Ein Mikrofluidik-Modell bionisch Atem Pulmonary acinar Airways

Zusammenfassung

Softlithographie wurde verwendet, um ein repräsentatives maßstabsgetreues Modell von pulmonalen alveolierten Atemwegen zu erstellen, die sich periodisch ausdehnen und zusammenziehen und physiologische Atembewegungen nachahmen. Diese Plattform bildet respiratorische Azinusströmungen auf einem Chip nach und soll die experimentelle Untersuchung der Dynamik und Ablagerung von inhalativen Aerosolen im Lungenacinus erleichtern.

Zusammenfassung

Quantifizieren Atmungsströmungseigenschaften in den Lungen acinar Tiefen und wie sie beeinflussen inhalierten Aerosoltransport zur Optimierung Medikamenteninhalationstechniken sowie die Vorhersage Ablagerungsmuster von potentiell toxischen Schwebeteilchen in den Lungenalveolen kritisch ist. Hier werden Soft-Lithographietechniken verwendet, um komplexe acinar ähnlichen Atemwegsstrukturen an den truthful anatomischen Längenskalen herzustellen, die physiologischen acinar Strömungsphänomene in einem optisch zugänglichen System reproduzieren. Die Mikrofluidik-Gerät verfügt über fünf Generationen von Waben-Kanäle abzweigen mit periodisch Expansions- und Kontraktions Wände. Wandbetätigung durch Änderung des Drucks im Inneren mit Wasser gefüllten Kammern rund um die dünne PDMS acinar Kanalwände sowohl von den Seiten und der Oberseite der Vorrichtung erreicht. Im Gegensatz zu herkömmlichen Mehrschicht Mikrofluidik-Vorrichtungen, in denen die Stapelung mehrerer PDMS Formen erforderlich ist, ist eine einfache Methode vorgestellt, die oben zur HerstellungKammer durch den Zylinderabschnitt einer Spritze in die PDMS-Form einzubetten. Diese neuartige Mikrofluidik-Setup liefert physiologische Atembewegungen, die wiederum zu charakteristischen acinar Luftströme geben. In der aktuellen Studie, Mikro-Particle Image Velocimetry (μPIV) mit Flüssigkeit suspendierten Teilchen verwendet wurde, so Luft zu quantifizieren Ströme auf Basis von hydrodynamischen Ähnlichkeit Anpassung. Die gute Übereinstimmung zwischen μPIV Ergebnissen verglichen und erwartete acinar Strömungsphänomene deuten darauf hin , dass die mikrofluidische Plattform in naher Zukunft als attraktiven In - vitro - Werkzeug dienen kann direkt der Luft repräsentative Partikel Transport und Ablagerung in den acinar Regionen der Lunge zu untersuchen.

Einleitung

Eine detaillierte Quantifizierung der Atemflussdynamik im distalen, Waben - Regionen der Lunge ist von größter Bedeutung in Richtung Luftdurchmischung in den Lungen acinus Verständnis und das Schicksal von inhalierten Aerosolen in der tiefsten Atemwege ^1-3 vorherzusagen. Dieser letztgenannte Aspekt ist von besonderer Bedeutung , wenn auf der einen Seite die Gefahren von inhalativen Schadstoffpartikel oder umgekehrt bei der Suche nach neuen Strategien für eine verbesserte und gezielte Arzneimittelabgabe von inhalativen Therapie zu lokalisierten Lungenauskultationspunkte ^{4, 5} sowie für die systemische Verabreichung Adressierung.

Mit Computational Fluid Dynamics (CFD) oder alternativ in vitro mit verkleinerten bis experimentellen Modellen folgende hydrodynamischen Ähnlichkeit Anpassung Bisher wurden Atemströme in den tiefen Lungen acinar Regionen typischerweise in silico untersucht. In den letzten Jahrzehnten haben CFD-Methoden wurden zunehmend angewendet acinar Strömungsphänomene zu untersuchen, von single alveolar Modelle ^{6, 7} und Waben - Kanäle ^8-12 aufwändigere in silico Modelle , die Erfassung anatomisch realistischen Strukturen Baum acinar mit mehreren Generationen von Waben - Kanälen und bis zu mehreren hundert einzelnen Alveolen ^13-15.

Gemeinsam haben numerische Anstrengungen entscheidende gewesen Licht auf die Rolle und den Einfluss der Wandbewegung in vergießen während der Atmung Bewegungen auf acinar Luftzirkulationsmuster nachfolgenden. In Abwesenheit von Atembewegung, statische Alveolen Funktion Umwälzströmungen innerhalb ihrer Hohlräume , die keine konvektiven Luftaustausch zwischen dem acinar Kanal aufweisen und die Alveole ^{6, 7;} Mit anderen Worten würde alveolar Ströme vollständig aus Strömungen innerhalb der acinar Bäume isoliert und den Austausch von Luft würde eindeutig aus diffusive Mechanismen führen. Mit der Existenz von zyklischen Erweiterungen des alveolären Domäne sind jedoch alveolar Strömungstopologien drastisch verändert und die resulting Strömungsmuster innerhalb Alveolen sind eng mit dem Standort einer Alveolen entlang der acinar Baum gebunden (z. B. proximal gegen distale Generationen).

Insbesondere hat es sich durch das Verhältnis von alveolärer bei Simulationen, die alveoläre Strömungsmuster angenommen, stark beeinflusst werden Flussraten zu duktalen so dass proximale Generationen des Lungen acinar Baum, wo dieses Verhältnis folgende Massenerhaltung in einer Baumstruktur relativ groß ist, feature komplexe Umlauf fließt in den Alveolen mit irreversiblen Flüssigkeit Bahnlinien. Mit jeder tieferen acinar Generation, nimmt das Verhältnis von alveolärer zu duktalen Flussraten allmählich, so dass distale acinar Generationen mehr Radial wie rationalisiert aufweisen, die von einfachen Inflationen und Deflationen eines Ballons erinnern. Mit den Fortschritten in der modernen Bildgebungsverfahren, Lunge Bilddaten ^{16, 17} von Nagetieren, einschließlich Ratte und Maus, haben zu einigen der ersten CFD Simultan gegebentionen von anatomisch rekonstruiert acinar fließt in rekonstruierten Alveolen. Trotz dieser vielversprechenden Fortschritte sind diese neueren Studien noch begrenzt Luftphänomene in Terminal Alveolarsäckchen zu Adressierung nur ^{18, 19} oder ein paar Alveolen einen einzigen Kanal ²⁰ umgibt. Als Ergebnis, state-of-the-art Untersuchungen der Atemströmungsphänomene in den acinus bleiben Studien dominiert auf generische anatomisch inspirierten Geometrien der acinar Umgebung konzentriert ^2.

Auf der experimentellen Seite, um eine Fluglinie mit einem oder mehreren Alveolen verschiedene Setups wurden im Laufe der Jahre entwickelt , mit ^21-24. Dennoch gibt es keine experimentellen Modellen der Waben Atemwege abzweigen, die durch Ausdehnen und Zusammenziehen physiologischen Atmung der Lage sind, in einer Atemartig von nachahmt. Bei einem Mangel an attraktiven experimentellen Plattformen Seits bleibt das Studium der acinar Transportphänomene begrenzt in Bezug auf validating Computerstudien und kritisch, bleibt ein Mangel an experimentellen Daten zur Verfügung. . In den letzten Jahren, Ma et al (2009) haben eine skalierte-up starren Wandmodell eines acinus aufgebaut , bestehend aus drei acinar Generationen; jedoch begrenzt, der Mangel an Wandbewegung in diesem Modell seine Fähigkeit, realistisch alveolar Strömungsmuster unter Atembedingungen zu erfassen.

Andere skalierte-up - Experimente mit einem sich bewegenden Wandmodell auf anatomischen Daten aus Guss Replik Basis wurden kürzlich ²⁵ eingeführt; Da jedoch nur das Modell die letzten zwei acinar Generationen erfasst (dh., Klemmen sacs), ist es nicht gelungen , die komplexe Umlaufströme zu erfassen , die mehr proximal acinar Generationen charakterisieren. Diese letzteren Beispiele für skalierte-up-Experimente unterstreichen weiter die laufenden Einschränkungen mit solchen Ansätzen. Insbesondere wurde bisher kein existierendes Experiment die Hypothese aufgestellt, Übergang von rezirkulierenden nachgewiesen radial entlang Strömedie acinus und damit numerische Vorhersage von Strömungstopologien bestätigen die Hypothese in realen Lungen acinar Bäume existieren ^{7, 15.} Vielleicht am kritischsten, skaliert-up - Experimente sind extrem begrenzt in passender alle sachdienlichen nicht Partikel Transport und Ablagerung Dynamik ²⁶ aufgrund von Schwierigkeiten inhaliert Investigating -dimensionalen Parameter (z. B. Partikeldiffusion, eine kritische Transportmechanismus für Submikron-Partikel vollständig vernachlässigt).

Mit laufenden experimentellen Herausforderungen, neue experimentelle Plattformen, die Untersuchungen der Atemluftströmungen und Partikeldynamik in komplexen sich bewegenden Wände acinar Netzwerke ermöglichen gesucht. Hier wird eine anatomisch-inspirierten in vitro acinar Modell eingeführt. Diese mikrofluidischen Plattform ahmt Lungen acinar fließt direkt an dem repräsentativen acinar Skala, und erweitert den wachsenden Bereich der pulmonalen mikrofluidischen Modelle ^27, einschließlich bronchiale Flüssigkeit Plug-flows ^28-30 und der alveoläre-Kapillarbarriere ^31.

Das heißt, verfügt die vorliegende Konstruktion eine vereinfachte fünf Generation Waben Atemwegbaums mit zyklisch Ausdehnen und Zusammenziehen Wände, in denen zyklische Bewegungen durch Steuern des Drucks in einer Wasserkammer erreicht werden, die die dünne PDMS Seitenwände umgibt und wo die obere Wand durch ein zusätzliches Wasser verformt wird Kammer direkt über dem acinar Struktur sitzt. Anders als bei herkömmlichen mehrschichtigen mikrofluidischen Vorrichtungen wird diese Kammer durch einfaches Einbetten der Zylinderabschnitt einer Spritze innerhalb des PDMS Vorrichtung gebildet, und erfordert keine Herstellung eines zusätzlichen PDMS-Form.

Der miniaturisierte hier vorgestellte Ansatz bietet eine einfache und vielseitige Mittel für komplizierte acinar Strukturen reproduzieren Wände bewegen, im Vergleich zu skalierte-up-Modelle, während die zugrunde liegenden Eigenschaften des acinar Fließumgebung zu erfassen. Diese Plattform kann für flo verwendet werdenw Visualisierung mit flüssigkeits Schwebeteilchen im Inneren der Atemwege (Repräsentative Ergebnisse siehe unten). In naher Zukunft wird das Modell für die Untersuchung inhaliert acinar Teilchendynamik mit Schwebeteilchen verwendet werden.

Protokoll

1. Master Fabrication

1. Verwenden Deep Reactive Ion Etching (DRIE) eines Silizium - auf - Isolator (SOI) -Wafer ein Master - Silizium - Wafer herzustellen , wie in früheren Arbeiten beschrieben ^{32, 33.}
   HINWEIS: DRIE wird bevorzugt auf Standard SU-8-Mikrobearbeitung aufgrund der hohen Seitenverhältnis Merkmale (40 & mgr; m breit und 90 & mgr; m tiefen Gräben).

2. Gießen und Abdichtung der Mikrofluidik-Vorrichtung

1. Mischungs PDMS und Härter bei einem 10: 1-Gewichtsverhältnis in einem sauberen kleinen Behälter wie beispielsweise einem Kunststoff Wägeschale.
2. Entgasen das Gemisch in einem Exsikkator unter Vakuum, bis alle Luftblasen entfernt werden.
   HINWEIS: Bereiten Sie genügend PDMS für alle folgenden Schritte. Hier unten, die Abkürzung "PDMS" bezieht sich immer auf die entgaste 10: 1 PDMS: Härtermischung, die in den Schritten 2.1 und 2.2 hergestellt.
3. Gießen entgast-Mischung auf eine Höhe von ungefähr 1 mm über dem Master-Wafers. Entgasen erneut für mindestens40 min alle Luftblasen oberhalb des Wafers zu entfernen und um die Blasen unter dem Wafer zu minimieren.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Wafer so nah wie möglich an der Unterseite der Platte. Wenn nötig, drücken Sie die Wafer sanft auf den Boden unter Verwendung von 2 Rühren Sticks und Entgasen wieder.
4. Backen bei 65 ° C für 20 min in einem natürlichen Umluftofen.
   HINWEIS: Nach 20 Minuten das PDMS ausgehärtet ist und fast vollständig ausgehärtet. Während eine längere Backzeit möglich baking wird 20 min Zeit und verbessert die Haftung der zweiten PDMS-Schicht (siehe unten) auf die erste spart.
5. Datei den Zylinderabschnitt aus einem Kunststoff 2 ml Spritze mit einer feinen Körnung Sand Papier Einhaltung PDMS zu verbessern. Darüber hinaus verwenden die Sandpapier die Basis des Spritzenzylinders zu glätten, indem Sie das Sandpapier auf eine ebene Fläche legen und die Basis des Spritzenzylinders oben drauf schieben. Reinigen Sie die Spritze unter Verwendung von Druckluft.
6. Setzen Sie den Trommelabschnitt der Spritze auf der Oberseite der ersten PDMS-Schicht mit der laRGE Öffnung die Oberfläche der PDMS zugewandt ist, und gieße eine zweite Schicht aus PDMS auf der Oberseite der ersten zu einer Höhe von ca. 5 mm und entgasen PDMS nochmals im Exsikkator.
   HINWEIS: Die zweite PDMS-Schicht aus dem kleinen Behälter um den Lauf gegossen werden soll, und in ihm nicht geben sollte.
7. Backen Sie die gesamte Einrichtung bei 65 ° C für mindestens 2 Stunden in einer natürlichen Konvektion Ofen.
   HINWEIS: Es gibt keine Notwendigkeit, den Lauf in die während der Aushärteprozesse zu halten, da das Gewicht der Press PDMS gegen die breite Basis des Laufes an Ort und Stelle fest den Lauf hält.
8. Schneiden durch die PDMS-Form um den gemusterten Bereich des Master-Wafer mit einem Skalpell. Während des Schneidens sollte das Skalpell schwach um die Oberfläche des Wafers zu berühren. Dann legen Sie vorsichtig mit einem dünnen Werkzeug wie Wafer-Pinzette in die Kerbe durch das Skalpell geschaffen, und ziehen Sie die Guss PDMS aus dem Master-Wafer.
9. Legen Sie die Guss auf eine weiche Oberfläche mit Aluminiumfolie bedeckt mit der gemusterten Seitenach oben (dh., sollte der Lauf von der Kante des Tisches hängen), und ein Loch in den PDMS an der Kammereinlass und Kanaleinlass stanzen eine 1 mm Biopsie Punch verwenden.
10. Mantel ein sauberer Glasobjektträger mit einer (entgast) 10: 1 PDMS: Härtermischung eine Schleuderbeschichtungsvorrichtung programmiert bei 3000 Upm für 30 sec, und backen> 1 h bei 65 ° C verwendet wird. Dann reinigen Sie die Folie und PDMS gegossen klar Klebeband.
11. Behandeln Sie die Oberfläche der PDMS - Form und PDMS beschichteten Glasobjektträger mit O ₂ Plasma ( zum Beispiel eine Hand Corona Anlage verwendet wird ) für 1 min, und drücken Sie dann vorsichtig die Oberflächen zusammen und backen bei 65 ° C über Nacht (O / N) .

3. Vorrichtung Abfüll- und Betätigung

1. Mischungs Wasser suspendiert fluoreszierende Polystyrolpartikel mit Wasser und Glycerin in einem Glasfläschchen ein 64/36 (v / v) Glycerin / Wasser-Gemisch mit 0,25% (w / w) Partikel zu erhalten ..
2. Geben Sie einen Tropfen der Glycerinlösung auf der Oberseite des Kanaleinlass und einen Tropfen DI water an der Kammereinlass, legen Sie dann die Vorrichtung in einem Exsikkator und Vakuum für ca. 5 min.
   HINWEIS: Vor dem Vakuum warten, bis die Blasen freisetzt, die zu Pop in den Tropfen von Glycerin-Lösung und DI-Wasser bilden. Bei Vakuum Freisetzung werden die Flüssigkeiten in die Hohlräume im Inneren des Gerätes angesaugt wird. Wenn Restluft innerhalb der Kanäle bleibt, eliminieren sie durch Anwendung äußeren Drucks auf den Flüssigkeiten (z. B. unter Verwendung einer Spritze) und so dass die Luft in die PDMS zu diffundieren.
3. Injizieren ~ 2 ml DI - Wasser in die obere Kammer (dh dem Spritzenzylinder, Fig. 2b) , bis es vollständig mit Wasser gefüllt. Dann decken Sie die obere Kammer mit einer 19 Gauge stumpfen Spritzenspitze, schneiden Sie die Spitze eines anderen stumpfen 19 Gauge-Spritze Spitze und legen Sie diese Spitze an der Seite Kammereinlass. Verbinden Sie die beiden Kanülen zu einer 1 ml Spritze über dünne Teflonschlauch und einem T-förmigen Anschluss.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die 1-ml-Spritze, Teflonschlauch, T-förmige Verbindungs ​​und obere Kammer (2 ml Spritze barrel) sind alle mit Wasser ohne Blasen gefüllt. Dies kann durch das Öffnen Anschlusspunkte erreicht werden, das Wasser durch Leerrohrabschnitten schieben und die Verbindungspunkte wieder anschließen.
4. Schließen Sie die 1 - ml - Spritze mit einem Spritzenpumpe vorprogrammiert zum Beispiel einen ruhigen Tidenatmung Zyklus (mit einer Periode von T = 4 sec) , die aus linearen Rampen zu imitieren, dh von Null bis 1,8 ml / min in 1 sec, von 1,8 ml / min auf -1,8 ml / min in 2 sec und -1,8 ml / min in 1 sec auf Null zurück.

4. Strömungsvisualisierung Experimente: Micro-Partikel Image Velocimetry (μPIV)

1. Während die Vorrichtung betätigt wird, zu erhalten, eine Reihe von 9 bis 12 phasenverriegelt, Doppelrahmenbilder der Teilchen-seeded Strömung unter Verwendung eines Mikro Particle Image Velocimetry (μPIV) System, bestehend beispielsweise aus einem Doppelrahmen-Mehrfachbelichtungs CCD Kamera, ein Doppel gepulsten Nd-YAG - Laser (z. B. 1.600 × 1.200 Pixel eine ausreichende Auflösung zu erzielen) (Wellenlänge: 532 nm, Ausgangsenergie: 400 mJ, Impulsdauer: 4 ns) und ein inverses Mikroskop.
   HINWEIS: Ein solches System ist in der Lage Rahmenpaare mit einer Zeitverzögerung von bis zu einigen Mikrosekunden zwischen den ersten und zweiten Rahmen zu erhalten. Zu phasenverriegelten Doppelrahmenbilder erreichen, ist es sinnvoll , einen Doppelrahmen - Serie bei beispielsweise zu erwerben., 10 Hz (Bildpaare von 0,1 sec voneinander getrennt sind). Dann können die Daten neu geordnet werden , so daß alle Rahmenpaare , die durch eine volle Zykluszeit getrennt sind (hier T = 4 sec) , um eine neue Zeitreihe bilden. Bildaufnahme sollte mehrere Male wiederholt werden , während die Verzögerungszeit zwischen den ersten und zweiten Rahmen in jedem Rahmenpaar Modifizieren (dh., 100 & mgr; sec bis 0,1 sec) für die im Inneren des alveolären Hohlraum unterschiedliche Strömungsbereiche zu lösen.
   Hinweis: an alternativen Einstellungen in Bezug auf die besten Kombinationen von Bildaufnahmesystemen (. Dh Kamera) und Beleuchtungsquellen (dh Laser) zum Bild , wieMikroflüsse sind auch ^{34, 35} zur Verfügung.
2. Verwenden Sie eine Sum-of-Korrelationsalgorithmus verwendet Phasenregelgeschwindigkeit Vektorkarten des resultierenden Strömungsfeld aus der Bildserie für jede Zeitverzögerung zu berechnen. Wiederholen Sie diesen Vorgang mehrmals mit unterschiedlichen Verzögerungszeiten zwischen den ersten und zweiten Rahmen in jedem Rahmenpaar für die Lösung unterschiedliche Strömungsbereiche innerhalb der Alveole. Als nächstes ein Datenanalyseprogramm verwenden , indem Sie im Durchschnitt überlappende Datenpunkte ³³ zusammen , um die einzelnen Strömungskarten zu einem vollständigen und High-detaillierte Karte von Strömungsmuster zu nähen.

Ergebnisse

Computer Aided Design (CAD) und Mikroskopbilder der in - vitro - acinar Plattform sind in Fig. 1. Die biomimetische acinar Modell verfügt über fünf Generationen mit alveolären artigen zylindrischen Hohlräumen (Abb. 1) ausgekleidet rechteckigen Kanäle verzweigen. Hier werden die Modellgenerationen von Generation 1 (für die meisten proximalen Generation) nummeriert zu Generation 5 (für die am weitesten entfernten Generation). Beachten Sie, dass nur der Kanaleinlaß zu Gen...

Diskussion

Ein kritisches Merkmal der mikrofluidischen acinar Plattform hier präsentiert ist seine Fähigkeit, physiologisch realistische Atembewegungen zu reproduzieren, die Anlass geben zu physiologischen Strömungsprofile und Geschwindigkeiten innerhalb acinar Kanäle und innerhalb Alveolen. Da die mikrofluidische Kanäle mit einem relativ niedrigen Seitenverhältnis erzeugt werden (dh., W _d / h ≈ 3,9, wobei w _d die Kanalbreite ist und h die K...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Polydimethylsiloxan (PDMS) und Härter	Dow Corning	(240)4019862	Sylgard® 184 Silikonelastomer Kit
Plastipak 2 ml Spritze	BD	300185
Norm-Ject Luer Slip 1 ml Spritze	Henke Sass Wolf	4010-200V0
1 mm Biopsiestempel	Kai Medical	BP-10F
Labor Corona Treater	Electro-Technic Products	BD-20AC
PHD Ultra Spritzenpumpe	Harvard Apparat	703006
Gefärbte rote wässrige fluoreszierende Partikel	Thermo-Scientific		Uncatalloged 0,86 & Mikro; m Kügelchen wurden verwendet
Glycerin AR	Gadot	830131320
FlowMaster MITAS Mikropartikel-Bildgeschwindigkeit (µ PIV) System	LaVision	1108630