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Methodenartikel

Bioprinting cellularized Konstruiert unter Verwendung eines gewebespezifischen Hydrogel Bioink

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DOI:

10.3791/53606

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21. April 2016

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1Wake Forest Institute for Regenerative Medicine, Wake Forest Univeristy Health Sciences

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine Reihe von Protokollen , die zusammen stellen eine gewebe nachahmt Hydrogel bioink mit dem funktionelle und tragfähige 3-D Gewebekonstrukte zur Verwendung in in vitro - Screening - Anwendungen bioprinted werden kann.

Zusammenfassung

Bioprinting hat sich zu einem vielseitigen Biofabrikationsansatz für die Erstellung von Tissue-Engineering-Organkonstrukten entwickelt. Diese Konstrukte haben das Potenzial, als Organersatz für die Implantation bei Patienten verwendet zu werden, und auch, wenn sie in einem kleineren Maßstab als Modell-"Organoide" erstellt werden, die in In-vitro-Systemen für das Wirkstoff- und Toxikologie-Screening verwendet werden können.

Trotz der Entwicklung einer Vielzahl von Bioprinting-Geräten kann die Anwendung der Bioprinting-Technologie durch die Verfügbarkeit von Materialien eingeschränkt werden, die sowohl Bioprinting-Verfahren beschleunigen als auch die Lebensfähigkeit und Funktion der Zellen unterstützen, indem sie gewebespezifische Hinweise liefern. Hier beschreiben wir ein vielseitiges Hydrogelsystem auf Basis von Hyaluronsäure (HA) und Gelatine, das aus einem 2-stufigen Vernetzungsprotokoll mit mehreren Vernetzern besteht, das gewebespezifische biochemische Signale liefern und die mechanischen Eigenschaften von In-vivo-Geweben nachahmen kann.

Biochemische Faktoren werden durch die Einbeziehung von aus Gewebe gewonnenen extrazellulären Matrixmaterialien, zu denen auch potente Wachstumsfaktoren gehören, bereitgestellt. Die mechanischen Eigenschaften des Gewebes sind kontrollierte Kombinationen von PEG-basierten Vernetzern mit unterschiedlichen Molekulargewichten, Geometrien (linear oder mehrarmig) und funktionellen Gruppen, um extrudierbare Biotinten und endgültige Schersteifigkeitswerte des Konstrukts über einen weiten Bereich (100 Pa bis 20 kPa) zu erhalten. Unter Verwendung dieser Parameter wurden Hydrogel-Biotinten verwendet, um primäre Lebersphäroide in einer leberspezifischen Biotinte zu biodrucken, um in vitro Leberkonstrukte mit hoher Zellviabilität und messbarer funktioneller Albumin- und Harnstoffproduktion zu erzeugen. Diese Methodik bietet einen allgemeinen Rahmen, der für die zukünftige Anpassung von Hydrogelen für die Biofabrikation einer Vielzahl von Gewebekonstrukttypen angepasst werden kann.

Einleitung

In den letzten Jahren wurde eine Vielzahl von Techniken zur Verfügung stehen, die die Notwendigkeit für alternative Quellen von funktionellen Organe und Gewebe durch den Versuch, die Herstellung oder biofabricate Adressen, ihnen. Bioprinting als eines der vielversprechendsten dieser Technologien entstanden. Bioprinting kann als eine Form der Herstellung von biologischen Teilen robotic additive gedacht werden, die verwendet werden zur Erstellung oder Muster tragfähige organartige oder gewebeähnlichen Strukturen in drei Dimensionen. 1 In den meisten Fällen verwendet Bioprinting eine 3-dimensionale (3 -D) Druckgerät , das von einem Computer gerichtet ist , Zellen und Biomaterialien in genaue Positionen zu deponieren, damit rekapituliert anatomisch imitiert physiologischen Architekturen. 2 Diese Geräte besitzen einen "bioink" drucken, die die Form von Zellaggregaten erfolgen kann, in Hydrogele eingekapselten Zellen oder viskose Flüssigkeiten oder Zell ausgesät Microcarriern sowie zellfreie Polymere, die mechanische Struktur oder als zellfreie pla liefernceholders. 3,4 Nach dem Bioprinting Verfahren kann die resultierende Struktur in funktionelle Gewebe oder Organstrukturen gereift werden, und für die beabsichtigte Endanwendung verwendet. 5,6 Bis heute eine vollständige voll funktionsfähige menschliche Größe Orgel wurde nicht gedruckt, aber es bleibt die primäre langfristige Ziel von Bioprinting Forschung und Entwicklung. 2 jedoch kleine "organoide" Gewebekonstrukte sind derzeit in einer Reihe von Anwendungen implementiert werden, einschließlich der Pathologie Modellierung, Entwicklung von Arzneimitteln und Toxikologie - Screening.

Eine der wichtigsten Hürden, die Forscher bei der Anwendung Bioprinting Technologie begegnet ist, dass nur sehr wenige Materialien für den ausdrücklichen Zweck der Bioprinting entwickelt. Um effektiv in Bioprinting erfolgreich zu sein, muss ein Biomaterial 4 grundlegende Anforderungen erfüllen. Das Biomaterial muss 1) die entsprechenden mechanischen Eigenschaften zu haben Abscheidung zu ermöglichen (es durch eine Düse als Gel Extrusion oder ein inkjet als Tröpfchen), 2) die Fähigkeit, seine Form als Bestandteil eines 3-D-Struktur nach der Abscheidung zu halten, 3) die Fähigkeit zur Benutzersteuerung der 2 vor Eigenschaften, und 4) eine Zelle freundlich und unterstützenden Umgebung überhaupt Phasen des Bioprinting Verfahren. 7 Historisch Bioprinting Arbeit versucht hat , oft bestehenden traditionellen Biomaterialien in Bioprinting Geräte ohne Rücksicht auf ihre Kompatibilität zu verwenden, anstatt ein Biomaterial von der Gestaltung der notwendigen Eigenschaften für Bioprinting und anschließende Post-Druckanwendungen zu haben.

Eine Vielzahl von bioinks wurden vor kurzem eine bessere Schnittstelle mit der Abscheidung und Fertigung Hardware entwickelt. Standard-Hydrogel-Systeme stellen erhebliche Probleme, da sie in der Regel entweder als Vorläufer Fluidlösungen mit unzureichenden mechanischen Eigenschaften bestehen, oder polymerisiert Hydrogele, die auf den Extrusionsprozess Düsen oder werden verstopfen aufgebrochen, wenn gedruckt werden. Unser Team, sowie others wurden verschiedene Hydrogel - Formulierungen untersucht , diese Bioprinting Probleme, einschließlich Zell - Sphäroiden Druck in Hydrogel - Substrate, 5,8 - Zelle und Hydrogel Filamentextrusion von Mikrokapillarröhrchen, 9-11 extrudierbaren Hyaluronsäure (HA) -gold Nanopartikel Hydrogele mit dynamischen Vernetzungseigenschaften zu adressieren 12 zeitliche Steuerung des Hydrogels Steifigkeits photopolymerisierbaren Verwendung methacrylierte HA und Gelatine, 13 Fibrinogen-Thrombin-basierten Vernetzung 14,15 Ionenaustausch Alginat-Kollagengele, 16 und kürzlich schnelle polymerisierenden ultraviolettem Licht (UV) initiierten Vernetzung 17

Diese Beispiele demonstrieren die Durchführbarkeit der Erzeugung von Materialien, die effektiv bioprinted durch kann. Doch neben der Integration mit Hardware, um erfolgreich zu generieren tragfähige und funktionelle 3-D-Gewebekonstrukte müssen Biomaterialien enthalten biochemische und mechanische Signale, dass die Hilfe bei der Aufrechterhaltung der zellulärenLebensfähigkeit und Funktion. Diese zusätzlichen Faktoren, biochemische und mechanische Profile können einen wesentlichen Einfluss auf die erfolgreiche Funktion von bioprinted Gewebekonstrukte.

Beide Zellen und die native extrazelluläre Matrix (ECM) sind verantwortlich für eine Vielzahl von Signalmolekülen, wie beispielsweise Wachstumsfaktoren und anderen Cytokinen auf andere Zellen zu präsentieren. Die Kombination dieser Signale variiert von Gewebe zu Gewebe, kann aber bei der Regulierung der Zell - und Gewebeverhalten extrem potent und einflussreich. 18 gewebsspezifische ECM Komponenten aus verschiedenen Organen und Umsetzung als Hydrogel oder als Teil eines Hydrogels erforscht worden Einsatz mit Erfolg. 19-21 Dieser Ansatz, der von Dezellularisieren einer gegebenen Gewebe besteht, Pulverisieren, und es löst, können gewebespezifische biochemische Signale von jedem Gewebe zu erzeugen , und kann in 3-D - Hydrogel - Konstrukte eingebaut werden. 22 verwendet werden ,

Zusätzlich,es wird allgemein dokumentiert , dass Gewebe in dem Körper eine Vielzahl von Steifigkeiten besetzen. 23 als solche, die Fähigkeit , die mechanischen Eigenschaften von Biomaterialien, wie beispielsweise Elastizitätsmodul E 'oder Scherelastizitätsmodul G', abzustimmen ist ein nützliches Werkzeug in Tissue Engineering . Wie oben beschrieben, ermöglicht die Kontrolle über bioink mechanischen Eigenschaften für die Extrusion basierte biofabrication ein weiches Gel, das durch sekundäre Vernetzung zu einem späteren Zeitpunkt dann weiter manipuliert werden kann, an dem Elastizitätsmodul Niveaus erreicht werden kann, dass die von dem Zielorgan Typ entsprechen. Zum Beispiel könnte Biomaterialien angepasst werden wie eine native Leber eine Steifigkeit von 5-10 kPa entsprechen, 23 oder eine Steifigkeit von 10 bis 15 kPa wie native Herzgewebe entsprechen, 24,25 in der Theorie Erhöhung der Fähigkeit dieser Organoiden funktionieren in eine ähnliche Art und Weise in ihre Heimat Gewebe Pendants. Der Einfluss von Umwelt Steifigkeit auf Zell-Phänotyp wurde explored in den letzten Jahren, insbesondere im Hinblick auf Stammzellen. Engler et al. Zeigten , dass die Substrat - Elastizitätsantriebs mesenchymalen Stammzellen Aided (MSC) in Richtung Abstammungslinien mit Gewebeelastizität der des Substrats übereinstimmt. 25 dieses Konzept weiter zur Differenzierung in Muskel untersucht worden ist, die Herzfunktion, Leber Phänotyp, hämatopoetische Stammzellproliferation und Wartung der Stammzell therapeutisches Potential. 24,26-29 ein Hydrogel zu unterschiedlichen Elastizitätsmoduln abzustimmen In der Lage ist ein wichtiges Merkmal eines Biomaterials , das Gewebekonstrukte werden verwendet wird biofabricate. 30

Hier beschreiben wir ein Protokoll, das einen vielseitigen Ansatz in unserem Labor für eine Hydrogel-System zu formulieren, die Extrusions bioprinted werden kann und angepasst auf 1) enthalten, die biochemische Profil eines bestimmten Typs Gewebe und 2) ahmen den Elastizitätsmodul dieser Gewebeart . Durch diese Anforderungen adressieren, wollen wir provide ein Material, das die physikalisch - chemischen und biologischen Eigenschaften von in vivo Gewebe rekapitulieren kann. 31. Das modulare Hydrogel beschrieben Verbundsystem nimmt hier den Vorteil eines Mehrvernetzungs Ansatz extrudierbaren bioinks zu ergeben, und ermöglicht eine Nachvernetzung zu stabilisieren und erhöht die Steifigkeit der Endprodukte eine Reihe von Gewebetypen zu entsprechen. Biochemische Anpassung wird durch die Verwendung gewebespezifischer ECM-Komponenten erfüllt. Als Demonstration, beschäftigen wir eine leberspezifische Vielfalt dieses Hydrogelsystem funktionelle Leber organoiden Konstrukte Bioprint. Das Protokoll beschrieben verwendet eine benutzerdefinierte 3-D Bioprinting Gerät. Im Allgemeinen kann dieses Protokoll zu den meisten Extrusionsbasierte Drucker, bestimmte Druckparameter variiert durch den Benutzer für jeden Gerätetyp und erfordern Tests drastisch angepasst werden.

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Protokoll

1. Hydrogels Bioink Formulierungen und Vorbereitung

  1. Um Gewebe-spezifische biochemische Profile zur Verfügung zu stellen, werden die Lösungen gewebespezifische ECM verdauen , wie zuvor für Leber beschrieben. 20
    Hinweis: In der Regel wird diese ECM-Digest 40% des endgültigen Hydrogels bioink Volumen umfassen wird, die verwendet wird. Mehrere Hundert Milliliter ECM digest Lösung kann bei -80 ° C für zukünftige Verwendung hergestellt, aliquotiert und eingefroren werden.
  2. Stand der Formulierung Hydrogel lösen einen Photoinitiator, 2-Hydroxy-4 '- (2-hydroxyethoxy) -2-methylpropiophenon, in Wasser bei 0,1% w / v.
    Anmerkung: Volumes in 50-100 ml Bereich kann vor der Zeit hergestellt werden, und von Licht bei 4 ° C mehrere Monate gelagert abgeschirmt.
  3. Um Hydrogel bioinks bilden, lösen sich zunächst die Basismaterialkomponenten aus der Hyaluronsäure (HA) Hydrogel-Kits im Wasser-Photoinitiator-Lösung.
    1. Man löst den thiolierten HA und thiolierten Gelatine separat in Wasser-photoinitiator Lösung (Schritt 1.2) auf 2% w / v-Lösungen.
    2. Auflösen Polyethylenglykoldiacrylat (PEGDA), der Vernetzer in der Hydrogel-Kits, in Wasser-Photoinitiator-Lösung (Schritt 1.2) eine 8% w / v-Lösung zu machen.
    3. Auflösen Polyethylenglycol (PEG) 8-Arm Alkin (10 kDa MW) in wasserPhotoInitiator-Lösung (Schritt 1.2) eine 8% w / v-Lösung zu machen.
  4. In der Regel bilden Hydrogele das folgende Schema verwenden, obwohl zusätzliche Anpassungen möglich ist.
    1. Kombinieren Sie 4 Teile 2% thiolierten HA, 4 Teile 2% thiolierten Gelatine, 1 Teil Vernetzer 1, 1 Teil Vernetzer 2 mit 8 Teilen Gewebe ECM-Lösung und 2 Teilen Hepatozyten Kulturmedien (HCM) (oder 10 Teile Wasser als allgemeine Nicht-Gewebe -spezifische Hydrogel).
      Hinweis: Weitere unmodifizierten HA oder Gelatine können hinzugefügt werden, die bioink extrudieren mehr reibungslos zu machen. Dies wird nachfolgend beschrieben.
  5. Vortex, um die resultierende Mischung auf hohe (Geschwindigkeit 10 von 10) für 10 Sekunden vor mischen.
  6. Die Verwendung von Hydrogel bioink
    1. Für die Extrusion oder Bioprinting Tests, übertragen der Mischung in eine Spritze oder eine Druckerkassette und lassen es bei 37 ° C spontan für 30 min (Stufe 1 Vernetzung) zu vernetzen.
    2. Für rheologische Messungen, übertragen Sie die Mischung in eine 35 mm Petrischale und lassen Sie es 30 Minuten zu vernetzen.
      Anmerkung: Die Mischung sofort durch Thiol-Acrylat-Bindungsbildung zu vernetzen beginnt, und beginnt in der Viskosität zu erhöhen. Die Mischung sollte auf eine Spritze, Druckkassette, oder Zielstelle innerhalb von 10 min übertragen Verstopfen einer Pipette oder einer Spritze während der Übertragung zu vermeiden.
    3. Wenn sekundäre Vernetzung (Stufe 2) gewünscht wird, bestrahlen , um die Stufe 1-vernetzte Gele mit UV - Licht (365 nm, 18 W / cm 2) mit einem Thiol-Alkin - Polymerisationsreaktion zu initiieren.
      Hinweis: Dauer der Bestrahlung auf der Oberfläche des Materials abhängig ist. Im Allgemeinen wird ein Quadratzentimeter Material erfordert nur 1-2 sec UV-Exposition bei dieser UV-Leistung.

2. Druckerkompatibilitätstests

  1. Vor der Integrationstests mit Bioprinting Geräte, Testextrusionseigenschaften auf dem Labortisch mit einfachen Extrusionstests mit Standardspritzen und kleine Gauge-Nadel Spitzen (20-30 gauge).
    1. Schieben Sie die bioink durch eine Standardspritze zu erreichen glatt extrudierten Filamente aus Hydrogel mit wenigen oder keinen Stößen. Extrudieren von Linien oder einfache Muster genügt Erfolg zu bestimmen.
  2. Für bioprinter Integration, laden bioink Vorbereitungen, indem sie in Druckerpatronen Pipettieren und lassen 30 min für die bioink spontane Stufe 1 Vernetzung innerhalb der Kassette zu unterziehen.
    Hinweis: Volumen der bioink von der speziellen Anwendung abhängig und sollte durch den Benutzer bestimmt werden. Druckerpatronen ähneln oder sein Spritzen können, die mit dem bioprinter Gerät kompatibel sind.
  3. Bewerten Extrusion Kompatibilitätfür Bioprinting durch ein einfaches Muster Drucken des bioink verwenden. Zum Beispiel, drucken Sie ein 7 x 7 mm Muster aus parallelen Linien besteht. Anwendungsdruck (beispielsweise 20 kPa pneumatischer Druck) während der Druckkopf bewegt sich in der XY - Ebene mit einer Geschwindigkeit von etwa 300 mm / min.
    Hinweis: Die Druckkopfdüsendurchmessern von verschiedenen Größen verwendet werden können, aber konische Düsen mit 400-500 um Durchmesser Öffnungen sind optimal für den Druck Sphäroide in der 250-350 um-Bereich.
    1. Wenn die extrudierten Materialien klumpig oder unregelmäßig sind, siehe 2.4 Schritt, oder die Menge an PEGDA reduzieren, um die Stufe 1 vernetzte Material zu erweichen. Richtig vorbereitet bioink Formulierungen extrudieren glatt, in gewünschten Mustern oder Architekturen präzise Abscheidung ermöglicht.
      Hinweis: Die Bioprinting beschriebenen Verfahren Verwendung eines benutzerdefinierten 3-D Bioprinting Gerät im Haus speziell für Gewebe konstruieren Druck 32 Als solche spezifischen Druckparameter dramatisch variieren je nach Gerätetyp und erfordern testin.g durch den Benutzer.
  4. Zur Verbesserung der Extrusionseigenschaften ergänzen unmodifizierte HA und Gelatine zu den bioinks (1,5 mg / ml und 30 mg / ml, jeweils).

3. Validierung von Bioprinting mit primärem Leber Konstrukten

  1. Bereiten Sie 3-D Primärzelle Leber Sphäroiden Tropfen hängen Methoden wie der Zellkomponente 33
    Hinweis: Bioprinting kann ohne Sphäroiden durchgeführt werden, sondern mit einzelnen als auch in den Hydrogel bioinks suspendierten Zellen. Sphäroide werden hier verwendeten Zell-Zell-Wechselwirkungen zu beschleunigen und Funktionalität zu konstruieren. Die Anzahl von Sphäroiden oder Zellen eingesetzt wird, hängt von der spezifischen Anwendung und sollte durch den Benutzer bestimmt werden. Diese Schritte sollten unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden, unter Verwendung von Sterilgut.
    1. Bereiten Sie HCM durch die aufgetauten Inhalte der HCM Ergänzung Komponenten-Kit auf den Hepatozyten-Basalmedium Zugabe (HBM) und Sterilfiltration.
      1. Auftauen Ergänzung Komponenten until Flüssigkeit.
      2. Fügen Sie die Ergänzung Komponenten (Ascorbinsäure, 0,5 ml; Rinderserumalbumin [fettsäurefrei], 10 ml, Gentamicin-Sulfat / Amphotericin B, 0,5 ml; Hydrocortison 21-Hemisuccinat, 0,5 ml; Insulin, 0,5 ml; menschliche Faktor rekombinante epidermale Wachstums 0,5 ml; Transferieren, 0,5 ml) in den 500 ml HBM.
      3. Sterilfilter durch einen 0,45 & mgr; m oder 0,22 & mgr; m Filter eine Flaschenaufsatz-Filter-Einheit oder ein Spritzenspitze Filter.
    2. Bestimmen Sie die Zelldichte von primären humanen Hepatozyten, Kupffer-Zellen und Sternzellen, indem Sie auf einem Hämocytometer gezählt, nachdem jeder Zelltyp "Anweisungen nach Herstelleraufgetaut wurde.
    3. Kombinieren primären humanen Hepatozyten, Kupffer-Zellen und Sternzellen in einem 80:10:10 Verhältnis von Zellzahl in HCM Medien, die auf 37 ° C in einem konischen Rohr erwärmt worden ist.
      Hinweis: Das Volumen der Medien verwendet werden, hängt von der Gesamtzellzahl der spezifisch auf die Anwendung und sollte von th bestimmt werdene Benutzer.
    4. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension für 5 Minuten bei 520 · g bei 20 ° C.
    5. Den Überstand aspirieren, hinter dem Zellpellet zu verlassen.
    6. Resuspendieren des Zellpellets in HCM Medium eine Zellsuspension mit 1.000 Zellen pro 40 ul Medium zu ergeben. Gesamtvolumen ist abhängig von der Anzahl von Sphäroiden hergestellt wird.
    7. Übertragen Sie die Zellsuspension auf 96-Well-Format hängenden Tropfen Platten. In insgesamt rund 1000 Zellen in jede Vertiefung in HCM und halten bei 37 ° C, in 5% CO 2 für 3 Tage , während der mehrzelligen Sphäroiden bilden.
    8. Sammeln Leber Sphäroiden aus dem hängenden Tropfen Platte mit einer Pipette verwenden. Transfer zu einem sterilen 15 ml konischen Röhrchen.
  2. Bioprint Leber Sphäroiden in leberspezifischen Hydrogel bioink
    1. Bereiten Sie eine Formulierung von Leber ECM-haltigen Hydrogel bioink wie in Schritt 1 beschrieben, unter Verwendung von 8% PEGDA und 8% 8-Arm PEG Alkin als Vernetzer. Verwenden Sie diese Kombination für seine Fähigkeit, in resulting in einem Hydrogel Nähe in Scherelastizitätsmodul zu nativen Lebergewebe.
    2. Lassen Sie die Sphäroiden auf den Boden des konischen Rohrs absetzen, in dem sie in Schritt 3.1.7 gelegt wurden. Dies variiert je nach Sphäroid Größe und Dichte, sondern erfolgt in der Regel innerhalb von 1-2 min. Entfernen Sie alle Medien durch vorsichtiges Absaugen oder mit einer Pipette.
    3. Übertragen, um das gewünschte Volumen an frisch hergestellten Hydrogels bioink Lösung des konischen Röhrchen, enthaltend die Sphäroide. Im allgemeinen wird ein geeignetes Volumen von 10% bis 25% größer als das Volumen des 3-D-Konstrukt gedruckt werden. Pipette vorsichtig nach oben und unten die Sphäroiden in dem Hydrogel bioink Lösung zu suspendieren. Transfer zu einem bioprinter Patrone eine Pipette oder serologische Pipette.
    4. Im Inneren der Patrone bioprinter ermöglichen die Lösung der ersten Vernetzungsstufe (thiol-Acrylat-Reaktion) für 30 min zu unterziehen.
      Hinweis: Je nach Größe Sphäroid kann die Patrone müssen langsam gedreht werden oder die Inhalte müssen mit gemischt werdenein sterilen Spatel die Sphäroiden im gesamten bioink während der Phase 1 Vernetzung verteilt zu halten. Dies ist weniger eine Notwendigkeit für bioinks mit suspendierten Zellen hergestellt anstelle von Sphäroiden.
      Hinweis: Nach der Stufe 1 Vernetzung haben die Benutzer ein Betriebsfenster von mehreren Stunden. Es wird jedoch empfohlen, schnell den Bioprinting Prozess auszuführen Lebensfähigkeit der Zellen zu verbessern.
    5. Nach der Stufe 1 Vernetzung verwenden, um eine Bioprinting Vorrichtung gewünschten Hydrogel Strukturen zu schaffen, die primären Leber Sphäroiden (oder andere Zellen) enthält.
      Anmerkung: Diese Technologie stellt ein System für eine breite Vielfalt von Strukturen biofabricating. Parameter wie Gesamtmenge, die Anzahl von Zellen oder Sphäroide, die gedruckte Strukturgeometrie und Substrat, auf dem gedruckt werden Konstrukte sind von den Zielen des Benutzers abhängig.
    6. Nach der Abscheidung in die gewünschte Konfiguration, UV-Licht für 2-4 sec verabreichen, um die sekundären Vernetzungsmechanismus, der Stabilisierung des co einzuleitennstructs und zunehmende Steifigkeit auf das gewünschte Niveau.
      Anmerkung: Die Konzentration von PEG-Alkin, und damit die Gesamt endgültige Vernetzungsdichte steuert in erster Linie die endgültige Konstrukt Steifigkeit.
    7. Wiederholen Sie die Schritte 3.2.4 und 3.2.5, um vielschichtige Konstrukte zu erstellen.

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Ergebnisse

Wenn die oben beschriebenen Verfahren korrekt befolgt werden, Hydrogele ein biochemisches Profil spezifisch auf die Zielgewebetyp enthalten sollte, damit 20 für einen hohen Grad an Kontrolle über Bioprinting und letzten Elastizitätsmodul, 34 und lebensfähigen funktionellen Zellen in Gewebekonstrukten unterstützen.

Hydrogele Customization
Um am besten imitieren nativen Leber, das Hy...

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Diskussion

Es gibt mehrere Komponenten , die kritisch sind, die bei der 3-D - Gewebekonstrukte zu biofabricate versucht, für eine eventuelle Verwendung beim Menschen oder für in - vitro - Screening - Anwendungen. Unter Verwendung der geeigneten zellulären Komponenten bestimmt das Ende Potential Funktionalität, während die biofabrication Gerät selbst zum Erreichen des Endes Konstrukt die allgemeine Methode bestimmt. Die dritte Komponente, die Biomaterial, ist ebenso wichtig, da es eine Doppelrolle dient. Insbesond...

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Offenlegungen

Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Die Autoren danken Finanzierung durch die Defense Threat Reduction Agency (DTRA) unter Space and Naval Warfare Systems Center Pacific (SSC PACIFIC) Vertrag Nr N6601-13-C-2027. Die Veröffentlichung dieses Materials stellt keine Genehmigung durch die Regierung der Ergebnisse und Schlussfolgerungen hier.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
HyaluronsäureSigma53747
GelatineSigmaG6144
2-Hydroxy-4′-(2-Hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenonSigma410896
Hyaluronsäure und Gelatine Hydrogel Kit (HyStem-HP)ESI-BIOGS315Kit enthält die Bestandteile Heprasil (thiolierte und heparinisierte Hyaluronsäure), Gelin-S (thioliert Gelatine) und Extralink (PEGDA)
PEG 8-Arm Alkin, 10  kDaCreative PEGWorksPSB-887
Primäre humane HepatozytenTriangle Research LabsHUCPM6
Primäre menschliche Leber-SternzellenScienCell5300
Primäre humane Kupffer-ZellenLife TechnologiesHUKCCS
Hepatozyten Basal Media (HBM)LonzaCC-3199
Hepatozyten Medien Supplement KitLonzaCC-3198HCM SingleQuot Kits (enthält Ascorbinsäure, 0,5  Ml; Rinderserumalbumin [fettsäurefrei], 10  Ml; Gentamicinsulfat/Amphotericin B, 0,5  Ml; Hydrocortison 21-Hemisuccinat, 0,5  Ml; Insulin, 0,5  Ml; humaner rekombinanter epidermaler Wachstumsfaktor, 0,5  Ml; Übertragung, 0,5  ml)
Triton X-100SigmaT9284Andere Hersteller sind in Ordnung.
AmmoniumhydroxidFischer ScientificA669Andere Hersteller sind in Ordnung.
Frisches Schweineleichengeweben/an/a
Lyophilisiererbeliebign/a
Tiefkühlmühlebeliebigern/a
Bioprintern/a/aDer hierin beschriebene Bioprinter wurde im eigenen Haus speziell angefertigt. Im Allgemeinen sind andere Geräte geeignet, sofern sie den computergesteuerten extrusionsbasierten Druck von Hydrogelmaterialien unterstützen.
Hängende TropfzellkulturplatteInSpheroCS-06-001InSphero GravityPlus 3D-Kulturplattform
n

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