Summary
Vi beskriver et sæt protokoller, som tilsammen giver et væv-efterlignende hydrogel bioink med hvilke funktionelle og levedygtige 3-D vævskonstruktioner kan bioprinted til anvendelse i in vitro-screening applikationer.
Introduction
I de senere år har en række forskellige teknologier bliver tilgængelige, der omhandler behovet for alternative funktionelle organer og væv ved at søge at fremstille, eller biofabricate, dem. Bioprinting har vist sig som en af de mest lovende af disse teknologier. Bioprinting kan opfattes som en form for robot additiv fremstilling af biologiske dele, der kan bruges til at opbygge eller mønster levedygtig organ-lignende eller væv-lignende strukturer i 3 dimensioner. 1 I de fleste tilfælde bioprinting anvender en 3-dimensional (3 -D) udskrivning enhed, der er instrueret af en computer til at deponere celler og biomaterialer i præcise positioner og dermed den gentog anatomisk efterligne fysiologiske arkitekturer. 2 Disse enheder udskrive en "bioink", der kan tage form af celle aggregater, celler indkapslet i hydrogeler eller viskose fluider eller celle-seedede mikrobærere samt cellefrie polymerer, der giver mekaniske struktur eller fungerer som cellefri placeholders. 3,4 Efter bioprinting proces, kan den resulterende struktur modnet i funktionelle væv eller organ strukturer, og anvendes til det tilsigtede endelige ansøgning. 5,6 Til dato, et komplet fuldt funktionelt menneske-størrelse organ ikke er blevet udskrevet, men det er stadig den primære langsigtede mål om bioprinting forskning og udvikling. 2 er dog i mindre målestok "organoide" væv konstruktioner er i øjeblikket ved at blive gennemført i en række applikationer, herunder patologi modellering, udvikling af lægemidler, og toksikologi screening.
En af de vigtigste forhindringer, forskere har været forbundet med anvendelsen bioprinting teknologi er, at meget få materialer er blevet udviklet til det udtrykkelige formål bioprinting. For effektivt at lykkes bioprinting, skal et biomateriale opfylde 4 grundlæggende krav. Den biomateriale skal have 1) de relevante mekaniske egenskaber til at tillade aflejring (det være sig ekstrudering gennem en dyse som en gel eller en inkjet som en dråbe), 2) evnen til at holde sin form som en komponent af en 3-D struktur efter aflejring, 3) evnen til brugerstyring af de 2 tidligere karakteristika, og 4) en celle venlige og støttende miljø overhovedet faser af bioprinting procedure. 7 Historisk, bioprinting arbejde har ofte forsøgt at ansætte de eksisterende traditionelle biomaterialer i bioprinting enheder uden hensyn til deres forenelighed, i stedet for at designe et biomateriale at have de egenskaber, der er nødvendige for bioprinting og efterfølgende post-udskrivning applikationer.
En række bioinks er blevet udviklet for nylig til en bedre grænseflade med aflejring og fabrikation hardware. Standard hydrogel systemer udgør væsentlige problemer, fordi de generelt eksistere som enten forløber flydende løsninger med utilstrækkelige mekaniske egenskaber, eller polymeriserede hydrogeler at hvis udskrevne kan tilstoppe dyserne eller bliver brudt op på ekstruderingsprocessen. Vores team, samt others, har udforsket forskellige hydrogel formuleringer til at løse disse bioprinting problemer, herunder celle klumpformet udskrivning i hydrogel substrater, 5,8 celle og filament hydrogel ekstrudering fra mikrokapillære rør, 9-11 ekstruderbare hyaluronsyre (HA) -guld nanopartikler hydrogeler med dynamiske tværbindingsegenskaberne , 12 tidsmæssige styring hydrogel stivhed under anvendelse fotopolymeriserbar methacryleret HA og gelatine, 13 fibrinogen-thrombin-baseret tværbinding, 14,15 ionbytning alginat-collagen-geler, 16 og for nylig hurtig polymeriserende ultraviolet lys (UV) -initiated tværbinding, 17
Disse eksempler viser muligheden for at generere materialer, der kan ved bioprinted effektivt. Men udover integration med hardware, at kunne generere levedygtige og funktionelle 3-D vævskonstruktioner skal biomaterialer indeholde biokemiske og mekaniske signaler at støtte i at opretholde cellulærlevedygtighed og funktion. Disse yderligere faktorer, biokemiske og mekaniske profiler, kan have en betydelig indflydelse på den vellykkede funktion bioprinted væv konstruktioner.
Både celler og det native ekstracellulære matrix (ECM) er ansvarlige for at præsentere en bred vifte af signalmolekyler såsom vækstfaktorer og andre cytokiner til andre celler. Kombinationen af disse signaler varierer fra væv til væv, men kan være yderst potent og indflydelsesrige i reguleringen celler og væv opførsel. 18 Anvender vævsspecifikke ECM komponenter fra forskellige organer og gennemføre en hydrogel eller som del af en hydrogel er blevet udforsket med succes. 19-21 Denne fremgangsmåde, som består af decellularizing et givet væv, pulverisering det, og opløse den, kan anvendes til fremstilling af vævsspecifikke biokemiske signaler fra enhver væv og kan inkorporeres i 3-D hydrogel konstruktioner. 22
Derudoverdet er almindeligt dokumenteret, at væv i kroppen indtager en lang række stivheder. 23 Som sådan evnen til at tune de mekaniske egenskaber af biomaterialer, såsom elasticitetsmodul E 'eller snitte elasticitetsmodul G', er et nyttigt redskab til vævsmanipulering . Som beskrevet ovenfor, kontrol over bioink mekaniske egenskaber muliggør ekstrudering-baserede biofabrication med en blød gel, som derefter yderligere manipuleret af sekundær tværbinding på et senere tidspunkt, på hvilket elasticitetsmodul niveauer kan opnås, at den svarer til målorganet type. For eksempel kunne biomaterialer tilpasses til at matche en stivhed på 5-10 kPa ligesom en nativ lever, 23 eller matche en stivhed på 10-15 kPa ligesom nativ hjertevæv, 24,25 i teorien øge evnen af disse organoids til at fungere i en måde svarende til deres oprindelige væv modstykker. Indflydelsen af miljømæssige stivhed på celle fænotype har været explored i de senere år, især med hensyn til stamceller. Engler et al. Viste, at substratet elasticitet hjulpet i kørsel mesenkymale stamceller (MSC) i retning slægter med væv elasticitet som matcher det af substratet. 25 Dette koncept er blevet yderligere undersøgt for differentiering til muskel, hjertefunktion, lever fænotype, hæmatopoietisk stamcelleproliferation og vedligeholdelse af stamcelle terapeutisk potentiale. 24,26-29 at kunne tune en hydrogel til forskellige elasticitetsmoduler er et vigtigt træk ved et biomateriale, der skal bruges til at biofabricate vævskonstruktioner. 30
Her beskriver vi en protokol, der repræsenterer en alsidig fremgangsmåde, der anvendes i vores laboratorium til at formulere en hydrogel, der kan ekstrudering bioprinted, og tilpasset for at 1) indeholder den biokemiske profil af en bestemt vævstype og 2) efterligner elasticitetsmodulet af denne vævstype . Ved at tage disse krav, vi sigter mod at provide et materiale, der kan rekapitulere de fysisk-kemiske og biologiske karakteristika af in vivo væv. 31. Det modulære hydrogel sammensat system beskrevet heri udnytter en multi-tværbinding tilgang til opnåelse ekstruderbare bioinks, og tillader en sekundær krydsbinding for at stabilisere og øger stivheden af slutprodukter til at matche en række vævstyper. Biokemisk tilpasning opfyldes ved hjælp af vævsspecifikke ECM komponenter. Som en demonstration, beskæftiger vi en lever-specifik række denne hydrogelsystem at bioprint funktionel lever organoide konstruktioner. Den beskrevne protokol bruger et tilpasset 3-D bioprinting enhed. Generelt kan denne protokol tilpasses til de fleste ekstrudering-baserede printere, specifikke udskrivning parametre varierer voldsomt for hver type enhed og kræver test af brugeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hydrogel Bioink Formuleringer og forberedelse
- For at tilvejebringe vævsspecifikke biokemiske profiler, forberede vævsspecifik ECM fordøje løsninger som tidligere beskrevet for leveren. 20
Bemærk: I almindelighed vil denne ECM fordøjelse omfatte 40% af det endelige hydrogel bioink volumen, som anvendes. Flere hundrede milliliter ECM-fordøjelse opløsning kan fremstilles, alikvoteret og frosset ved -80 ° C til senere brug. - Før hydrogelformuleringen, opløse en fotoinitiator, 2-hydroxy-4 '- (2-hydroxyethoxy) -2-methylpropiophenon, i vand ved 0,1% vægt / volumen.
Bemærk: Mængder i 50-100 ml interval kan tilberedes i forvejen og opbevares afskærmet fra lys ved 4 ° C i flere måneder. - Til dannelse hydrogel bioinks, først opløse basismaterialet komponenter fra hyaluronsyre (HA) hydrogel kits i vandet-fotoinitiator opløsning.
- Opløs thiolerede HA og thioleret gelatine separat i vand-photoinitiator opløsning (trin 1.2) for at gøre 2% vægt / v opløsninger.
- Opløs polyethylenglycoldiacrylat (PEGDA), tværbinderen i hydrogel kits, i vand-fotoinitiator opløsning (trin 1.2) for at gøre en 8% vægt / volumen opløsning.
- Opløs polyethylenglycol (PEG) 8-Arm alkyn (10 kDa MW) i vand-fotoinitiator opløsning (trin 1.2) for at gøre en 8% vægt / volumen opløsning.
- Generelt danner hydrogeler ved anvendelse af følgende skema, selv om yderligere tilpasning er mulig.
- Kombiner 4 dele 2% thiolerede HA, 4 dele 2% thioleret gelatine, 1 del tværbindingsmiddel 1, 1 del tværbindingsmiddel 2 med 8 dele væv ECM løsning og 2 dele hepatocyt dyrkningsmedier (HCM) (eller 10 dele vand som en generisk ikke-væv -specifikke hydrogel).
Bemærk: Yderligere umodificeret HA eller gelatine kan tilføjes for at gøre bioink extrude mere gnidningsløst. Dette er beskrevet nedenfor.
- Kombiner 4 dele 2% thiolerede HA, 4 dele 2% thioleret gelatine, 1 del tværbindingsmiddel 1, 1 del tværbindingsmiddel 2 med 8 dele væv ECM løsning og 2 dele hepatocyt dyrkningsmedier (HCM) (eller 10 dele vand som en generisk ikke-væv -specifikke hydrogel).
- Vortexes resulterende blanding på høj (hastighed 10 ud af 10) i 10 sek til blandes inden brug. </ Li>
- Anvendelse af hydrogel bioink
- Til ekstrudering eller bioprinting testning, overføre blandingen i en sprøjte eller printerpatron og lad det tværbinde spontant i 30 minutter (trin 1 tværbinding) ved 37 ° C.
- For rheologiske målinger, overføre blandingen i en 35 mm petriskål og tillade det at tværbinde i 30 minutter.
Bemærk: Blandingen straks begynder at tværbinde gennem dannelse thiol-acrylat binding og vil begynde at stige i viskositet. Blandingen skal overføres til en sprøjte, blækpatron, eller target placering inden for 10 minutter for at undgå tilstopning af en pipette eller sprøjte under overførsel. - Når der ønskes sekundær krydsbinding (trin 2), bestråle fase 1-tværbundne geler med ultraviolet lys (365 nm, 18 W / cm2) for at indlede en thiol-alkyn polymerisationsreaktionen.
Bemærk: Varigheden af bestrålingen afhænger af overfladearealet af materialet. I almindelighed er en kvadratcentimeter materiale kræver kun 1-2 sek af UV eksponering af denne UV magt.
2. Printer Kompatibilitet Test
- Forud for integration test med bioprinting enheder, test ekstrudering egenskaber på laboratoriet bænken med enkle ekstrudering forsøg med standard sprøjter og små gauge nål tips (20-30 gauge).
- Skub bioink gennem en standard sprøjte for at opnå glat ekstruderede filamenter af hydrogel med få eller ingen stød. Ekstrudering af linier eller enkle mønstre er tilstrækkelig til at bestemme succes.
- For bioprinter integration, indlæse bioink præparater ved pipettering dem i printerpatroner, og lad 30 min for bioink at undergå spontan fase 1 krydsbinding i patronen.
Bemærk: Volumen af bioink afhænger af den specifikke anvendelse og bør bestemmes af brugeren. Printer patroner kan ligne eller være sprøjter, der er kompatible med bioprinter enhed. - Evaluer ekstrudering kompatibilitetfor bioprinting ved at udskrive et simpelt mønster ved hjælp af bioink. For eksempel, udskrive et 7 x 7 mm mønster består af parallelle linier. Påfør tryk (f.eks 20 kPa pneumatisk tryk), mens skrivehovedet bevæger sig i XY-planet ved en hastighed på ca. 300 mm / min.
Bemærk: kan anvendes printhovedets dyser diametre i forskellige størrelser, men koniske dyser med åbninger diameter 400-500 uM er optimale til udskrivning sfæroider i 250-350 um.- Hvis de ekstruderede materialer er klumpet eller uregelmæssig, se trin 2.4, eller reducere mængden af PEGDA at blødgøre fase 1 tværbundet materiale. Ordentligt forberedt bioink formuleringer presse jævnt, gør det muligt præcist aflejring i ønskede mønstre eller arkitekturer.
Bemærk: De bioprinting procedurer beskrevne anvendelse en brugerdefineret 3-D bioprinting apparat beregnet i hus specielt til væv konstruere udskrivning 32 Som sådan specifikke udskrivning parametre varierer dramatisk for hver type enhed og kræver testin.g af brugeren.
- Hvis de ekstruderede materialer er klumpet eller uregelmæssig, se trin 2.4, eller reducere mængden af PEGDA at blødgøre fase 1 tværbundet materiale. Ordentligt forberedt bioink formuleringer presse jævnt, gør det muligt præcist aflejring i ønskede mønstre eller arkitekturer.
- For at forbedre ekstrudering egenskaber, supplere umodificeret HA og gelatine til bioinks (1,5 mg / ml og 30 mg / ml).
3. Validering af Bioprinting med Primary Liver konstruktioner
- Forbered 3-D primær celle lever sfæroider ved at hænge drop metoder som den cellulære komponent 33
Bemærk: Bioprinting kan udføres uden sfæroider, men i stedet med individuelle celler suspenderet i hydrogel bioinks samt. Sphæroider er ansat her for at fremskynde celle-celle-interaktioner og konstruere funktionalitet. Antallet af sfæroider eller celler, som anvendes, afhænger af den specifikke anvendelse og bør bestemmes af brugeren. skal udføres disse trin under sterile betingelser under anvendelse af sterile forsyninger.- Forbered HCM ved at tilføje de optøede indhold af HCM supplement komponent kit til hepatocyt basale medier (HBM) og steril filtrering.
- Optø Tillægget komponenter uninto væske.
- Tilsæt supplement komponenter (ascorbinsyre, 0,5 ml; bovint serumalbumin [fedtsyrefrit], 10 ml; gentamicinsulfat / amphotericin B, 0,5 ml; hydrocortison 21-hemisuccinat, 0,5 ml; insulin, 0,5 ml; human rekombinant epidermal vækstfaktor , 0,5 ml; overførsel, 0,5 ml) til 500 ml HBM.
- Sterilt filter gennem et 0,45 um eller 0,22 um filter ved anvendelse af en flaske-top filterenhed eller en sprøjte dysefilteret.
- Bestem celledensiteten af primære humane hepatocytter, Kupffer-celler og stjerneformige celler ved tælling på et hæmocytometer efter hver celletype er optøet i overensstemmelse med producentens anvisninger.
- Kombiner primære humane hepatocytter, Kupffer-celler og stjerneformede celler i et forhold 80:10:10 af celleantal i HCM medier, der er blevet opvarmet til 37 ° C i et konisk rør.
Bemærk: Mængden af medier, der skal anvendes, afhænger af det samlede celleantal specifikt for anvendelse og bør fastsættes af the brugeren. - Centrifuger cellesuspensionen i 5 minutter ved 520 xg ved 20 ° C.
- Aspirer supernatanten, efterlod cellepelleten.
- Resuspender cellepelleten i HCM medier til opnåelse af en celle suspension indeholdende 1.000 celler pr 40 pi medier. Samlet volumen afhænger af antallet af sfæroider, der produceres.
- Overfør cellesuspensionen til 96-brønds format hængende dråbe plader. Tilføj alt ca. 1.000 celler til hver brønd i HCM og holdes ved 37 ° C, i 5% CO2 i 3 dage, hvorunder flercellede sfæroider danner.
- Saml lever sfæroider fra hængende drop plade ved hjælp af en pipette. Overførsel til en steril 15 ml konisk rør.
- Forbered HCM ved at tilføje de optøede indhold af HCM supplement komponent kit til hepatocyt basale medier (HBM) og steril filtrering.
- Bioprint lever sfæroider i lever-specifikke hydrogel bioink
- Forbered en formulering af lever ECM-hydrogel bioink som beskrevet i trin 1, beskæftiger 8% PEGDA og 8% 8-Arm PEG alkyn som tværbindere. Brug denne kombination til sin evne i resulting i en hydrogel tæt ved forskydning elasticitetsmodul til nativt levervæv.
- Lad sfæroiderne sedimentere til bunden af den koniske rør, hvori de blev placeret i trin 3.1.7. Dette varierer baseret på klumpformet størrelse og tæthed, men generelt sker inden 1-2 min. Fjern alle medier ved forsigtigt at aspirere eller med en pipette.
- Overfør det ønskede volumen af frisk fremstillet hydrogel bioink løsning på det koniske rør indeholdende sfæroiderne. Generelt et passende volumen er 10% -25% større end volumenet af den 3-D-konstruktionen, der skal udskrives. omhyggelig pipettering op og ned for at resuspendere sfæroiderne i hydrogel bioink opløsning. Overførsel til en bioprinter patron ved hjælp af en pipette eller serologisk pipette.
- Inde i bioprinter patron, lad opløsningen gennemgå den første tværbinding etape (thiol-acrylat reaktion) i 30 min.
Bemærk: Afhængigt af sfæroide størrelse, kan patronen skal være langsomt roteret eller indholdet kan være nødvendigt at blive blandet meden steril spatel til at holde sfæroiderne fordelt over hele bioink i den fase 1 tværbinding. Dette er mindre af en nødvendighed for bioinks fremstillet med suspenderede celler i stedet for sfæroider.
Bemærk: Efter trin 1 tværbinding, brugerne har en arbejdstemperatur vindue på adskillige timer. Det anbefales dog, at udføre bioprinting proces hurtigt at forbedre cellernes levedygtighed. - Efter fase 1 krydsbinding, bruge en bioprinting enhed til at skabe de ønskede hydrogel strukturer, der indeholder de primære lever sfæroiderne (eller andre celler).
Bemærk: Denne teknologi tilvejebringer et system til biofabricating en lang række strukturer. Parametre som samlede volumen, antal celler eller sfæroider, den trykte struktur geometri, og substrat, som konstruktioner er trykt er meget afhængige af målene for brugeren. - Efter aflejring i den ønskede konfiguration, administrere UV-lys i 2-4 sek at indlede den sekundære krydsbinding mekanisme, stabiliserings- constructs og øget stivhed til det ønskede niveau.
Bemærk: Koncentrationen af PEG-alkyn, og dermed den samlede endelige tværbindingsdensitet, primært styrer den endelige konstruktion stivhed. - Gentag trin 3.2.4 og 3.2.5 for at skabe flere lag konstruktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når de ovenfor beskrevne procedurer følges korrekt, bør hydrogeler indeholde en biokemisk profil specifikt til målet vævstype, 20 giver mulighed for en høj grad af kontrol over bioprinting og endelig elasticitetsmodul, 34 og understøtte levedygtige funktionelle celler i vævskonstruktioner.
hydrogel Tilpasning
For bedst efterligner native leveren blev hydrogel bioink suppleret med lever- ECM løsninger og en vækstfaktor Array, 20 ECM opløsninger indeholder en bred vifte af vækstfaktorer og cytokiner (vist i pg / ml, figur 1a). Disse omfatter hjerneafledt neurotrofisk faktor (BDNF), bFGF, knoglemorfogenetisk protein 5 (BMP-5), FGF-4, insulin-lignende vækstfaktor bindende protein 2 (IGFBP-2), TGF-b1, BMP-7, EGF , FGF-7, væksthormon (GH), heparinbindende EGF-lignende vækstfaktor (HB-EGF), HGF og neurotrophin 3 (NT-3). Derudover ECM opløsninger indeholder yderligere strukturelle bestanddele, som analyseres ved kolorimetriske assays. 20 For liver ECM løsninger, samlet indhold af leverenzymer ECM løsninger collagen var 91,33 ± 0,58 mg / ml, den elastinindhold var 189,33 ± 48,40 mg / ml, og indhold glycosaminoglycan (GAG) var 86,00 ± 53,45 mg / ml (figur 1b).
Hydrogel bioink mekaniske egenskaber kan karakteriseres ved anvendelse af en forskydningsspænding sweep-test (0,6-10 Pa, oscillationsfrekvens 1 Hz) på rheometer. 10,12,13,34 Ved at tillade spontan fase 1 thiol-acrylat kemi at forekomme ved neutral pH, en blød hydrogel med en G 'af 113,66 ± 22,59 Pa dannes. Efter påbegyndelse af fase 2 thiol-alkyn krydsbinding ved UV fotopolymerisation, G 'stiger til ca. 10 kPa (10.637 ± 113,83 Pa, Figure 1C), efterligner levervæv elasticitet. Yderligere manipulation af koncentrationerne, molekylvægte og geometrier af tværbindere kan opnå en lang række trin 2 G'værdier. 34
Kvaliteten af bioprinted hydrogel
Kemisk strategi og implementering af fase 1 og fase 2 krydsbinding af hydrogel bioinks er beskrevet i figur 2. Generelt tværbindere såsom Extralink, som er baseret på acrylerede PEG-polymerer, spontant reagerer med thiolgrupper på HA og gelatine kæder ved neutral pH (fase 1) i tilstedeværelse af celler til at danne en blød ekstruderbart hydrogel. Denne bløde hydrogel kan bioprinted som bioink, hvorefter UV lys anvendes til at initiere fotopolymerisation af uomsatte thioler og de sekundære tværbindere baseret på alkyn-modificerede PEG-polymerer. De særlige molekylvægte og geometrier af tværbindere gårVern enden stivheden af bioprinted konstrukt. En 7 x 7 mm mønster blev implementeret for testformål (figur 3A). Indledende tests viste, at de indledende formuleringer var ekstruderbare, men optrådte uregelmæssige og sammenklumpet under og efter ekstrudering (figur 3B). For at forbedre ekstrudering egenskaber, var umodificeret HA og gelatine suppleret til bioinks (1,5 mg / ml og 30 mg / ml). Den forbedrede glat trykte struktur er vist i figur 3C.
Levedygtighed og grundlæggende funktion bioprinted primære humane lever konstruktioner
Brug af 3-D bioprinter det bioaktive leverspecifik hydrogel bioink blev anvendt til at indkapsle og deponere primære humane lever sfæroider, tidligere fremstillede ved hængende dråbe kulturer, på plast dækglas. Udskrift plast dækglas tilladt for robust håndtering og overførsel til en række af cellekultur miljøer. Efter bioprinting, high cellelevedygtighed i leveren konstruktionerne blev observeret efter LIVE / DEAD levedygtighed / cytotoksicitet farvning og konfokal mikroskopi (figur 4A). Under optimale miljøforhold levedygtighed skal være over 85%. Primære humane hepatocytter anses generelt følsomme over for mekaniske og kemiske belastninger, der krævede en vis optimering af miljømæssige variabler.
Efter bioprinting og verifikation af levedygtighed, kan yderligere leveren konstruktioner, der er placeret i kultur vurderes for funktionalitet ved at analysere medier alikvoter fjernet på dag 3, dag 7, dag 10 og dag 14 til analyse af secerneret urinstof og albumin. Urinstoffet kolorimetrisk assays afslører en relativt ensartet urinstof sekretion fra leveren konstruktionerne over 14 dages tidsforløb, resterende mellem 15 og 20 ng / ml (figur 4B). Detekterede ureaniveauerne var ikke signifikant forskellige fra hinanden på forskellige tidspunkterpoint. The Human Albumin ELISA-assay afslører, at albumin produktion fra konstruktionerne også stadig relativt konsistent over tid, resterende stabilt mellem 125 og 140 ng / ml (figur 4C). Derudover, når farvet for markører indikative for levervæv, positiv ekspression af intracellulær albumin, CYP3A4 (et cytochrom P450-isoform involveret på stofskiftet), E-cadherin (et epitelcelle-celleadhæsion-protein), og dipeptidylpeptidase-4 (et protein udtrykt højt i leveren) er observeret (figur 4D-F). Tilsammen har dette levedygtighed og funktionelle data tyder på, at vævsspecifikke hydrogel bioink hjælpemidler i at bevare levedygtighed og funktion af bioprinted primære cellebaserede lever konstruktioner.
Figur 1. Hydrogel komponent karakterisering og stivhed vurdering. A) Vækstfaktor ogcytokin analyse af proteomics arrays for ECM-løsninger fremstillet af leveren. B) Kolorimetrisk assay kvantificering af kollagen, glycosaminoglycan og elastin indhold i lever ECM-løsninger. C) Demonstration af evnen til at styre bioink stivhed. Efter trin 1 tværbinding gelen er relativt blødt og i stand til at blive ekstruderet glat. Efter fase 2 krydsbinding af UV-lys, elasticitetsmodul stiger med mere end en størrelsesorden, efterligner levervæv elasticitetsmodul. Fejl søjler indikerer standardafvigelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Anvender flere PEG-baserede tværbindingsmidler til ekstrudering bioprinting og kontrol over væv konstruere mekaniske egenskaber. STRATEGI af formulering af printbare bioinks bestående af acrylat-baserede tværbindingsmidler (tværbinder 1), alkyn-baserede tværbindingsmidler (tværbinder 2), thioleret HA, thioleret gelatine, væv ECM materialer, og umodificeret HA og gelatine. Den bioink formulering fremstilles og spontant tværbinder via thiol-acrylat binding, hvilket resulterer i en blød, ekstruderbart materiale. Bioprinting udføres. Endelig er de bioprinted lag kondenseret, stabiliseret, og bragt til leveren elasticitetsmodul. Denne proces kan gentages for at generere flere lag strukturer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Bioprinting afprøvning af bioinks. A) A 7 x 7 mm snoede mønster blev anvendt til bioink ekstruderingstesting i bioprinter. B) Den oprindelige formulering af en PEGDA og 8-arm PEG alkyn bioink resulterede i uregelmæssig aflejring. C) Tilføjelse rå HA og gelatine forbedret ekstrudering, hvilket resulterer i glat ekstrudering af bioink. Målestok -. 1 mm Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Demonstration af levedygtighed og funktion af leveren sfæroider bioprinted i leveren-specifikke hydrogel bioink. A) Gennemførelse af leveren bioink for bioprinting, resulterede i høje rentabilitet konstruktioner. Green - calcein AM-farvede levedygtige celler; Rød - ethidiumhomodimer-farvede døde celler B) Urinstof og C) albumin udskilles af leveren konstruktioner over 14 d.ays i kultur, kvantificeret ved kolorimetriske og ELISA assays, hhv. Fejlsøjler indikerer standardafvigelse. Immunfarvning af markører associeret med levervæv: D) CYP3A4, E) Intracellulær albumin, og F) DPP4 og E-cadherin. Grøn eller rød - angivet plet; Blå -. DAPI Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er flere, der er afgørende at overveje, når de forsøger at biofabricate 3-D væv konstruktioner, til eventuel brug i mennesker eller til in vitro-screening applikationer. Man anvender den passende cellulære bestanddele afgør ende potentielle funktionalitet, mens biofabrication selve enheden bestemmer den generelle metode til at nå enden konstruktionen. Den tredje komponent, er biomateriale, er lige så vigtigt, da det tjener dobbelte roller. Konkret skal biomateriale komponent være forenelig med både biofabrication hardware (dvs. bioprinters) og understøtter også de potentielt skrøbelige biologiske celle komponenter. Optimering begge disse krav kan være svært, da bioprintable materialer skal opfylde flere vigtige parametre: 1) besidder den relevante kemiske, mekaniske, og tidsmæssige egenskaber til at lette en effektiv og uhindret trykning; 2) støtte cellelevedygtighed under forberedelse stadier og bioprinTing procedure; 3) og tilvejebringe et gæstfrit miljø, der bedst fremmer cellernes levedygtighed og eventuel vævskonstruktion funktion efter bioprinting. Vi ansætter den modulære hydrogel bioink der er beskrevet i den metode, der er beskrevet her for at opfylde disse krav. Først ved at inkorporere vækstfaktorer, collagener, GAG'er og elastins afledt fra ECM af en bestemt vævstype, kan vi opnå en biokemisk profil, der minder om målvævstypen. For det andet, ved at anvende 2 lignende, men uafhængige tværbindingsreaktioner er vi i stand til at opnå et blødt ekstruderbart materiale, som er kompatibelt med de fleste ekstrudering-baseret, hvilket yderligere kan ændres med det andet tværbindende trin at nå et bestemt materiale elasticitetsmodul, der matcher et mål væv af valg. 34
Den kritiske egenskab ved dette system, der gør den anvendelig er evnen til at understøtte flere kemiske reaktioner, der kan udnyttes til at manipulere polymerization kinetik og mekaniske egenskaber af bioink systemet. Ved at anvende 2 uafhængige reaktionstyper, thiol-acrylat og thiol-alkyn, opnår vi evnen til at udføre en fase 1 thiol-acrylat reaktion, som resulterer i et blødt materiale, der kan ekstruderes gennem en sprøjte eller bioprinting enhed, og en fase 2 thiol -alkyne reaktion, som kun indledes på UV-eksponering i nærvær af en fotoinitiator, som bestemmer elasticitetsmodulet af den endelige bioprinted konstrukt. Disse multiple trin resulterer i en bioprintable materiale. Som sådan for at opnå en stabil bioink der understøtter ekstrudering og efterfølgende elasticitetsmodul tilpasning, vedligeholdelse af disse separate reaktionstyper er vigtig.
Den primære draw til at bruge systemet til biofabrication er dens lethed for tilpasning, hvilket sker gennem enten manipulere enden elasticitetsmodul gennem den sekundære tværbindingsmiddel, eller ved inddragelse af forskellige væv-afledte ECM materialer eller vækstfaktor-cocktails. ECM i væv indeholder en række vækstfaktorer og andre cytokiner, der ofte varierer i overordnede fordeling mellem vævstyper. Vi mener, at disse faktorer er integreret for at opretholde funktionen af visse celletyper, såsom primære humane hepatocytter. Gennemførelsen af dette begreb er tidligere påvist at øge levedygtighed og funktion af primære humane hepatocytter i hepariniserede hyaluronsyre sandwich kulturer. 20 Ved at kombinere heparin kæder i hydrogel med heparin-bindende vækstfaktorer samt andre ECM komponenter fra leveren ECM, kunne vi at præsentere denne lever-specifik biokemisk profil til primære humane hepatocytter, opretholdelse levedygtighed og funktion in vitro i længere tidsrum. Denne fremgangsmåde kan let udvides til andre vævstyper, så forskerne at opnå sammenfatning af disse vævsspecifikke faktorer ved decellularizing og opløseliggørende andre væv.
telt "> Brugere bør være opmærksomme på, at mens basen komponenter i dette bioink systemet er blevet implementeret i bioprinting tidligere, 10,12,17, men i mindre nuancerede, væv specifikke tilgange, samt en række andre regenerativ medicin applikationer, 35- 45 biofabrication er ikke blevet forsøgt for alle vævstyper. som sådan kan der være nogle yderligere udvikling og fejlfinding kræves for at skabe sådanne yderligere vævskonstruktioner. imidlertid kan et modulært system som det her beskrevne udmærket kunne tilpasses. Andre potentielle begrænsninger indbefatter naturlige affiniteter at nogle celletyper kan have mod specifikke biomaterialer. generelt har vi fundet, at hyaluronsyren, gelatine og PEG-baserede basiskomponenter i denne hydrogel systemsupport levedygtige kulturer af en lang række forskellige celletyper, men der kan være nogle typer af celler, der har bedre resultater konstruerede miljøer med forskellige sammensætninger, såsom collagen, som har en iboende fibrøs natur, eller elastin, der i sagens natur mere elastisk. Som sådan vederlag for den optimale materiale for en given vævstype og slutanvendelsen er vigtig, og hydrogel bioink her beskrevne system kan ikke være tilstrækkelig til alle anvendelser. Derudover er det vigtigt at overveje de miljømæssige forhold, hvorunder bioprinting udføres. Under udviklingen af denne protokol, vi omformede fra nær omgivelsestemperatur (stuetemperatur) betingelser ved hjælp bioinks uden celle medier, som fører til dårlig levedygtighed, hvis udarbejdelse og trykning tid også blev trukket ud, til hurtigere protokoller under 37 ° C ved hjælp af bioinks med et medie komponent, som dramatisk forøget cellelevedygtighed.Indtil for nylig var få materialer eller materiale systemer udviklet specielt til at interface med bioprinting systemer. Som et resultat, de fleste materialer er forsimplede, udnytte enten deres biologiske egenskaber til at understøtte celler, eller, deres kompatibilitet med biofabricationhardware. Kun få materialer er optimal i begge riger. Fremgangsmåden beskrevet i denne metode systemet afkobler disse karakteristika for derved at tillade tilpasning af biologisk karakterisering og samtidig lette de mekaniske egenskaber, der er nødvendige til ekstrudering bioprinting. En yderligere forskel i denne hydrogel bioink system er, at det kan efterligne både biokemiske og fysiske parametre for målvæv det bruges til biofabricating. Dette understøtter en imponerende grad af fleksibilitet, så sammenfatning af de biokemiske faktorer af næsten enhver væv, såvel som matcher elasticitetsmodul andet blødt væv. Opmærksomhed til begge disse aspekter af et væv er sjældent blevet udforsket i tandem.
Den modulære beskaffenhed af denne teknologi giver en fleksibilitet, der skal gennemføres i en lang række anvendelser. Evnen til at efterligne forskellige vævstyper tilvejebringer evnen til biofabricate ikke blot lever anvendte konstruktioner som eksempel i dette arbejde, men constructs repræsenterer mange af de andre væv i kroppen. Måske den mest oplagte bred anvendelse ved hjælp af disse parametre er evnen til at matche begge aspekter til et bestemt væv at optimere enden funktionen af industrielt konstruktioner for reelle applikationer såsom implantation eller lægemiddel og toksikologi screening. Mens generation af humane mellemstore væv til implantation i patienter er endemålet for mange forskere, som følge af lovgivningsmæssige forhindringer, celle sourcing, og begrænsninger på evnen til at fremstille funktionelle vaskulatur i manipuleret væv organer, vil dette ophøjede mål kræver yderligere udvikling og tid at blive realiseret. Men teknologier som den metode, der er beskrevet her i øjeblikket ved at blive implementeret for at generere "organoids" for in vitro-platforme. Vores team, såvel som andre, er i øjeblikket udnytter organoide biofabrication at skabe modelsystemer, hvor toksikologiske undersøgelser udføres. Derudover kan sådanne organoids anvendes tilstudere patologier og sygdomsprogression, såsom kræft, 46 og teste potentielle terapeutiske behandlinger. Endelig dette system understøtter også en anden vigtig anvendelse. Ved at manipulere disse parametre uafhængigt, kan forskerne udføre grundlæggende videnskabelige eksperimenter for at bestemme den relative betydning af biokemiske versus mekaniske faktorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne takker finansiering af Defense Threat Reduction Agency (DTRA) under Space og Naval Warfare Systems center Stillehavet (SSC PACIFIC) kontrakt nr N6601-13-C-2027. Offentliggørelsen af dette materiale udgør ikke godkendes af regeringen i de resultater eller konklusioner heri.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hyaluronic acid | Sigma | 53747 | |
| Gelatin | Sigma | G6144 | |
| 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone | Sigma | 410896 | |
| Hyaluronic acid and gelatin hydrogel kit (HyStem-HP) | ESI-BIO | GS315 | Kit contains the components Heprasil (thiolated and heparinized hyaluronic acid), Gelin-S (thiolated gelatin), and Extralink (PEGDA) |
| PEG 8-Arm Alkyne, 10 kDa | Creative PEGWorks | PSB-887 | |
| Primary human hepatocytes | Triangle Research Labs | HUCPM6 | |
| Primary human liver stellate cells | ScienCell | 5300 | |
| Primary human Kupffer cells | Life Technologies | HUKCCS | |
| Hepatocyte Basal Media (HBM) | Lonza | CC-3199 | |
| Hepatocyte Media Supplement Kit | Lonza | CC-3198 | HCM SingleQuot Kits (contains ascorbic acid, 0.5 ml; bovine serum albumin [fatty acid free], 10 ml; gentamicin sulfate/amphotericin B, 0.5 ml; hydrocortisone 21-hemisuccinate, 0.5 ml; insulin, 0.5 ml; human recombinant epidermal growth factor, 0.5 ml; transferring, 0.5 ml) |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | Other manufacturers are ok. |
| Ammonium hydroxide | Fischer Scientific | A669 | Other manufacturers are ok. |
| Fresh porcine cadaver tissue | n/a | n/a | |
| Lyophilizer | any | n/a | |
| Freezer mill | any | n/a | |
| Bioprinter | n/a | n/a | The bioprinter described herein was custom built in-house. In general, other devices are adequate provided they support computer controlled extrusion-based printing of hydrogel materials. |
| Hanging drop cell culture plate | InSphero | CS-06-001 | InSphero GravityPlus 3D Culture Platform |
References
- Visconti, R. P., et al. Towards organ printing: engineering an intra-organ branched vascular tree. Expert Opin Biol Ther. 10, 409-420 (2010).
- Derby, B. Printing and prototyping of tissues and scaffolds. Science. 338, 921-926 (2012).
- Fedorovich, N. E., et al. Hydrogels as extracellular matrices for skeletal tissue engineering: state-of-the-art and novel application in organ printing. Tissue Eng. 13, 1905-1925 (2007).
- Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. R. Organ printing: computer-aided jet-based 3D tissue engineering. Trends Biotechnol. 21, 157-161 (2003).
- Boland, T., Mironov, V., Gutowska, A., Roth, E. A., Markwald, R. R. Cell and organ printing 2: fusion of cell aggregates in three-dimensional gels. Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol. 272, 497-502 (2003).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Drake, C., Markwald, R. R. Organ printing: promises and challenges. Regen Med. 3, 93-103 (2008).
- Skardal, A., Atala, A. Biomaterials for integration with 3-d bioprinting. Ann Biomed Eng. 43, 730-746 (2015).
- Mironov, V., et al. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30, 2164-2174 (2009).
- Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E., Forgacs, G. Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting. Biomaterials. 30, 5910-5917 (2009).
- Skardal, A., Zhang, J., Prestwich, G. D. Bioprinting vessel-like constructs using hyaluronan hydrogels crosslinked with tetrahedral polyethylene glycol tetracrylates. Biomaterials. 31, 6173-6181 (2010).
- Bertassoni, L. E., et al. Direct-write bioprinting of cell-laden methacrylated gelatin hydrogels. Biofabrication. 6, 024105 (2014).
- Skardal, A., Zhang, J., McCoard, L., Oottamasathien, S., Prestwich, G. D. Dynamically crosslinked gold nanoparticle - hyaluronan hydrogels. Adv Mater. 22, 4736-4740 (2010).
- Skardal, A., et al. Photocrosslinkable hyaluronan-gelatin hydrogels for two-step bioprinting. Tissue Eng Part A. 16, 2675-2685 (2010).
- Skardal, A., et al. Bioprinted amniotic fluid-derived stem cells accelerate healing of large skin wounds. Stem Cells Transl Med. 1, 792-802 (2012).
- Xu, T., et al. Hybrid printing of mechanically and biologically improved constructs for cartilage tissue engineering applications. Biofabrication. 5, 015001 (2013).
- Xu, T., et al. Complex heterogeneous tissue constructs containing multiple cell types prepared by inkjet printing technology. Biomaterials. 34, 130-139 (2013).
- Murphy, S. V., Skardal, A., Atala, A. Evaluation of hydrogels for bio-printing applications. J Biomed Mater Res A. 101, 272-284 (2013).
- Badylak, S. F. The extracellular matrix as a biologic scaffold material. Biomaterials. 28, 3587-3593 (2007).
- Freytes, D. O., Tullius, R. S., Valentin, J. E., Stewart-Akers, A. M., Badylak, S. F. Hydrated versus lyophilized forms of porcine extracellular matrix derived from the urinary bladder. J Biomed Mater Res A. 87, 862-872 (2008).
- Skardal, A., et al. Tissue specific synthetic ECM hydrogels for 3-D in vitro maintenance of hepatocyte function. Biomaterials. 33, 4565-4575 (2012).
- Johnson, T. D., Braden, R. L., Christman, K. L. Injectable ECM scaffolds for cardiac repair. Methods Mol Biol. 1181, 109-120 (2014).
- Pati, F., et al. Printing three-dimensional tissue analogues with decellularized extracellular matrix bioink. Nat comm. 5, 3935 (2014).
- Vanderhooft, J. L., Alcoutlabi, M., Magda, J. J., Prestwich, G. D. Rheological properties of cross-linked hyaluronan-gelatin hydrogels for tissue engineering. Macromol Biosci. 9, 20-28 (2009).
- Engler, A. J., et al. Embryonic cardiomyocytes beat best on a matrix with heart-like elasticity: scar-like rigidity inhibits beating. J Cell Sci. 121, 3794-3802 (2008).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Chaudhuri, T., Rehfeldt, F., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Preparation of collagen-coated gels that maximize in vitro myogenesis of stem cells by matching the lateral elasticity of in vivo muscle. Methods Mol Biol. 621, 185-202 (2010).
- Lozoya, O. A., et al. Regulation of hepatic stem/progenitor phenotype by microenvironment stiffness in hydrogel models of the human liver stem cell niche. Biomaterials. 32, 7389-7402 (2011).
- Holst, J., et al. Substrate elasticity provides mechanical signals for the expansion of hemopoietic stem and progenitor cells. Nat Biotechnol. 28, 1123-1128 (2010).
- Skardal, A., Mack, D., Atala, A., Soker, S. Substrate elasticity controls cell proliferation, surface marker expression and motile phenotype in amniotic fluid-derived stem cells. J Mech Behav Biomed Mater. 17, 307-316 (2013).
- Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels. Adv Mater. 27, 1607-1614 (2015).
- Malda, J., et al. 25th anniversary article: Engineering hydrogels for biofabrication. Adv Mater. 25, 5011-5028 (2013).
- Integrated organ and tissue printing methods, system and apparatus. US Patent. Kang, H. W., Lee, S. J., Atala, A., Yoo, J. J. , 2012/00889238 A1 (2011).
- Drewitz, M., et al. Towards automated production and drug sensitivity testing using scaffold-free spherical tumor microtissues. Biotechnol J. 6, 1488-1496 (2011).
- Skardal, A., et al. A hydrogel bioink toolkit for mimicking native tissue biochemical and mechanical properties in bioprinted tissue constructs. Acta Biomater. 25, 24-34 (2015).
- Peattie, R. A., et al. Stimulation of in vivo angiogenesis by cytokine-loaded hyaluronic acid hydrogel implants. Biomaterials. 25, 2789-2798 (2004).
- Flynn, L., Prestwich, G. D., Semple, J. L., Woodhouse, K. A. Adipose tissue engineering with naturally derived scaffolds and adipose-derived stem cells. Biomaterials. 28, 3834-3842 (2007).
- Flynn, L., Prestwich, G. D., Semple, J. L., Woodhouse, K. A. Adipose tissue engineering in vivo with adipose-derived stem cells on naturally derived scaffolds. J Biomed Mater Res A. 89, 929-941 (2009).
- Duflo, S., Thibeault, S. L., Li, W., Shu, X. Z., Prestwich, G. Effect of a synthetic extracellular matrix on vocal fold lamina propria gene expression in early wound healing. Tissue Eng. 12, 3201-3207 (2006).
- Duflo, S., Thibeault, S. L., Li, W., Shu, X. Z., Prestwich, G. D. Vocal fold tissue repair in vivo using a synthetic extracellular matrix. Tissue Eng. 12, 2171-2180 (2006).
- Liu, Y., Shu, X. Z., Prestwich, G. D. Osteochondral defect repair with autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells in an injectable, in situ, cross-linked synthetic extracellular matrix. Tissue Eng. 12, 3405-3416 (2006).
- Liu, Y., et al. Accelerated repair of cortical bone defects using a synthetic extracellular matrix to deliver human demineralized bone matrix. J Orthop Res. 24, 1454-1462 (2006).
- Zhang, J., Skardal, A., Prestwich, G. D. Engineered extracellular matrices with cleavable crosslinkers for cell expansion and easy cell recovery. Biomaterials. 29, 4521-4531 (2008).
- Serban, M. A., Scott, A., Prestwich, G. D. Unit 10.14, Use of hyaluronan-derived hydrogels for three-dimensional cell culture and tumor xenografts. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 10, (2008).
- Xu, X., Prestwich, G. D. Inhibition of tumor growth and angiogenesis by a lysophosphatidic acid antagonist in an engineered three-dimensional lung cancer xenograft model. Cancer. 116, 1739-1750 (2010).
- Liu, Y., Shu, X. Z., Prestwich, G. D. Tumor engineering: orthotopic cancer models in mice using cell-loaded, injectable, cross-linked hyaluronan-derived hydrogels. Tissue Eng. 13, 1091-1101 (2007).
- Skardal, A., Devarasetty, M., Rodman, C., Atala, A., Soker, S. Liver-Tumor Hybrid Organoids for Modeling Tumor Growth and Drug Response In Vitro. Ann Biomed Eng. , (2015).
