Bioprinting cellularized Konstruiert unter Verwendung eines gewebespezifischen Hydrogel Bioink

Summary

Wir beschreiben eine Reihe von Protokollen , die zusammen stellen eine gewebe nachahmt Hydrogel bioink mit dem funktionelle und tragfähige 3-D Gewebekonstrukte zur Verwendung in in vitro - Screening - Anwendungen bioprinted werden kann.

Abstract

Bioprinting hat sich zu einem vielseitigen Biofabrikationsansatz für die Erstellung von Tissue-Engineering-Organkonstrukten entwickelt. Diese Konstrukte haben das Potenzial, als Organersatz für die Implantation bei Patienten verwendet zu werden, und auch, wenn sie in einem kleineren Maßstab als Modell-"Organoide" erstellt werden, die in In-vitro-Systemen für das Wirkstoff- und Toxikologie-Screening verwendet werden können.

Trotz der Entwicklung einer Vielzahl von Bioprinting-Geräten kann die Anwendung der Bioprinting-Technologie durch die Verfügbarkeit von Materialien eingeschränkt werden, die sowohl Bioprinting-Verfahren beschleunigen als auch die Lebensfähigkeit und Funktion der Zellen unterstützen, indem sie gewebespezifische Hinweise liefern. Hier beschreiben wir ein vielseitiges Hydrogelsystem auf Basis von Hyaluronsäure (HA) und Gelatine, das aus einem 2-stufigen Vernetzungsprotokoll mit mehreren Vernetzern besteht, das gewebespezifische biochemische Signale liefern und die mechanischen Eigenschaften von In-vivo-Geweben nachahmen kann.

Biochemische Faktoren werden durch die Einbeziehung von aus Gewebe gewonnenen extrazellulären Matrixmaterialien, zu denen auch potente Wachstumsfaktoren gehören, bereitgestellt. Die mechanischen Eigenschaften des Gewebes sind kontrollierte Kombinationen von PEG-basierten Vernetzern mit unterschiedlichen Molekulargewichten, Geometrien (linear oder mehrarmig) und funktionellen Gruppen, um extrudierbare Biotinten und endgültige Schersteifigkeitswerte des Konstrukts über einen weiten Bereich (100 Pa bis 20 kPa) zu erhalten. Unter Verwendung dieser Parameter wurden Hydrogel-Biotinten verwendet, um primäre Lebersphäroide in einer leberspezifischen Biotinte zu biodrucken, um in vitro Leberkonstrukte mit hoher Zellviabilität und messbarer funktioneller Albumin- und Harnstoffproduktion zu erzeugen. Diese Methodik bietet einen allgemeinen Rahmen, der für die zukünftige Anpassung von Hydrogelen für die Biofabrikation einer Vielzahl von Gewebekonstrukttypen angepasst werden kann.

Introduction

In den letzten Jahren wurde eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung stehen, die die Notwendigkeit für alternative Quellen von funktionellen Organe und Gewebe durch den Versuch, die Herstellung oder biofabricate Adressen, ihnen. Bioprinting als eines der vielversprechendsten dieser Technologien entstanden. Bioprinting kann als eine Form der Herstellung von biologischen Teilen robotic additive gedacht werden, die verwendet werden zur Erstellung oder Muster tragfähige organartige oder gewebeähnlichen Strukturen in drei Dimensionen. ¹ In den meisten Fällen verwendet Bioprinting eine 3-dimensionale (3 -D) Druckgerät , das von einem Computer gerichtet ist , Ze....

Protocol

1. Hydrogels Bioink Formulierungen und Vorbereitung

1. Um Gewebe-spezifische biochemische Profile zur Verfügung zu stellen, werden die Lösungen gewebespezifische ECM verdauen , wie zuvor für Leber beschrieben. ²⁰
   Hinweis: In der Regel wird diese ECM-Digest 40% des endgültigen Hydrogels bioink Volumen umfassen wird, die verwendet wird. Mehrere Hundert Milliliter ECM digest Lösung kann bei -80 ° C für zukünftige Verwendung hergestellt, aliquotiert und eingefroren werden.
2. Stand der Formulierung Hydrogel lösen einen Photoinitiator, 2-Hydroxy-4 '- (2-hydroxyethoxy) -2-methylpropiophenon, in Wasser bei 0,1% w / v.
   Anmerkung: V....

Results

Wenn die oben beschriebenen Verfahren korrekt befolgt werden, Hydrogele ein biochemisches Profil spezifisch auf die Zielgewebetyp enthalten sollte, damit ²⁰ für einen hohen Grad an Kontrolle über Bioprinting und letzten Elastizitätsmodul, ³⁴ und lebensfähigen funktionellen Zellen in Gewebekonstrukten unterstützen.

Hydrogele Customization
Um am besten imitieren nativen Leber, das Hydr.......

Discussion

Es gibt mehrere Komponenten , die kritisch sind, die bei der 3-D - Gewebekonstrukte zu biofabricate versucht, für eine eventuelle Verwendung beim Menschen oder für in - vitro - Screening - Anwendungen. Unter Verwendung der geeigneten zellulären Komponenten bestimmt das Ende Potential Funktionalität, während die biofabrication Gerät selbst zum Erreichen des Endes Konstrukt die allgemeine Methode bestimmt. Die dritte Komponente, die Biomaterial, ist ebenso wichtig, da es eine Doppelrolle dient. Insbesond.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hyaluronsäure	Sigma	53747
Gelatine	Sigma	G6144
2-Hydroxy-4′-(2-Hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenon	Sigma	410896
Hyaluronsäure und Gelatine Hydrogel Kit (HyStem-HP)	ESI-BIO	GS315	Kit enthält die Bestandteile Heprasil (thiolierte und heparinisierte Hyaluronsäure), Gelin-S (thioliert Gelatine) und Extralink (PEGDA)
PEG 8-Arm Alkin, 10  kDa	Creative PEGWorks	PSB-887
Primäre humane Hepatozyten	Triangle Research Labs	HUCPM6
Primäre menschliche Leber-Sternzellen	ScienCell	5300
Primäre humane Kupffer-Zellen	Life Technologies	HUKCCS
Hepatozyten Basal Media (HBM)	Lonza	CC-3199
Hepatozyten Medien Supplement Kit	Lonza	CC-3198	HCM SingleQuot Kits (enthält Ascorbinsäure, 0,5  Ml; Rinderserumalbumin [fettsäurefrei], 10  Ml; Gentamicinsulfat/Amphotericin B, 0,5  Ml; Hydrocortison 21-Hemisuccinat, 0,5  Ml; Insulin, 0,5  Ml; humaner rekombinanter epidermaler Wachstumsfaktor, 0,5  Ml; Übertragung, 0,5  ml)
Triton X-100	Sigma	T9284	Andere Hersteller sind in Ordnung.
Ammoniumhydroxid	Fischer Scientific	A669	Andere Hersteller sind in Ordnung.
Frisches Schweineleichengewebe	n/a	n/a
Lyophilisierer	beliebig	n/a
Tiefkühlmühle	beliebiger	n/a
Bioprinter	n/a	/a	Der hierin beschriebene Bioprinter wurde im eigenen Haus speziell angefertigt. Im Allgemeinen sind andere Geräte geeignet, sofern sie den computergesteuerten extrusionsbasierten Druck von Hydrogelmaterialien unterstützen.
Hängende Tropfzellkulturplatte	InSphero	CS-06-001	InSphero GravityPlus 3D-Kulturplattform