage insgesamt seit Transfektion).
    2. Zurückzuziehen Aliquots des Kulturmediums nach Schritt 1.2.2. zu 1.2.5. oben mit einer sterilen 1 ml serologische Pipette, um Zellen Lebensfähigkeit zu überwachen und speichern Aliquots zur Proteinexpression an jedem Tag durch SDS-PAGE analysiert beschriebenen "1.2. Cell Wartung" (siehe Abschnitt 5, unten).
    3. Ernten der Zellen nach 5-6 Tagen durch Zentrifugieren der Zellen plus Medium bei 1000 g für 5 min. Zusätzlich zu ernten den Überstand, wenn die Lebensfähigkeit der Zellen unter 50% (siehe Schritte 1.2.2-1.2.5).
    4. Gießen Sie den Überstand, die sekretiertes Protein enthält. 5 ml einer 10% Bleichmittel auf die HEK Zellpellet und entsorgen Sie als Biohazard.

4. Protein Purification

  1. Vorbereitung einer Säule mit 5 ml Protein-A-Sepharose. Äquilibrieren der Säule mit 5 Säulenvolumina Puffer A (20 mM 3- (N-Morpholino) propansulfonsäure (MOPS), pH 7,4, 100 mM NaCll).
  2. Zentrifugieren des gesammelten Überstandes mit exprimierten Proteins bei hoher Geschwindigkeit (14.000 g für 10 min), um alle verbleibenden Zelltrümmer zu entfernen. Sammeln Sie mit dem Umfüllen in ein frisches Röhrchen. Entsorgen Sie das Pellet als Biohazard.
  3. Sammeln ein 10 ul Aliquot des Überstandes und zusätzlich zu sammeln eine kleine Probe an jedem Proteinreinigungsschritt, um die Probe durch SDS-PAGE analysiert (in Abschnitt 5 beschrieben). Laden Sie das geklärte Überstand und sammeln die Strömung durch.
  4. Die Säule wird mit 3 Säulenvolumina Puffer A und Eluieren des Proteins mit 5 Säulenvolumina von 100 mM Glycin, pH 3,0. Das Eluat wird gesammelt in Röhrchen, die ein halbes Volumen von 1 M Tris-Puffer, pH 8,0, um den pH-Wert rasch zu neutralisieren.
  5. Mit 10 Säulenvolumina Puffer A und Speicher für eine zukünftige Verwendung Die Säule.
  6. Buffer tauschen die eluierte Protein mit mindestens einem 10-fachen Überschuss an Puffer A mit 10 kDa Molekulargewicht cut-off zentrifugalen Filter. Hinweis: die eluierten Probe zu konzentrieren Sie sich nichtein sehr geringes Volumen (<2 ml) in der eluierten Puffers. Verwenden Sie die Schleuderfilter, um den Puffer mit Puffer A austauschen
  7. Speicher gereinigte Protein bei 4 ° C bis zum nächsten Einsatz.
    Achtung: Die Protein im Überstand ausgedrückt können durch Affinitätssäulen auf der Basis der Eigenschaften des Proteins oder die Verwendung von Affinitätsmarkierungen ausgewählt gereinigt werden. Für einen typischen Reinigungsverfahren, Protein-A-Säule kann für IgG oder Fc-Fragmente oder Nickelsäule verwendet werden kann, die für Proteine ​​mit einem Poly-Histidin-Tag exprimiert werden. Hier ist eine Beschreibung der Reinigungsschritte zur IgG1-Fc Verwendung einer Protein A-Säule.

5. Analyse von Protein durch SDS-PAGE

  1. Verdünnt den Aliquoten (7,5 & mgr; l) jeder Probe mit einem gleichen Volumen 2 × Ladepuffer (0,125 M Tris, pH 8,0, 4% SDS, 10% β-Mercaptoethanol, 20% Glycerin und 0,01% Bromphenolblau).
  2. Man kocht die Mischung bei 90 ° C für 5 min mit einem Heizblock oder Wasserbad. Zentrifugieren Sie die Proben bei 10.000 g for 1 min. Laden der vorbereiteten Gels mit 5 ul der Markerprotein und 14 & mgr; l der Proben für die Analyse unter Verwendung einer 20 & mgr; l-Pipette mit einer Einwegspitze.
  3. Führen Sie einen Gel bei 25 Milliampere für 60 min. Sobald die Elektrophorese Schritt abgeschlossen ist, Übertragen des Gels zu einem Behälter mit 1 l Wasser und Mikrowelle für 5 min.
  4. Stain das Gel mit Färbelösung (40% Ethanol, 10% Essigsäure und 0,1% Coomassie Brilliant Blue) für 2 Stunden und destain in Wasser.

6. Glykane massenspektrometrische Analyse

  1. Analysieren Glykane wie zuvor 44 beschrieben. Kurz gesagt, 75 & mgr; g von IgG1-Fc wurde mit Trypsin behandelt, dann mit PNGaseF zur Freisetzung von Glycanen 45 behandelt. Freigabe Glycane wurden permethyliert und durch Verwendung von Matrix-unterstützte Laser-Desorptions-Ionisations-Flugzeit-Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS) analysiert.

7. Protokoll Anpassungen für spezielle Szenarien

  1. Markierung von Proteinen mit 15 N-markierte Aminosäuren (für ein 50 ml Volumen Transfektion)
    1. Verzichtet 5 mg jeder Aminosäure in einer einzigen sterilen Glasphiole. Resuspendieren mit 4 ml autoklaviertem Wasser (beachten Tyr nicht vollständig löslich zu machen, im Gegensatz zu Lys und Phe). Sterilisieren der Lösung durch Autoklavieren bei 121 ° C für 15 min. Die Lösung wird in etwa 50-60 ° C abkühlen.
    2. Für einen 50-ml-Transfektion Volumen, führen Sie Schritt 3.1.3 nach "3.1 Aufbau einer transienten Transfektion". Finden Sie in der ergänzenden Materialien Abschnitt für ein Beispiel mit entsprechenden Volumen.
    3. Für die Transfektion wurden die Schritte von "3. Aufbau einer transienten Transfektion" mit frischem Kulturmedium ersetzt mit markierten Aminosäurereste wie oben hergestellt.
    4. Nach 24 Stunden der Transfektion, am Tag der Kultur Verdünnung zurückzuziehen 5,0 ml vorgewärmtem Medium B, 40 ml vorgewärmtem Medium A und ein frisch autoklaviert 4 ml Aliquot der Aminosäuremischung (wie in Schritt 7.1.1 hergestellt. Oben) und fügen Sie 1ml vorgewärmtem Stammlösung von VPA-Lösung zu 50 ml frischem Verdünnungskulturmediums mit einer Endkonzentration von 4,4 mM VPA vorzubereiten. Fügen Sie dieses Medium zu der Transfektion Kultur mit einer sterilen serologischen Pipette.
    5. Übertragen Sie die transfizierten Kultur in die Biosicherheitswerkbank nach Sterilisieren des Äußeren der Kolben mit 70% Ethanol in Wasser-Lösung, fügen Sie die vorbereiteten Verdünnungsmedium und der Kolben Transfer zurück zum inkubiert Shaker.
      Anmerkung: Medium A ist ein chemisch definierten, serumfreien Medium. Somit ist es möglich, eine andere Formulierung herzustellen. Kontaktieren Sie die Anbieter, um ein eigenes Medium A Vorbereitung, dass bestimmte Aminosäuren fehlt erhalten. Es ist möglich, dass alle Aminosäuren weggelassen, jedoch bevorzugen wir, Medium, das nur wenige ausgewählte Reste fehlt verwenden, da eine vollständige Ausfallmedium würde Verstellung Osmolarität nach Ergänzung erfordern. Wir haben uns für ein Lys-Tyr-Phe-Dropout Medium, ergänzt werden kann und nicht Osmolarität Einstellung. Furthermore das Medium A Lieferant nicht frei zu teilen die Konzentrationen von Mediumkomponenten; verwendeten wir 100 mg / L jeweils für Lys, Tyr und Phe mit Erfolg. Volumina der Transfektion und Expression Medium muss eingestellt werden, um die hinzugefügten Aminosäuren ausmachen. Hier sind die Anpassungen an den Protokoll oben für Isotopenmarkierung
  2. Ergänzen die Transfektion mit ein kleines Molekül
    1. Vorzubereiten 100 mM Stammlösung von 2-Deoxy-2-fluor-L-Fucose unter Verwendung von autoklaviertem Wasser und Sterilisieren dieser Lösung unter Verwendung eines 0,22 um-Filter.
    2. Für einen 50-ml-Kultur, fügen 125 ul (bei 250 & mgr; M) der Fucose analoge Lösung für die Transfektion und Verdünnungsmittel. Hinweis: Es wird unterlassen, eine weitere Volumeneinstellung durchzuführen, da die Zugabe des Substituenten bei dieser Konzentration beträgt nur 0,25% des gesamten Kulturvolumens .Es ist möglich, die Expression unter Verwendung von Kleinmolekül-Inhibitoren der Glycan Verarbeitung modifizieren. Hier werden wir die Bedingungen beschreiben, für die Aufnahme von 2-Desoxy-2-Fluor-L-Fucose, ein Inhibitor der Glycan Fucosylierung. Ergab> 90% ige Reduktion der Fucosylierung durch Addieren des analogen Fucose in einer Konzentration von 250 uM in der Transfektion und Verdünnungsmittel.

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Ergebnisse

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High-Level-Proteinexpression und Reinheit

Diese optimierte Expressionssystem erzeugt eine hohe Ausbeute an glycosylierten Proteinen. Ein typisches Muster der Expression von IgG1-Fc (Figur 1) dargestellt. In diesem Fall, Tag 0 ist der Tag der Transfektion gefolgt von Tag 1 (Verdünnung), und die anschließende Kultivierung Tage bis Tag 5. Die Protein-Expression wird unter Verwendung des löslichen Expressionsfrakt...

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Diskussion

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Dieses Protokoll stellt die Proteinexpression über die transiente Transfektion von HEK293F oder S-Zellen. Die in den Barb und Moremen Labors etabliert optimale Transfektionsbedingungen beschäftigen eine kritische Kombination von Zelldichte und Reagenzienkonzentrationen eine hohe Effizienz der Transfektion zu erreichen. Kritische Überlegungen bei der Durchführung dieses Protokolls sind: die Aufrechterhaltung einer stabilen Kultur vor der Transfektion (mit konsistenten Kultur Verdopplungszeiten); Transfektion von aktiv wa...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle Autoren erklären, dass sie an diesem Manuskript keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde von den Zuschüssen K22AI099165 (AWB), P41GM103390 (KWM) und P01GM107012 (KWM) von den National Institutes of Health, und aus Mitteln des Roy J. Carver Lehrstuhl für Biochemie, Biophysik und Molekularbiologie an der Iowa State University unterstützt . Der Inhalt dieser Arbeit ist allein in der Verantwortung der Autoren und nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des NIH.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Biosicherheitswerkstatt NuAire, Inc.CellGard ES NU-S475-400Klasse II, Typ A2 Biologische Sicherheitswerkbank
InkubationsschüttlerINFORS HTMultitron Cell  
Medium A: FreeStyle Expression Medium Life Technologies12338-018
Medium B: ExCell 293 serumfreies MediumSIGMA14571C 
125 Erlenmeyerkolben mit belüftetemDeckel Corning Incorporated/Life Sciences431143
250 Erlenmeyerkolben mit belüftetem DeckelCorning Incorporated/Life Sciences431144
FreeStyle HEK 293F CellsLife TechnologiesR790-07
1 ml Serologische EinwegpipetteFisher Scietific13-676-10B
10 ml Serologische EinwegpipetteFisher Scietific13-676-10J
25 ml Serologische EinwegpipetteFisher Scietific13-676-10K
Pipette (Pipet-Aid XP)Drummond Scientific161263
Trypan Blue Lösung Thermo Scientific SV30084.01
Zählen von Folien Bio-Rad145-0011
TC20 Automatisierter ZellzählerBio-Rad 145-0102
Polyethylenimin (PEI)Polysciences Inc.23966Stammlösung in einer Konzentration von 1 mg/ml in einem Puffer herstellen, der 25 mM 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethensulfonsäure (HEPES) und 150 mM NaCl (pH 7,5) enthält. PEI vollständig auflösen; sterilisieren durch 0,22 μ; M Spritzenvorsatzfilter und bei -20 °C lagern.
4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES)EMD Chemicals Inc.7365-45-9
25 mm Spritzenvorsatzfilter, 0,22 μ MFisher Scietific09-719A
Trisaminomethan (Tris-Base)Fisher ScietificBP152-1
XL1-BlueStratagene222249
TryptonFisher ScietificBP1421-2
HefeextraktFluka Analytical92144
NatriumchloridBDH-ChemikalienBDH8014
Plasmid-AufreinigungskitQIAGEN12145
Valproic (VPA)SIGMAP4543Stammlösung von 220 mM in Wasser herstellen, durch Durchgang durch einen sterilen 0,22-mm-Filter sterilisieren und bei -20 μg lagern C
ZentrifugeThermo Scientific EW-17707-65
Protein-A-SepharosesäuleSIGMAP9424
Ni-NTA-SuperflowQIAGEN30430
3-(N-Morpholino)propansulfonsäure (MOPS)Fisher ScietificBP308-500
GlycinFisher ScietificBP381-500
10 kDa Molekulargewichts-Cut-off Amicon® Ultra-Zentrifugalfilter MilliporeUFC901096
NatriumdodecylsulfatALDRICHL3771
Beta-MercaptoethanolALDRICHM6250
GlycerinSIGMAG5516
Precision Plus Protein All Blue StandardsBio-Rad161-0373
Essigsäure, Glazial Fisher Scietific64-19-7
coomassie brilliant blue Bio-Rad 161-0406
MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO Applied Biosystems
15N markiertes L-TyrosinALDRICH332151
15N markiertes L-LysinALDRICH592900
Unmarkiertes L-PhenylalaninSIGMA-ALDRICHP2126<
sup>13C6-GlucoseALDRICH389374
2- Desoxy-2-fluor-l-fucose SANTA CRUZ Biotechnologiesc-283123

Referenzen

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Erratum

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Formal Correction: Erratum: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension
Posted by JoVE Editors on 9/08/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension. The Authors section was updated. from:

Ganesh P. Subedi1
Roy W. Johnson2
Heather A. Moniz2
Kelley W. Moremen2
Adam Barb1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

to

Ganesh P. Subedi1
Roy W. Johnson2
Heather A. Moniz2
Kelley W. Moremen2
Adam W. Barb1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

Schlagwörter

HEK293 CellsTransient TransfectionRecombinant Protein ExpressionGlycoprotein PurificationSuspension CultureAffinity PurificationCell Density MonitoringVPA TreatmentProtein Yield AnalysisGlycan Modification

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