Bioprinting cellularized Konstruiert unter Verwendung eines gewebespezifischen Hydrogel Bioink

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls besteht darin, einen vielseitigen Ansatz zur Gestaltung von Hydrogel-Bioinks zu demonstrieren, die mithilfe von Bioprinting-Geräten extrudiert werden können. Die Bioinks können anschließend zur Herstellung dreidimensionaler Gewebekonstrukte verwendet werden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich des Bioprintings zu beantworten, beispielsweise, wie die mechanischen Eigenschaften gesteuert werden können, um ein Material bereitzustellen, das mit einem Bioprinter extrudiert werden kann.

Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass wir kommerziell verfügbare Komponenten kombinieren, die modulartig zusammengesetzt werden, um eine einfache und effektive bioprintbare Hydrogel-Bio-Tinte herzustellen. Die Anwendungen dieser Technologien umfassen die Erzeugung von 3D-Gewebestrukturen, die verwendet werden können, um die Wirkungen von Arzneimitteln, Toxinen und Krankheiten präzise abzubilden. Obwohl diese Methode einen Rahmen zur Herstellung von 3D-Leberkonstrukten mittels Bioprinting bietet, kann sie auch auf andere Gewebetypen wie Muskel, Lunge und Darm angewendet werden.

Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da eine Reihe unterschiedlicher Reagenzien zur Herstellung der Hydrogel-Bio-Tinte verwendet werden, doch das Verfahren ist tatsächlich recht einfach. Den Ablauf wird Young-Joon Seol, ein Postdoktorand in unserem Team, demonstrieren. Zunächst bereiten Sie ein gewebespezifisches, extrazelluläres Matrix-Diglysat vor, das gemäß anderweitigen Beschreibungen in der Hydrogel-Formulierung verwendet wird.

Danach lösen Sie einen Photoinitiator in Wasser in einem Gewichtsprozent pro Volumen von 0,1 % auf. Um die Hydrogel-Bio-Tinten herzustellen, lösen Sie zunächst die Basismaterialkomponenten aus den Hyaluronsäure-Hydrogel-Kits in einzelnen Aliquots der wässrigen Photoinitiatorlösung auf. Anschließend kombinieren Sie die ECM-Lösung, die 2 % thiolmodifizierte Hyaluronsäure, das 2 % thiolmodifizierte Gelatin, die Vernetzer und das Kulturmedium für Hepatozyten in den hier angegebenen Verhältnissen. Um die Extrusionseigenschaften der Bio-Tinte zu verbessern, geben Sie 1,5 Milligramm pro Milliliter unmodifizierte Hyaluronsäure und 30 Milligramm pro Milliliter Gelatin zur Mischung hinzu.

Anschließend die resultierende Mischung vor der Verwendung zehn Sekunden lang stark verwirbeln. Bevor der Bioink in einem Bioprinter getestet wird, zunächst die Extrusionscharakteristik am Laborarbeitsplatz prüfen. Mit einer Standard-Spritze eine Probe des Bioinks entnehmen und anschließend eine Nadel mit einer Größe von 20 bis 30 Gauge an der Spritze befestigen.

Lassen Sie das Bioink vernetzen und drücken Sie es anschließend durch die Nadel, um gleichmäßig extrudierte Hydrogelfäden zu erhalten. Wenn die Formulierung in der Lage ist, einen Faden mit wenigen oder keinen Unebenheiten zu erzeugen, ist sie bereit für den Bioprint. Zum Befüllen der Bioink-Präparationen in einen Bioprinter pipettieren Sie die Bioinks in sterilisierte Druckerpatronen.

Lassen Sie sie 30 Minuten vor der Extrusion ruhen, da die Bio-Tinte innerhalb der Kartusche eine spontane Vernetzung erster Stufe durchläuft. Laden Sie danach die Kartusche in die Druckvorrichtung ein und verbinden Sie eine pneumatische Druckquelle mit der Kartusche. Bereiten Sie ein einfaches Muster, wie dieses sieben mal sieben Millimeter große Gitter aus parallelen Linien, zum Drucken vor, um die Extrusionsverträglichkeit zu bewerten.

Während sich der Druckkopf in der XY-Ebene mit einer Geschwindigkeit von etwa 300 Millimetern pro Minute bewegt, eine Druck von 20 Kilopascal auf die Kartusche ausgeübt, um die Bio-Tinte auszutragen. Falls die ausgetragenen Materialien klumpig oder unregelmäßig sind, reduzieren Sie die Menge des zugesetzten Vernetzers, um das einmal vernetzte Material weicher zu machen. Eine korrekt hergestellte Bio-Tinte sollte gleichmäßig austreten, was eine präzise Ablagerung und Architekturen ermöglicht.

3D-Primärzell-Lebersphäroide in einer 96-Loch-Platte mit der Hängentropf-Methode gemäß der beigefügten textlichen Anleitung herstellen. Nach drei Tagen Kultur die Lebersphäroide mittels Pipette aus der Hängentropf-Platte sammeln und in ein steriles kegelförmiges 15-Milliliter-Röhrchen überführen. Die Sphäroide für eine bis zwei Minuten auf den Boden des kegelförmigen Röhrchens absinken lassen.

Anschließend das Medium vorsichtig mit einer Pipette abpipettieren. 110 bis 125 Prozent des gewünschten gedruckten Volumens der 3D-Konstrukte der frisch zubereiteten Hydrogel-Bioink-Lösung in das konische Reagenzglas mit den Sphäroiden überführen. Danach die Sphäroide vorsichtig mehrmals auf- und abpipettieren, um sie in der Hydrogel-Bioink-Lösung erneut zu suspendieren.

Wenn die Suspension gleichmäßig ist, überführen Sie die Sphäroide-Lösung mithilfe einer Pipette in eine Kartusche des Bioprinters und lassen Sie die Lösung 30 Minuten lang in der ersten Vernetzungsstufe reagieren. Nach Abschluss dieser Vernetzungsstufe verwenden Sie ein Bioprinting-Gerät, um die gewünschten Hydrogel-Strukturen mit den primären Leber-Sphäroiden herzustellen. Nach dem Auftragen jeder Schicht wird die gedruckte Bio-Tinte zwei bis vier Sekunden lang UV-Licht ausgesetzt, um die sekundäre Vernetzungsreaktion einzuleiten.

Dies stabilisiert die Konstrukte und erhöht die Steifigkeit auf das gewünschte Niveau. Die Konzentration von PEG-Alkin in der Lösung steuert die Gesamtkreuzvernetzungsdichte und kontrolliert somit hauptsächlich die Steifigkeit des endgültigen Konstrukts. Nach dem Bioprinting wurde mittels konfokaler Mikroskopie eine hohe Zellviabilität in den Leberkonstrukten beobachtet.

Unter optimalen Umweltbedingungen sollte die Vitalität über 85 % liegen. Außerdem wurde bei Färbung der Konstrukte mit Markern, die für Lebergewebe charakteristisch sind, eine positive Expression von CYP3A4, einer Cytochrom-P450-Isoform, intrazellulärem Albumin, E-Cadherin, einem epithelialen Zell-Zell-Adhäsionsprotein, und DPP4, einem Protein, das in der Leber stark exprimiert wird, beobachtet. Als das Kulturmedium auf Urea- und Albuminspiegel getestet wurde, zeigte sich, dass der Konstrukt über den 14-tägigen Zeitraum hinweg sowohl Urea als auch Albumin auf konstantem Niveau sekretierte. Dies deutet weiter darauf hin, dass die gewebespezifischen Hydrogel-Bio-Tinten zur Aufrechterhaltung der Funktion der Leberzellen beitragen.

Wenn man die Technik einmal beherrscht, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung innerhalb von etwa zwei Stunden von Anfang bis Ende durchgeführt werden. Dies hängt jedoch häufig von dem jeweils verwendeten Bioprinter ab. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist zu beachten, dass die hier gezeigten Schritte oft an andere Gewebetypen oder Bioprinter angepasst werden müssen.

Mit dieser Methode können andere Hydrogel-Bioink-Formulierungen entwickelt werden, um das Bioprinting weiterer Gewebetypen zu unterstützen. Die Entwicklung dieser Technologien hat den Weg geebnet für die Herstellung von multi-Organoiden „Body-on-a-Chip“-Plattformen zur Wirkstoffscreening und Krankheitsmodellierung. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Materialien entwirft, die für das Bioprinting dreidimensionaler Gewebekonstrukte unter Verwendung einer mehrstufigen Vernetzung geeignet sind.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit ultraviolettem Licht äußerst gefährlich für das Sehvermögen sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung von UV-Schutzbrillen sollten stets beachtet werden, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.