Introduction
母体免疫激活（MIA）的概念从母体感染患有自闭症和精神分裂症1的关联流行病学研究起源。由于没有在胎盘或母体病毒感染2,3后胎儿大脑检测复制病毒病原体，感染的对后代的影响是假设由母体免疫系统的激活，而不是病原体本身引起的。
为了阐明MIA和精神障碍，注入化学合成，病毒模拟双链RNA聚肌苷之间的原因和结果关系：胞苷酸：成怀孕啮齿类动物（聚（I C））已被广泛地用作动物模型MIA 4,5。聚（I：C）通过toll样受体3（TLR3），和聚的全身给药确认（I：C）诱导病毒样急性炎症反应。一种机制，通过它的聚（I：C）公关oduces行为异常和neuropathologies的后代是由母体胎盘胎儿轴6使亲和抗炎细胞因子的不平衡。一些研究小组已经通过在MIA模型理解精神障碍7的病因，并且由于研究组之间的不同的利益，免疫激活的不同时间点已被用来实现对脑发育和行为7不同扰动。
在保罗·帕特森实验室技术加州理工学院采用注射聚的策略（I：C）为孕鼠胚胎在12.5天（E12.5），它已经成功地证明了MIA能够诱导行为，神经的，并且在与自闭症和精神分裂症相关8-11后代的免疫学变化。我们之前的工作表明，MIA后代显示行为异常（ 如社会impairmenT，通信逆差，重复的行为，焦虑样行为，以及潜在抑制赤字8,10,12），免疫失调和细胞因子失衡8,13,14，胎儿大脑的基因表达15的改变，在小叶第七浦肯野细胞的损失小脑11，海马突触9性质改变，基因与环境互作13，肠道通透性的改变，以及肠道菌群组成16。此外，治疗和预防策略也从该模型系统13,16,17的发展。通过在E12.5诱导MIA，其他人已经表明MIA产生脑突触分子17的胎儿胶质细胞活化和前脑基底胆碱能18发育改造，株特异性相互作用19，大脑突触脑超微结构异常，脑线粒体呼吸链功能亢进abnormalties，下调，抑郁样行为，认知和海马长时程增强（LTP）障碍，与成人海马神经20的赤字。
在这里，我们提供了如何通过聚诱导MIA在E12.5的详细方法（I：C），以及如何运用这一模型来研究自闭症和精神分裂症的病因学范式。要注意的是MIA为多种病症4的危险因素是很重要的，其结果是对时间和感应的方法，以及在怀孕水坝的饲养极为敏感。这样，实验室之间甚至轻微不一致常常导致低的再现性和/或后代不同的表型。我们的方法是专门为那些有兴趣在学习MIA为自闭症和精神分裂症的环境风险因素设计的，详细的描述中提供将有助于研究人员提高他们的数据的可重复性。
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Protocol
所有协议均技术机构动物护理和使用委员会的加州理工学院（IACUC）的批准下进行的。
1.准备定时交配双
- 使用基因表达分析至少6个水坝的行为实验和3。
注意：使用估计雌性小鼠的双数，如只有50％左右的小鼠将从定时交配堵塞。 - 使用雌性小鼠事先没有怀孕，并在8-16周龄。
注：雌性小鼠有性行为之前接触到雄性小鼠但一直没怀孕是可以接受的。 - 房子的雌性小鼠在一起并放置笼彼此相邻，以同步它们的动情周期。使用标准的小鼠笼的超过550英寸的高度和一个75平方英寸的室内地板，以允许5成年小鼠的外壳。标签使用耳朵打孔每个雌性小鼠。
2.设置定时垫ING对
- 在暗循环开始前设置定时交配0-2小时。将两个雌性小鼠每个笼子。取出老鼠并单独衡量他们。记录体重每雌性小鼠。
- 放置一个雄性小鼠与两个雌性小鼠每笼。使用三人配合以最小化父系混杂影响。
3.阴道塞检查（E0.5）
- 检查雌性小鼠0-4小时黑暗循环结束后。轻轻抬起雌性小鼠从尾的基部，并允许小鼠抓住线栅，笼顶部，或笼边。
- 搜索阴道塞的迹象：阴道塞在阴道口可见白色肿块。如果插头并不明显，轻轻插入200微升的枪头插入阴道口。从抗凝血证实阴道栓形成。检查阴道塞每天一次。
注：阴道塞是只指示已发生交配，因此不克uarantee妊娠。阴道塞可能难以在小鼠中的某些菌株鉴别。求助有经验的护理人员小鼠增加的插件识别的准确性。 - 移动插入小鼠到一个新的笼子和组安置他们。定义阴道塞的外观胚胎0.5天（E0.5）的日子。
4.在E10.5-11.5，检查是否怀孕
- 轻轻提起尾巴的基部，并允许小鼠抓住线栅，笼顶部，或笼边。观察腹部区域以检查怀孕， 例如，在腹部的凸起（ 图1）的迹象。
注意：怀孕的迹象总是在E11.5比E10.5更加明显。 - 称量小鼠来验证怀孕。孕小鼠通常重达在E10.5重约20％，并在E12.5重30％相比，非妊娠小鼠（ 图2）。单家在清洁笼子里的孕鼠。
5. 20毫克/公斤的聚（I：C）的制备
- 使用每组至少6水坝进行行为实验和3元组基因表达分析。制备多聚（I：C）的相应数量的解决方案。
- 称量该聚（I：C）的粉末在50ml的锥形管，使40毫克/毫升的最终浓度。为了最小化和标准化引起的喷射量的应力，注入5微升的聚（I：C）对小鼠体重（5微升/克，或5毫升/公斤）每克溶液。为了诱导MIA，我们注入20毫克聚：每公斤（I C）。
注：聚的浓度（I：C）所需的解决方案是（20毫克/千克）/（5毫升/公斤）= 4毫克/毫升。由于该聚（I：C）的粉末含有10％的聚（I：C），我们需要使（4毫克/毫升）/0.1= 40毫克/毫升的聚（I：C）的最终浓度溶液。
警告：聚（I：C）粉末很轻。要小心，不要失去任何粉末，而从锅铲转移到锥形管。 - 加0.9％氯化钠（盐水）相应体积成圆锥形桶e和盖上。直到解决方案是明确的：（C I）粉末通过在聚轻轻滚动滴生理盐水溶解的粉末。离心锥形管以800×g离心1分钟（ 图3C）。过滤聚（I：C）通过0.22微米的过滤器的解决方案。转移聚（I：C）溶液到1.5或2 ml离心管。可选：使用分光光度计来测量260/280比率的聚（I：C）的溶液中。确保该比率之间如制造商所描述1.54-1.82（ 图3）。注：（：C I）粉和作为对照注射应该是无菌的，药品级用于溶解聚生理盐水。
6.盐水或聚（I：C）的E12.5注射
- 称重秤上的鼠标并把它放回笼子。使用下面的公式来计算注射的体积为盐水和聚（I：C）小鼠：体重量（g）乘以5 =所需注射量（微升）。使用0.3毫升INSUL在注射器制订盐水的计算的体积或20毫克/公斤的聚（I：C）的解决方案， 例如，150微升在30 G鼠标。
- 由尾根部轻轻拿起小鼠，并将其放置在笼顶部。轻拿轻放鼠标，以避免应力引起的混杂影响。插入针头，斜面向上，在大约20°相对于小鼠成其两个上乳头（ 图4）的中心，并注入盐水或聚（I：C）的溶液。注：针应该更换为注射后每只小鼠。
- 将鼠标返回到其家笼。将笼子在一个安静，低流量的房间，以避免其他混杂的效果。
7.聚后的第二天（I：C）注射（E13.5）
- 检查以下早晨注射的小鼠。用规模来衡量体重。
注：聚（I：C）注射的孕鼠通常体重增加少于注射生理盐水注射上后的第二天小鼠挠度。 - 直到后代是天生的不打扰老鼠。
8.计MIA后代
- 为了尽量减少MIA感应混杂影响，按照下面列出来衡量MIA后代的使用指南。
- 排除从窝早产或延迟生育，或者如果产仔数小于5。
- 安乐死的CO 2的过度幼仔如果产仔大于10。
9.可选：检查急性炎症反应后MIA
- 使用该机构的动物护理委员会批准的协议描述的方法注射：盐水或聚（C I）后牺牲孕鼠3小时。
注：颈椎脱臼往往是首选，因为它最大限度地减少CO 2 /安乐死药物对大坝和胚胎的影响。 - 收集来自成年孕鼠脾脏和隔离胎盘和胎儿的胸罩在立体显微镜下。
- 对于脾虚收集，躺在解剖板鼠标和对孕鼠的腹部喷70％的乙醇。使用一对无菌剪刀，以使在腹部区域的胸腔下面通过皮肤中心的垂直切割。
- 脾坐在左上腹部象限。使用镊子脾隔离开来。滚上微妙的任务雨刷脾，除去周围器官的脂肪组织。收集大约50毫克的脾组织并单独放置在Eppendorf管500微升RNA稳定缓冲区或TRIzol试剂，以防止核酸降解。储存在-80℃下冷冻样品直至使用。
- 对于胎盘的收集，轻轻拔出从身体子宫角。放置子宫角在培养皿中填充有高压灭菌磷酸盐缓冲盐水（PBS），并离开在冰上的培养皿中。用两个镊子撕开子宫壁和揭露羊膜囊。
- 小心使用镊子打开羊膜囊不破坏胎盘和胎儿。分开胎儿胎盘和剪断脐带尽可能靠近胎盘越好。从胎盘中取出羊膜囊碎片。将胎盘分别在Eppendorf管500微升RNA稳定缓冲区或TRIzol试剂。储存在-80℃下冷冻直至使用的样本。
- 对于胎儿大脑的收集，储存在RNA从步骤9.2.2稳定缓冲区，直到解剖胎儿。从使用立体显微镜下微妙＃5镊子脑的脑室逗关闭软脑膜膜。小心地从胎儿大脑中删除所有的膜。将胎儿大脑单独在Eppendorf管500微升RNA稳定缓冲区或TRIzol试剂。储存在-80℃下冷冻直至使用的样本。
- 提取从组织的RNA和该RNA转变为cDNA。通过实际-T分析了基因的IL6基因表达IME PCR。
- 由以下的TRIzol的制造协议提取组织中的RNA。如果组织被存储在RNA稳定化缓冲液中。解冻样品和降速的缓冲区。通过尖端转移组织到另一个微量离心用500μl的TRIzol并继续RNA提取。
- 使用分光光度计来测量浓度，260/280及260/230比率RNA的。确保比率是2.0以上。
- 消除由处理用DNase一混合物1微克的RNA的RNA，1微升10X反应缓冲液，1微升RNA酶的DNase，和无核酸酶水的DNA污染到的10微升的最终体积。孵育在37℃的主混合物30分钟。加入1μl的DNA酶终止溶液以终止反应。孵育在65℃下该混合物10分钟。
- 反向转录RNA为cDNA。使用20微升的反应，以及高达1微克每反应的总RNA。混合4微升5倍的逆转录（RT）反应混合物缓冲液，1微升转ERSE酶，用DNase I和4微升无核酸-H 2 O处理后11微升RNA模板做出最后的20微升的解决方案。计划RT热循环的条件。一个通用的条件包括：第1步：25℃5分钟;步骤2：42℃30分钟;步骤3：85℃，5分钟;步骤4：保持在4℃。稀释的cDNA的5倍。对于短期储存，存放在4℃的基因。对于长期储存，冷冻在-20℃中的cDNA。
- 分析中的cDNA通过实时PCR的IL6的基因表达和标准化IL6的基因表达对β-肌动蛋白基因的表达。
- 作出IL6和β-actin的检测预混液。使用25μl反应体系中，预混每个基因包含12.5微升的SYBR Green驴友，0.5微升10μM正向引物，0.5微升10μM反向引物和6.5微升无核酸酶的H 2 O的
- 将5微升5倍稀释的cDNA一Ť光学96孔反应板的孔的底部。吸取20μl反应混合液，每孔作最后的25微升PCR混合物。一式三份各基因对于每个样品。使用光学胶膜封板。在800 xg离心在4℃下使用标准的程序的实时PCR的降速板3分钟：步骤1：50℃，2分钟;步骤2：95℃，10分钟;步骤3：15秒和温度60℃下1分钟的95℃的40个循环。添加解离曲线的附加步骤。
10.检查在MIA成年后代的行为异常（可选）：
- 在8-12周的年龄进行行为测试。改变笼的床上用品在测试前至少3天。适应小鼠的行为测试室测试前至少30分钟。
- 对前脉冲抑制（PPI），抑制在有机玻璃圆筒小鼠与它下方的压电传感器。适应小鼠的PPI腔室5分钟。暴露小鼠120分贝白噪声（惊吓）的6项研究。
- 然后用15分贝（15 dB的背景噪声的14项试验，惊吓的14项试验，预脉冲5分贝（比背景噪声高5 dB为单位）+惊吓（PPI5）的14项试验和预脉冲的14项试验的随机混合物暴露小鼠比背景噪声+惊吓（PPI15）。
- 平均为120dB的试验的第6试验的惊恐反应。酒店的平均其他个别刺激的惊吓反应。隐蔽的值前脉冲抑制（惊吓 - PPI5或PPI15）/惊吓。
- 对于开放式现场测试中，将鼠标在一个开放的广场舞台（50×50×50 立方厘米 ）的角落。通过一个安装在天花板上的相机拍摄的小鼠10分钟的轨迹。定义竞技场为中心区域（17×17 平方厘米）的中心。量化行进的距离，中心区的条目，并且时间在中心区手动或通过基于图像的自动分析软件花费。 大理石埋藏测试，适应鼠标的测试笼压缩5厘米深，干净，阿斯松被褥10分钟。返回鼠标的居住笼。轻轻地放在20海军蓝直径1.5cm玻璃球中的4×5布置时尚。将鼠标回测试笼弹珠10分钟。算上已经被埋在10分钟的测试时间弹珠。
11.检查小脑的神经病理学成人MIA后代（可选）：
- 通过安乐死麻醉的盐水和MIA成年子女。灌注通过心血管系统用50ml PBS鼠标和随后50毫升4％多聚甲醛。
- 小心取出大脑，并于4过夜postfix的在4％低聚甲醛的脑 C。冲洗大脑用PBS三次，并在PBS中的脑用0.02％叠氮化钠储存在4℃冰箱中直至使用。
注：后缀大脑可以存储在PBS中的0.02％草皮在冰箱IUM叠氮长达一个月。 - 科脑入50微米的薄片矢状使用vibratome。收集用软毛笔的脑切片。通过温育在0.6％的过氧化氢的部分，在室温下30分钟终止该内源性过氧化物酶的活性。
- 孵育在封闭缓冲液（在PBS中0.1％的Triton X-100和0.02％叠氮化钠的10％山羊血清）中稀释的抗钙结合蛋白抗体的部分在室温下过夜。然后孵育在对应于在室温下2小时封闭缓冲液稀释的生物素化的第二抗体的部分。
- 孵育切片在抗生物素蛋白DH - 生物素化过氧化物酶H络合物缓冲器来检测生物素在室温下1小时。通过使用过氧化物酶底物以可视化的抗原开发的部分。中的步骤之间，用PBS洗涤切片三次。安装部分到显微镜载玻片。图像在显微镜下的章节。
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Representative Results
的20毫克/公斤的聚注射：在E12.5（I C）可以唤起在母体胎盘胎儿轴急性炎症反应并沉淀到大脑发育和行为表型12,13慢性效果。一个促炎性细胞因子水平升高，白细胞介素（IL）-6，是MIA后急性炎症反应的可靠指标。高峰时间在胎盘IL6的基因表达和胎儿大脑是在3小时后的聚（I：C）注射12,13。我们已经表明，聚（I：C）诱导整个脾脏产妇胎盘，胎儿的大脑更高IL6基因表达（ 图5）（改编吴data 等 ，2015年）13。研究人员可以此范例与其它处理相结合，研究可能改变MIA后急性炎症反应， 例如，母亲饮食，遗传突变小鼠，消炎药等的因素。
ENT“FO： - together.within页保持=”1“>另一方面，行为变化也是在MIA模型的特点几个行为测试可以在MIA成年子女展示不同自闭症和精神分裂症样进行。的行为。通常，相比于盐水的后代时，MIA后代显示在旷场试验花费更少的中心区域条目和较短的中心区的持续时间，也显示在大理石更频繁埋藏行为埋藏试验和较低的PPI（ 图6）（数据适于从Wu等人 ，浦肯野细胞中小脑小叶VII的2015）13。丧失是MIA后代的另一个标志（Shi等人 ，2009）。当与钙结合蛋白抗体染色，有在小脑较少钙结合蛋白阳性浦肯野细胞相比盐水对照后代（ 图7）MIA后代小叶七。3643 / 53643fig1.jpg“/>
图1.孕鼠的迹象。妊娠中期鼠标就可以在其腹部区域（箭头）胀识别。近交系C57BL / 6小鼠品系在这里作为一个例子。 请点击此处查看该图的放大版本。
从胚胎（E）的0.5-12.5天怀孕的C57BL / 6N小鼠图2.体重变化。当与在E0.5本阴道塞比较怀孕和未怀孕的小鼠中， 体重（A）体重和（B）发生率在E10.5孕鼠急剧增加。怀孕N = 10，非妊娠N = 5，数据以平均值±SE。*** P <0.001，****P <0.0001。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.聚测量吸光度（I：C）。解决方案确保260/280比例为1.54-1.82之间，请点击此处查看该图的放大版本。
图4.聚（I：C）注射胚胎（E）12.5天颈背怀孕鼠标轻轻。注射部位位于上部乳头的中点。注射针，斜面向上，在相对于小鼠大约20°角。自交系C57BL / 6小鼠品系在这里作为一个例子。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5.聚（I：C）注射增加数据以平均值±SEM 大坝脾胎盘胎儿脑轴 IL6 基因的表达。 * P <0.05，** P <0.01（数据最初是从武等人 ，2015年修改的第13条）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6。＆＃160; MIA成年子女表现出与孤独症和精神分裂症的内表型相关的行为异常。在开放现场测试，MIA的后代（A）进入较少的中心区和（B）花费更少的时间在中心区。 （C）在大理石埋藏测试，MIA后代埋葬比生理盐水对照后代更弹珠。 MIA后代表现出（D）前脉冲5分贝前脉冲抑制（PPI）的赤字和（E）预脉冲15分贝。平均值±SEM。* P <0.05，** P <0.01（数据最初是从武等人 ，2015年修改的第13条）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图7. MIA成年子女表现出与在第七小叶已经成年MIA后代被证实的浦肯野细胞的自闭症。损失的内表型相关的病理异常 。箭：钙结合蛋白+浦肯野细胞。 ML：分子层，GCL：颗粒细胞层，PCL：浦肯野细胞层，请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
MIA感应在不同的时间窗扰乱在啮齿类动物不同脑发育的事件，并因此导致在后代不同行为异常和neuropathologies。这里，我们描述了一种协议以诱导MIA小鼠与聚（I：C）在E12.5注射。 MIA感应的此方法导致行为，神经病学，免疫学，并与自闭症和精神分裂症的后代8,10,11,16有关的胃肠道异常。要注意，这一点很重要，因为MIA是一个环境风险因素，它们的后代的表型，预计将有比来自神经发育障碍的遗传模型小鼠更高的变化。因此，为了准确一致地产生通过MIA自闭症和精神分裂症相关的表型，这是特别重要的，以最小化可能混淆的结果的附加变量。
在协议中所述的时间应密切跟随LY。正确的注射时间窗将确保MIA扰乱在所需阶段的后代大脑发育。在小鼠E12.5 MIA的诱导对应于接近第一三个月结束扰动在人类妊娠21 -在此期间，显著大脑发育时，包括浦肯野细胞和尾壳核的发展，神经发生在皮质层的时期。进一步的调查将需要证明浦肯野细胞中MIA小脑损失和大脑发育的早期扰动之间的关联。
虽然一致就诊，检查，甚至大坝的畜牧业将最大限度地减少产妇应激对子代表现型的效果，我们的协议仍然包含警告，研究人员应该知道的。例如，我们独立屋大坝一天聚在注射前（I：C）和整个妊娠的其余部分。我们的策略是离开孕鼠在undisturbe3d环境。但是，这种行动可能引起母体环境中的应激反应。虽然我们不知道这个隔离诱导的应激反应是否与后代的发展干涉，在MIA效果可以按照程序进行观察。
此外，需要进行选择和用于MIA感应仔细测试小鼠的应变和遗传背景。到目前为止，MIA的效果在野生型C57BL / 6N小鼠8,10,13,16大多复制。其他人也观察到BTBR小鼠品系19 MIA效果。它已经显示，聚（I：C）可以引起在遗传工程小鼠13,22-24不同的免疫反应，其可以引入附加混杂影响给后代。
在生物学重复的数目方面，我们使用每个组每组至少6窝用于行为或生理测定法和3升的基因表达，蛋白质，或免疫组织化学的方法。我们测试的垃圾，而不是使用垫料中的一个或两个后代避免偏见实验中的所有后代。我们还平均数据为一个窝内的所有后代，并使用该平均作为一个数据点（使得n =窝的数量），以避免不适当的统计13。每一性别的数据也汇集起来，因为没有明显的性别差异已经在MIA模型13被观察到。
落后产仔数衡量MIA后代的基本原理是减少因产妇护理和关怀的变化。产仔已经示出在C57BL / 6小鼠25与刻板行为相关。我们推测，这可能是由于资源的产妇护理和关怀中的分配。为了避免这种混淆效应，我们的标准所需的产仔是6-10 C57BL / 6小鼠。
密切关注该协议即使，实验者可恩专柜聚（I：C）后的孕鼠过于软弱或过于强大的免疫反应注射。为了避免这种情况，有必要来验证聚不同批次（I：C）的热解的和cytokinogenic活性。不同批次和批次聚：来自同一公司（I C）可能导致不同程度的小鼠的炎症反应;引人注目的是，注射相同剂量的聚：从不同批次（I C）可导致等离子体高达10倍的差异IL-6水平26。确定剂量和一批聚：由非孕妇女IL-6测量的读数（I C）进一步MIA实验能有助于减少与MIA诱导作用的变化。
如果有必要修改聚特定批次剂量（I：C），它也是重要的修改聚的浓度（I：C），用于注射的溶液，使得注入的体积保持每克大约5微升鼠标的重量。例如，根据本MANUFacturer的过程中，多聚（I：C）的假想在〜10毫克/毫升水重构以产生在生理磷酸盐缓冲溶液的多核苷酸。相比，我们的40毫克/毫升溶液，较低浓度将4倍增加注射的体积。对于孕鼠，大容量缓存注入可能会增加对胚胎的压力和引进意外，混杂影响到后代。因此，我们选择以溶解聚：为了减少喷射的量具有较高的最终浓度（I C）的粉末在0.09％氯化钠。
IL-6被选择为急性炎症反应的标记物，因为先前的研究已经确定了IL-6的信号传导作为在介导MIA的脑发育和行为的影响的关键因素。以下的聚（I：C）处理，IL-6是在母体血液和胎盘10,12最上调细胞因子。最重要的是，Smith等人。证明了几个高度上调细胞因子，只有IL-6都表现出必要和充分的MIA-相关的大脑和行为异常的诱导。即，抗IL-6的母体注射液能有效地防止在MIA中的后代异常行为和转录的异常，而中和其它细胞因子没有10。此外，重组IL-6单独（没有聚（I：C））的母体注射再现MIA相关的转录和行为异常在MIA胎儿大脑和后代12,15看到。
相对于其他的方法来诱导MIA（ 例如 ，脂多糖（LPS）或流感），聚（I：C）是比较安全的，并提供了一种简单的方法来控制免疫应答的强度。虽然由母体聚（I：C）引起的炎症反应给药是急性和短暂的，其对后代的行为和大脑发育的影响是深远的。总体而言，一旦诱导MIA T的技术hrough聚（I：C）注射E12.5被掌握，可以再继续执行不同的行为和生物学实验来研究这个环境风险因素对后代的影响。同时，人们也可以前结合了遗传修饰或其他治疗方法，期间或孕后进行调查的原因和可能的治疗方法自闭症和精神分裂症。
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Acknowledgments
我们要纪念已故保罗·帕特森博士对MIA模型，自闭症和精神分裂症研究的进步作出贡献。我们承认萨尔基斯K. Mazmanian就这一协议的大力支持;鲁本·M.巴戎寺，伊薇特·加西亚 - 弗洛雷斯，卡伦C.伦乔尼，和Leslie A.诺伊曼行政援助;阿里Khoshnan和Jan C.柯对拍摄的援助;伊莱恩Y.萧和Natalia Malkova它们对MIA感应意见;杰弗里·科克伦S.，华金·古铁雷斯，关F·李，海梅·罗德里格斯，洛雷娜C.桑多瓦尔，和Natalie A.贝尔杜斯科及专家畜牧业。这项工作是由美国国立卫生研究院康特中心奖（NIH 5P50MH086383-04，保罗·H·帕特森）的支持;自闭症（＃7670，保罗·H·帕特森）;西蒙斯基金会（＃322839，以萨尔基斯K. Mazmanian）;美国国立卫生研究院培训资助（NIH / NRSA T32GM07616到K-HC）;加州理工大学暑期大学生研究奖学金（SURF）（以ZY）;安进学者计划在加州理工学院（ZY到）;和博士后奖学金FROM国家科学委员会，台湾（NSC 101-2917-I-564-039，到W-LW）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyinosinic–polycytidylic acid potassium salt | SIGMA | P9582 | |
| 0.9% sodium chloride INJ. USP | HOSPIRA | NDC 0409-4888-10 | |
| MONOJECT insuline syrinage 3/10 ml 29 G x 1/2" | COVIDIEN | 8881600145 | |
| 50 ml conical screw cap tubes | USA SCIENTIFIC | 1500-1211 | |
| Nanodrop 1000 spectrophotometer | THERMO SCIENTIFIC | 1000 | Optional |
| Stereomicroscope | Wild Heerbrugg | M5A | Optional |
| Dumont #5 Forceps Inox Tip Size .10 X .06 mm | Roboz | RS-5045 | Optional |
| RNAlater RNA stabilization reagent | Qiagen | 76104 | Optional |
| TRIzol reagent | Life Technologies | 15596-026 | Optional |
| RQ1 Rnase-free DNase | Promega | M610A | Optional |
| iScript cDNA synthesis kit | Bio-Rad | 170-8891 | Optional |
| FastStart universal SYBR green master mix with ROX | Roche | 4913922001 | Optional |
| Real-time PCR | ABI | 7300 | Optional |
| Primer: Il6 forward | Life Technologies | TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC | Optional |
| Primer: Il6 Reverse | Life Technologies | TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC | Optional |
| Primer: beta-actin forward | Life Technologies | AGAGGGAAATCGTGCGTGAC | Optional |
| Primer: beta-actin Reverse | Life Technologies | CAATAGTGATGACCTGGCCGT | Optional |
| MicroAmp optical 96-well reaction plate | Life Technologies | 4306737 | Optionl |
| MicroAmp optical adhesive film | Life Technologies | 4311971 | Optionl |
| EthoVision | Noldus | EthoVision | Optionl |
| SR-LAB apparatus (PPI) | San Diego Instruments | SR-LAB | Optionl |
| Marbles | PENN-PLAX | Blue gem stones marbles | Optionl |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Life Technologies | 21600-069 | Optionl |
| Paraformaldehyde | MACRON | 2621-59 | Optionl |
| Vibratome | Leica | VT1000 S | Optionl |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | Optionl |
| Triton x-100 | Sigma | X100 | Optionl |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma | 18312 | Optionl |
| Goat serum | Vector Laboratories | S-1000 | Optionl |
| Rabbit anti-calbindin antibody | Abcam | ab11426 | Optionl |
| Biotinlyated goat anti-rabbit IgGantibody | Vector Laboratories | BA-1000 | Optionl |
| VECTASTAIN ABC Kit | Vector Laboratories | PK-4000 | Optionl |
