Bioprinting cellularized Konstruiert unter Verwendung eines gewebespezifischen Hydrogel Bioink

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, einen vielseitigen Ansatz für die Entwicklung von Hydrogel-Biotinten zu demonstrieren, die durch Bioprinting-Geräte extrudiert werden können. Mit den Biotinten lassen sich dann dreidimensionale Gewebekonstrukte herstellen. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich des Bioprintings zu beantworten, z. B. wie die mechanischen Eigenschaften kontrolliert werden können, die erforderlich sind, um ein Material bereitzustellen, das mit einem Bioprinter extrudiert werden kann.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir kommerziell erhältliche Komponenten verwenden, die modular kombiniert werden, um eine einfache und effektive biodruckbare Hydrogel-Biotinte herzustellen. Zu den Anwendungen dieser Technologien gehört die Erstellung von 3D-Gewebeorganoiden, mit denen die Auswirkungen von Medikamenten, Toxinen und Krankheiten genau modelliert werden können. Obwohl diese Methode einen Rahmen für den Bioprint von 3D-Leberkonstrukten bieten kann, kann sie auch auf andere Gewebetypen wie Muskeln, Lungen und Dickdarm angewendet werden.

Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da es eine Reihe verschiedener Reagenzien gibt, die zur Herstellung der Hydrogel-Biotinte verwendet werden, aber es ist eigentlich ganz einfach. Das Verfahren wird von Young-Joon Seol, einem Postdoc in unserem Team, demonstriert. Bereiten Sie zunächst einen gewebespezifischen extrazellulären Matrixverdau vor, der in der Hydrogelformulierung verwendet werden soll, wie an anderer Stelle beschrieben.

Lösen Sie dann einen Photoinitiator in Wasser mit einem Gewichts-pro-Volumen-Verhältnis von 0,1 % aufUm die Hydrogel-Biotinten zu bilden, lösen Sie zunächst die Grundmaterialkomponenten aus den Hyaluronsäure-Hydrogel-Kits in einzelne Aliquote der Wasser-Photoinitiator-Lösung. Kombinieren Sie dann die EZM-Lösung, die 2%thiolierte Hyaluronsäure, die 2%thiolierte Gelatine, die Vernetzer und die Hepatozyten-Kulturmedien in den hier gezeigten Verhältnissen. Um die Extrusionseigenschaften der Biotinte zu verbessern, fügen Sie der Mischung 1,5 Milligramm pro Milliliter unmodifizierte Hyaluronsäure und 30 Milligramm pro Milliliter Gelatine hinzu.

Wirbeln Sie die resultierende Mischung dann vor der Verwendung zehn Sekunden lang auf hoher Stufe ein. Bevor Sie die Biotinte in einem Bioprinting-Gerät testen, testen Sie zunächst die Extrusionseigenschaften auf dem Labortisch. Lassen Sie mit einer Standardspritze eine Probe der Biotinte fallen und befestigen Sie dann eine 20- bis 30-Gauge-Nadel an der Spritze.

Lassen Sie die Biotinte vernetzen und schieben Sie die Biotinte dann durch die Nadel, um glatt extrudierte Hydrogelfilamente zu erhalten. Wenn die Formulierung in der Lage ist, ein Filament mit wenigen oder keinen Unebenheiten zu erzeugen, ist es bereit für das Bioprinting. Um die Biotintenpräparate in einen Biodrucker zu laden, pipettieren Sie die Biotinten in sterilisierte Druckerpatronen.

Lassen Sie sie vor der Extrusion 30 Minuten ruhen, da die Biotinte in der Patrone eine spontane Vernetzung der ersten Stufe durchläuft. Legen Sie als Nächstes die Patrone in das Drucksetup ein und schließen Sie eine pneumatische Druckquelle an die Patrone an. Bereiten Sie ein einfaches Muster vor, wie dieses sieben mal sieben Millimeter große Raster aus parallelen Linien, um die Extrusionskompatibilität zu bewerten.

Während sich der Druckkopf mit einer Geschwindigkeit von etwa 300 Millimetern pro Minute in der XY-Ebene bewegt, üben Sie einen Druck von 20 Kilopascal auf die Patrone aus, um die Biotinte zu extrudieren. Wenn die extrudierten Materialien klumpig oder unregelmäßig sind, reduzieren Sie die Menge des zugesetzten Vernetzers, um das vernetzte Material der ersten Stufe weicher zu machen. Eine ordnungsgemäß vorbereitete Biotintenformulierung sollte reibungslos extrudieren und eine präzise Abscheidung und Architektur ermöglichen.

Bereiten Sie 3D-Primärzell-Lebersphäroide in einer 96-Well-Platte unter Verwendung der Hanging Drop-Methode vor, wie im beigefügten Textprotokoll beschrieben. Nach drei Tagen in Kultur sammeln Sie die Lebersphäroide mit einer Pipette von der hängenden Fallplatte und geben sie in ein steriles, konisches 15-Milliliter-Röhrchen. Lassen Sie die Sphäroide ein bis zwei Minuten lang am Boden des konischen Rohrs absetzen.

Saugen Sie dann das Medium vorsichtig mit einer Pipette ab. Übertragen Sie 110 bis 125 Prozent des gewünschten gedruckten 3D-Konstruktvolumens der frisch zubereiteten Hydrogel-Biotintenlösung auf das konische Röhrchen, das die Sphäroide enthält. Pipettieren Sie dann die Sphäroide vorsichtig auf und ab, um sie in der Hydrogel-Biotintenlösung wieder zu suspendieren.

Sobald die Sphäroidlösung gleichmäßig suspendiert ist, übertragen Sie sie mit einer Pipette auf eine Biodruckerpatrone und lassen Sie die Lösung 30 Minuten lang die erste Vernetzungsphase durchlaufen. Nach der Phase der Vernetzung wird ein Bioprinting-Gerät verwendet, um die gewünschten Hydrogelstrukturen zu erzeugen, die die primären Lebersphäroide enthalten. Setzen Sie die gedruckte Biotinte nach jeder Abscheidungsschicht zwei bis vier Sekunden lang UV-Licht aus, um den sekundären Vernetzungsmechanismus zu starten.

Dadurch werden die Konstruktionen stabilisiert und die Steifigkeit auf das gewünschte Niveau erhöht. Die Konzentration von PEG-Alkin in der Lösung steuert die Gesamtvernetzungsdichte und damit in erster Linie die Steifigkeit des endgültigen Konstrukts. Nach dem Bioprinting wurde eine hohe Zellviabilität in den Leberkonstrukten mittels konfokaler Mikroskopie beobachtet.

Unter optimalen Umgebungsbedingungen sollte die Lebensfähigkeit über 85 % liegen. Darüber hinaus wurde bei der Färbung der Konstrukte für Marker, die auf Lebergewebe hinweisen, eine positive Expression von CYP3A4, einer Cytochrom-P450-Isoform, intrazellulärem Albumin, E-Cadherin, einem epithelialen Zellzell-Zell-Adhäsionsprotein, und DPP4, einem Protein, das in der Leber stark exprimiert wird, beobachtet. Als der Nährboden auf Harnstoff und Albumin getestet wurde, wurde festgestellt, dass das Konstrukt sowohl Harnstoff als auch Albumin über den Zeitraum von 14 Tagen in konstanten Konzentrationen absonderte. Dies deutet weiter darauf hin, dass die gewebespezifischen Hydrogel-Biotinten dazu beitragen, die Funktion der Leberzellen aufrechtzuerhalten.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa zwei Stunden von Anfang bis Ende durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Dies hängt jedoch oft von dem jeweiligen Bioprinting-Gerät ab, das verwendet wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die gezeigten Schritte oft angepasst werden müssen, um mit anderen Gewebetypen oder Bioprinting-Geräten kompatibel zu sein.

Nach diesem Verfahren können andere Hydrogel-Biotintenformulierungen hergestellt werden, um das Bioprinting anderer Gewebetypen zu unterstützen. Die Entwicklung dieser Technologien ebnete den Weg für die Entwicklung von Multi-Organoid-Body-on-a-Chip-Plattformen für das Screening von Medikamenten und die Modellierung von Krankheiten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie mit der Entwicklung von Materialien beginnen können, die für den Biodruck von 3D-Gewebekonstrukten verwendet werden können, indem Sie mehrstufiges Crosslinking verwenden.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit ultraviolettem Licht extrem gefährlich für das Sehvermögen sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung einer UV-Schutzbrille sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden.