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Methodenartikel

Echtzeit-Überwachung von intrazellulären Gallensäure Dynamics Mit Hilfe eines genetisch kodierte FRET-Gallensäure-Sensor

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DOI:

10.3791/53659

⸱

4. Januar 2016

 ,  , 
1Tytgat Institute for Liver and Intestinal Research, Department of Gastroenterology and Hepatology, Academic Medical Center, 2Laboratory of Chemical Biology, Institute of Complex Molecular Systems (ICMS), 3Department of Biomedical Engineering, Eindhoven University of Technology

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir stellen ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, um die Gallensäuredynamik in lebenden Zellen mit einem genetisch kodierten BAS-FRET-Sensor zu untersuchen. Dieser Gallensäuresensor stellt ein einzigartiges Werkzeug zur Untersuchung (Regulierung) des Gallensäuretransports und der FXR-Aktivierung in einer Vielzahl von Zelltypen dar.

Zusammenfassung

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) ist zu einem leistungsfähigen Werkzeug für die Überwachung der Proteinfaltung, -interaktion und -lokalisierung in einzelnen Zellen geworden. Biosensoren, die auf dem Prinzip der FRET basieren, haben die Echtzeit-Visualisierung von subzellulären Signalereignissen in lebenden Zellen mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung ermöglicht. Hier beschreiben wir die Anwendung eines genetisch kodierten Gallensäuresensors (BAS), der aus zwei Fluorophoren besteht, die mit der Farnesoid-X-Rezeptor-Ligandenbindungsdomäne (FXR-LBD) fusioniert sind, wodurch ein Gallensäuresensor entsteht, der von einer großen Anzahl von Gallensäurespezies und anderen (synthetischen) FXR-Liganden aktiviert werden kann. Dieser Sensor kann auf verschiedene zelluläre Kompartimente ausgerichtet werden, einschließlich des Zellkerns (NucleoBAS) und des Zytosols (CytoBAS), um die Gallensäurekonzentrationen lokal zu messen. Es ermöglicht eine schnelle und einfache Quantifizierung des zellulären Gallensäureeinstroms, des Ausflusses und der subzellulären Verteilung endogener Gallensäuren, ohne dass eine Markierung mit Fluoreszenzmarkierungen oder Radionukleen erforderlich ist. Darüber hinaus können die BAS FRET-Sensoren für die Überwachung der FXR-Ligandenbindung nützlich sein. Schließlich zeigen wir, dass dieser FRET-Biosensor mit der Bildgebung anderer spektral unterschiedlicher Fluorophore kombiniert werden kann. Dies ermöglicht eine kombinierte Analyse der intrazellulären Gallensäuredynamik und i) der Lokalisierung und/oder Häufigkeit von Proteinen von Interesse oder ii) der intrazellulären Signalübertragung in einer einzelnen Zelle.

Einleitung

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) ist weit verbreitet, um ein besseres Verständnis der Zellfunktionen in lebenden Zellen mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung 1 zu gewinnen. FRET wird Energie von einem angeregten Donor-Fluorophor mit einem Akzeptor-Fluorophor übertragen. FRET-Effizienz hängt stark von der Entfernung zwischen dem Donor und dem Akzeptor-Fluorophor und deren Ausrichtung und damit eine empfindliche Auslesen von Konformationsänderungen, welche die beiden Fluorophore beeinflussen. Dieses Phänomen wird genutzt, um FRET-Biosensoren für die Bildgebung von kleinen Molekülen zu erzeugen. Änderungen in deren Konzentration überwacht werden erhöht / verringert sich im Verhältnis der Emissionsintensität des Akzeptors gegen Donorfluorophors 2. Zum Beispiel ermöglichen eine schnelle und stabile Erfassung von freien Calciumkonzentrationen in lebenden Zellen 3 FRET-basierten Biosensoren Calcium. Weitere Vorteile der FRET-Biosensoren sind in einzelnen lebenden Zellen Bildgebung, tErben Nichtinvasivität, ihrer Fähigkeit, an verschiedenen Zelltypen und Zellkompartimente 4 ausgerichtet sein.

Viele Aspekte der intrazellulären Gallensäure Dynamik noch weitgehend unverstanden. Zum Beispiel ist wenig über den Mechanismus zugrunde liegende Regelung von konjugierten und nicht konjugierten Gallensäure-Transport bekannt. Bestehende Techniken zur Überwachung dieser Transport vor allem nutzen Luciferase-basierte Reportern, radioaktiv markierte Gallensäuren oder fluoreszierenden Gallensäure-Analoga. Letztere erfordert eine Modifikation der Gallensäuren, gegebenenfalls deren Eigenschaften zu beeinflussen. Luciferase-basierte Reporter haben schlechte Zeitauflösung. Außerdem führen diese Techniken zu einem Verlust der Probe und nicht anwendbar für die Bildgebung in einzelnen Zellen. Daher wäre es von Vorteil, um Methoden, die Live-Single-Cell-Imaging von Speditionstätigkeit ermöglichen mit FRET Biosensoren nutzen, zumal es beinhaltet den Vorteil, ratiometrische Detektion 5, 6. Während Varianten von CFP / YFP Form am häufigsten verwendeten FRET-Paare, neue Strategien durch MORANGE und mCherry tragenden Selbstassoziation induzierenden Mutationen zu einer Ausdehnung des FRET-Toolbox mit neuartigen Sensoren, einschließlich eines rotverschoben Gallensäuresensor 7 geführt.

Wir eine genetisch kodierte FRET Gallensäuresensor (BAS), das aus einem Donor-Fluorophor (himmel) und einem Akzeptor-Fluorophor (Citrine), die mit dem Farnesoid X-Rezeptor (FXR) Liganden-Bindungsdomäne fusioniert sind, besteht eine zuvor (FXR-LBD) und ein Peptid, das ein LXXLL-Motiv 8. Dieses Peptid assoziiert mit dem FXR-LBD in einem Gallensäure-abhängige Weise. Nach FXR-Aktivierung wird die Distanz zwischen Citrin und cerulean ändern aufgrund einer Konformationsänderung. In Säugetierzelllinien, FXR-Aktivierung führt zu einer deutlich spürbaren Erhöhung der Citrine / cerulean Verhältnis, während das gereinigte Sensor arbeitet in entgegengesetzter Richtung und führt zu einer verringerten FRET Verhältnis auf FXR-Aktivierung. Dieser Sensor (CytoBAS)ermöglicht die Überwachung von zytosolischen Gallensäure-Dynamik. Durch Carboxy-terminale Addition von subzellulären Targeting-Motive kann der BAS-Konstrukts in den Zellkern (NucleoBAS) und Peroxisomen (PeroxiBAS) ausgerichtet werden, so dass Messungen der Gallensäure-Konzentrationen in verschiedenen zellulären Kompartimenten. Obwohl die Zugabe des peroxisomalen Targeting-Motiv nicht seiner Anpassungsfähigkeit an Gallensäuren zu beeinträchtigen, hat zellpermeablen FXR-Liganden induziert jedem Bund Änderungen PeroxiBAS Inneren Peroxisomen 8. Wie die Natur dieser Diskrepanz nicht bekannt ist, das Protokoll unten auf CytoBAS und NucleoBAS konzentriert.

Die Verwendung dieser genetisch kodierte FRET Sensor wurde kürzlich in den Zellen der Leber-Gallensäure-Transporter Na + / Taurocholat co-transportierenden Polypeptids (NTCP) und gelöstem organischen Stoff transporter alpha / beta (OSTαβ) 8, enthaltend gezeigt. NTCP ist der Hauptlebergallensäure Importeur und OSTαβ ist eine basolaterale Darm-Galle-Transporter, die sowohl als Importeur und Exporteur von der elektrochemischen Gallensäure Konzentrationsgradienten 9, 10 funktionieren kann. Neuere Daten zeigen, dass bei der Gallensäure-Transport durch NTCP und / oder OSTαβ, robusten und schnellen Reaktionen in FRET-Verhältnis infolge der Ligand-FXR-LBD Wechselwirkung beobachtet werden.

Hier beschreiben wir detaillierte Protokolle für Methoden zur FRET zu messen, wie die konfokale mikroskopische Analyse und Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS), markieren wichtige Schritte, potenzielle Probleme anzugehen und alternative Methoden zu diskutieren. Mit dieser genetisch kodierte FRET-Sensor, können Gallensäure Interaktion mit FXR-LBD quantifiziert und direkt in lebenden Zellen überwacht werden und bietet eine schnelle und einfache Methode zur Visualisierung Gallensäuretransport und Dynamik in Echtzeit. Säuger-Expressionsplasmiden CytoBAS und NucleoBAS kodieren, sind im Handel erhältlich. Daher kann diese Biosensor weiter auf die beitragenVerständnis der Gallensäure-Transporter oder Verbindungen, die FXR aktivieren und einen tieferen Einblick in Gallensäure Biologie und Signalisierung.

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Protokoll

1. Transiente Transfektion

Hinweis: CytoBAS und NucleoBAS (Bitte siehe Materialien Table) werden erfolgreich in mehreren Zelltypen, (U2OS, Huh7, HepG2, H69, MDCK und HEK293T-Zellen) verwendet. Die Hauptanforderung, um den Sensor zu verwenden, die es braucht, die exprimiert werden, erfordert die Codierung DNA in die Zelle eindringen.

  1. Ernten der Zellen aus einer 80% konfluenten 25 cm 2 -Kolben. Verdünnte Zellen in komplettem Kulturmedium geeignet ist für die spezifische Zelllinie (10% FBS, 1% L-Glutamin, 1% Pen / Strep für U2OS und Huh7 Zellen).
  2. Platte Zellen an der gewünschten Dichte in eine sterile 8 auch Kammerdeckglas (0,8 cm 2). Ziel für eine subkonfluente (60-80% Konfluenz) Schicht von Zellen am Tag des Experiments, obwohl dies nicht wesentlich ist.
  3. Hinzufügen komplettem Kulturmedium auf ein Endvolumen von 400 ul pro Vertiefung. Sodass die Zellen für 24 h zu befestigen.
  4. Bereiten Sie das Transfektionsgemisch in einem sterilen Röhrchen durch Zugabe von 0,5 ug NucleoBASoder CytoBAS DNA zu 100 ul Kulturmedium (Serum / Antibiotika-frei). Vortex gut. Fügen Sie ein Transfektionsreagenz und mischen durch Vortexen. Transfektionsreagenzien, die eine optimale Effizienz zu geben sind Zelltyp abhängig und können vor Test erforderlich.
    1. Zum Beispiel verwenden 2,5 ul 1 mg / ml Polyethylenimin (PEI) und Inkubation der DNA / PEI-Mix für 15 min bei RT.
  5. Fügen Sie das Transfektionsgemisch in Tröpfchen zu den Zellen und mischen durch vorsichtiges Schütteln der Well-Platte mit der Hand. 100 ul des Gemisches für eine gut von ~ 9,6 cm 2. Verwenden 10 ul der Transfektionsmischung für einzelne Abbildungskammern transient transfizierten Zellen.
    Hinweis: Nach 24 bis 48 Stunden werden die Zellen des Gallensäuresensor zum Ausdruck und kann für Experimente verwendet werden.

2. Stabile Transfektion

  1. Ernten der Zellen aus einer 80% konfluenten 25 cm 2 -Kolben. Verdünnter Pellet in komplettem Kulturmedium geeignet ist für die spezifische Zelllinie (10% fötales Rinder SErum, 1% L-Glutamin, 1% Pen / Strep für U2OS und Huh7-Zellen) zu einer Konzentration von 150.000 Zellen pro ml und fügen etwa 300.000 Zellen pro Vertiefung in einer 6-Well-Kulturplatte (2 ml Endvolumen).
  2. Sodass die Zellen für 24 h zu befestigen.
  3. Bereiten Sie das Transfektionsgemisch in einem sterilen Röhrchen durch Zugabe von 0,5 ug CytoBAS oder NucleoBAS DNA (Bitte siehe Materialien Table) zu 100 ul Kulturmedium (Serum / Antibiotika-frei). Vortex gut. Fügen Sie ein Transfektionsreagenz und mischen durch Vortexen.
    1. Zum Beispiel verwenden 2,5 ul 1 mg / ml Polyethylenimin (PEI) und Inkubation der DNA / PEI-Mix für 15 min bei RT.
  4. 100 l des Transfektionsgemisch in Tröpfchen zu den Zellen und mischen durch vorsichtiges Schütteln der Well-Platte mit der Hand. Wir sind stets bemüht untransfizierten Kontrolle bei der Erstellung einer stabilen Zelllinie.
  5. Wachsen Zellen O / N bei 37 ° C, 5% CO 2.
  6. Trypsinize Zellen gemäß dem Protokoll des Herstellers (Inkubiere Zellen bei 37 ° C mitith 1,5 ml vorgewärmter Trypsin pro 25 cm 2 Zellkultur) und Spin sie unten bei 250 · g bei Raumtemperatur für 5 min. Überstand abnehmen und resuspendieren Zellen in 13 ml vollständigem Kulturmedium. Teilen Sie Zellen über verschiedene Durchmesser von 10 cm Kulturschalen: 0,5 ml (low density), 1,5 ml (Mitteldichte) und 4,5 ml (hohe Dichte). Machen Sie dasselbe für die verbleibenden 6,5 ml.
  7. Hinzufügen Kulturmedium auf ein Endvolumen von 10 ml. Für U2OS-Zellen, verwenden Sie 800 ug / ml G418 für Plasmide mit dem Neomycin-Resistenz-Kassette, wie die CytoBAS und NucleoBAS konstruiert, um für positive Zellen auszuwählen. Diese Konzentrationen Zelltyp abhängig und kann durch Auswahl der niedrigsten Antibiotikum (G418) Konzentration, bei der nicht transfizierten Zellen starben innerhalb von 2 bis 10 Tage (800 & mgr; g / ml G418 für U2OS-Zellen) bestimmt werden.
  8. Aktualisieren Sie das Kulturmedium mit dem entsprechenden Antibiotikum (G418) jede 72 Stunden, bis die nicht transfizierten Zellen tot sind.
  9. Untersuchen Sie die Kulturplatte unter dem Mikroskop mit einem 20x-Objektiv fürpositive Kolonien (Fluoreszenz kann mit den meisten für Grün, Cyan oder gelbe Fluoreszenz verwendet Filtersätze überwacht werden).
  10. Markieren Sie die positiven Kolonien, die isoliert mit einem Stift auf der Außenseite Boden der Kulturschale zu liegen aus anderen Kolonien.
  11. Zweimal waschen Sie die Platte mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und saugen Sie es. Nehmen Sie etwa 15 sterile Klonen Zylinder und tauchen sie in sterile Silikon. Übernehmen Sie auf den ausgewählten Kolonien durch leichtes Drücken gegen die Petrischale und stellen Sie sicher, dass nicht mehr als eine Kolonie, in der das Klonen Ring enthalten.
  12. Pipette 20 ul vorgewärmtem Trypsin (1x, 0,25%) bei der Klonierung Zylinder und bei 37 ° C, bis die meisten Zellen aufgerundet (Beobachtung mit einem Mikroskop).
  13. Fügen Sie 150 ul Kulturmedium mit Serum und dem entsprechenden Antibiotikum (10% FBS und 800 ug / ml G418 für U2OS und Huh7 Zellen) bei der Klonierung Zylinder und pipettieren nach oben und unten mehrere Male, um die Zellen zu resuspendieren und in ein 96-Well-Platte. Aktualisieren Mediums nach 4-24 h und ermöglichen Zellen konfluent in den nächsten Tagen (37 ° C, 5% CO 2 für U2OS und Huh7 Zellen) wachsen.
  14. Aktualisieren Medium mit Antibiotikum alle 3 oder 4 Tage. Wenn die Zellen konfluent gewachsen, Übertragung auf einen größeren Well-Platte. Wiederholen Sie diesen Schritt, bis die Kultur groß genug für Experimente ist. Kryokonservierung einige Fläschchen für das Backup. Kryokonservierung Medium besteht aus 20% FBS und 20% DMSO in Medium (DMEM) ohne Zulagen.
    Anmerkung: Nun ist die Zellinie monoklonale und als zur Expression des Gallensäuresensor stabil. Die Hälfte der Konzentration des Antibiotikums G418 (400 ug / ml) reicht nun aus, um die Expression in der stabilen Zelllinie erhalten.

3. Lentivirale Transduction

Anmerkung: Bei einigen Zelllinien werden als schwierig durch traditionellere Verfahren wie Polyethylenimin (PEI) Methode zu transfizieren. Virale Transduktion von Zellen ist ein effizientes alternatives Werkzeug foder Gen-Lieferung und stabile Transgenexpression.

  1. Ernten der Zellen aus einer 80% konfluenten 25 cm 2 -Kolben. Verdünnte Zellen in komplettem Kulturmedium für die spezifische Zelllinie (10% FBS, 1% L-Glutamin, 1% Pen / Strep für U2OS und Huh7-Zellen) geeignet und fügen etwa 200.000 Zellen pro Vertiefung in einer 6-Well-Kulturplatte.
  2. Hinzufügen Kulturmedium auf ein Endvolumen von 2 ml pro Vertiefung. Sodass die Zellen für 24 h zu befestigen.
  3. Auszuführen virales Transduktionen durch Inkubieren der Zellen für 4-6 h mit 500 ul CytoBAS Lentivirus enthaltenden Medium (auf Anfrage erhältlich) gefüllt bis zu einer Gesamtmenge von 1 ml mit kompletten Kulturmedium, das 10 ug / ml Diethylaminoethyl (DEAE) -Dextran oder ein anderes Lentivirus Transduktion Enhancer. Vergessen Sie nicht, ein gut mit untransduzierten Kontrollzellen enthalten.
  4. Entfernen Sie Medium und 2 ml komplettem Kulturmedium, das das gewünschte Antibiotikum (500 ug / ml Hygromycin). Verwenden Sie einen lentiviralen Konstrukt für CytoBAS Transduktion, die lieferns Hygromycinresistenz zu den Zellen. Wachsen Zellen unter gewünschten Bedingungen.
  5. Aktualisieren Medium mit (500 ug / ml Hygromycin) Antibiotikum alle 3 Tage und teilen Sie die Zellen, wenn sie 80% konfluent, bis alle Zellen der Negativkontrolle sind tot (dauert etwa 1-2 Wochen für die meisten Zelllinien). Die Zelllinie wird nun als zur Expression des Gallensäuresensor stabil.
    1. Alternativ können Zellen für die Experimente 1-3 Tage nach der Virusübertragung. Als Lebendvirus könnte vorhanden sein, benötigt dieses FRET-Auslesegeräte in Räumen mit den entsprechenden Sicherheitsniveau.
  6. Alternativ zur schnellen Isolierung von stabilen Zelllinien, führen Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS).
    1. Ernte-Zellen, die aus einer konfluenten 160 cm 2-Kolben.
    2. Verdünnte Zellen in Leibovitz-Kulturmedium (L-15-Medium) mit <5% Serum bis zu einer Konzentration von maximal 5 x 10 6 Zellen pro ml
    3. Zum Sammeln der sortierten Zellen, füllen FACS-Röhrchen mit 1 ml Sammelmedium (L-15 Medium + 1,5% Pen / Strep, 1% L-Überangebot und 20% Serum).
    4. Sortieren Zellen für Citrin (520-580 nm) oder cerulean (450-520 nm), aufgeregt mit 405 Laser.
    5. Nach dem Sortieren rund 500.000 Zellen, Spin-down-Zellen (5 min, 250 xg) und resuspendieren sie in 5 ml normaler komplettem Kulturmedium (10% FBS, 250 ug / ml Hygromycin für U2OS und Huh7 CytoBAS Zellen) und plattieren sie in eine T25-Kultur Flasche. Wachsen Zellen, die unter den gewünschten Bedingungen (37 ° C, 5% CO 2 für U2OS und Huh7 Zellen).

4. Live Cell Imaging der Gallensäure-Sensor

Hinweis: Zellen, die Gallensäure-Transporter können in Medium mit 1-10% Holzkohle gefiltert Serum, das lipophile Verbindungen entfernt kultiviert werden. Normalserum enthält häufig Gallensäuren, die intrazelluläre Akkumulation Gallensäure und die Sättigung des Gallensäuresensor führen könnte.

  1. FRET-Messungen mit dem Konfokalmikroskop
    1. Platte die Zellen, die stabil oder transiently exprimieren den Sensor auf die gewünschte Dichte in eine sterile 8 auch Deckboden Kammer Schieber (0,8 cm 2). Wachsen Zellen in komplettem Kulturmedium (unter Verwendung von Holzkohle gefiltert Serum), so dass auf dem Tag des Experiments ist Konfluenz 60-70%.
    2. Mit 200 ul 1x PBS oder Leibovitz L-15 Kulturmedium Waschen Sie die anhaftenden Zellen in Kammerobjektträger einmal.
    3. Absaugen und ersetzen mit 300 ul Leibovitz L-15-Kulturmedium, so dass kein CO 2 Steuerung notwendig ist.
      Anmerkung: DMEM ohne Phenolrot, können ebenfalls verwendet werden, aber CO 2 gepufferten Bedingungen erfordert. Die Gallensäuresensor zeigt (etwas) pH-Empfindlichkeit, so zielen darauf ab, den pH-Wert konstant bei der Datenerhebung zu halten.
    4. Verdünnen Sie die in der konfokalen Abbildung Experiment auch in der L-15 Kulturmedium verwendet werden Verbindungen. Bitte berücksichtigen, dass während der Bilderzeugung, relativ große Mengen an Flüssigkeit in den Kammern hinzugefügt werden, um eine schnelle Durchmischung der Probe (50-100 ul) zu sichern,so stellen 3-5x Lösungen.
    5. Starten Sie die Imaging-Software eines konfokalen Mikroskops mit einem 37 ° C Inkubationskammer und schalten Sie den violetten 405 nm Laser. Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl auf die objektive und legen Sie die 8-Kammer oben drauf. Für einzelne Zelle Bildgebung von FRET, verwenden Sie das 63X Öl-Objektiv. Der Sensor wurde erfolgreich bei RT verwendet, aber das Verhalten der Zelle könnte verändert werden.
    6. Setzen Sie die Einstellungen des konfokalen Mikroskops richtig.
      1. Stellen Erfassungsmodus: xyt (Zeitraffer-Bildgebung von einzelnen Fokusebene).
      2. Erwerben Sie Bilder in 20 Sekunden-Intervallen, damit Verbindungen zwischen Akquisitionen hinzugefügt werden, ohne Pause das Experiment.
      3. Stellen Spektralbereich zur Emission Erkennung: Cerulean: 450 bis 520 nm; Citrine: 520-580 nm.
    7. Konzentrieren Sie sich auf der Einzelzellschicht mit Durchleuchtung Licht. Starten Bildgebung und genauer Einstellung der z-Position. Stellen Sie Gain und Offset für jeden Kanal, um Signal vom Hintergrund zu unterscheiden, während bleibening gut unterhalb der Sättigung für alle Pixel in interessierenden Zellen.
    8. Zeichnen Sie Kreise um die Region of Interest (ROI) zu definieren. Markieren Sie die Zellen, die ähnliche Fluoreszenzintensität zeigen. Vermeiden Zellen, die offensichtlich von der durchschnittlichen Zell in Größe und Form variieren. Setzen die Zellen, um Licht für eine Zeitdauer so kurz wie möglich zu Photobleichen des Sensors zu minimieren. Es ist ratsam, ROIs nicht sehr nahe am Umfang der Zelle zu ziehen. Dieser Bereich ist sehr empfindlich auf Veränderungen in der Fluoreszenzintensität aufgrund von Fokusdrift (Zellen Bewegung in z-Richtung) wodurch es schwieriger wird, um Änderungen in der Fluoreszenzverhältnis während des Versuchs zu überwachen.
    9. Starten von Messungen mit dem konfokalen Mikroskop. Warten, bis die himmelblaue und Citrin-Fluoreszenz ist stabil.
    10. In 50 bis 100 & mgr; l Gallensäuren oder andere Verbindungen zu ausgewählten Zeitpunkten während der Messung. Die relativ hohen Mengen an Flüssigkeit (ein Fünftel bis ein Drittel des Endvolumens) notwendig sind, um die Flüssigkeiten (innerhalb von 10 sec) gut mischen ohne Schütteln / pipetting nach oben und unten. Achten Sie darauf, den Rand der 8-Well-Kammer mit der Pipettenspitze nicht berühren und fügen Sie die Flüssigkeit langsam, so dass die Zellen nicht aus dem Fokus zu erhalten. Neue Verbindungen Fügen Sie nicht, bevor der Plateauphase erreicht ist. Dieser Vorgang dauert ca. 200 Sekunden.
    11. Werden am Ende jedes Experiments mit der Zugabe von 100 & mgr; GW4064, Endkonzentration 5-10 uM (Sensor Sättigungsdosis) und warten, bis der Sensor Fluoreszenz ist stabil.
    12. Speichern Sie das Experiment und die Daten zu exportieren als .avi-Datei.
    13. Open in ImageJ beide AVI-Dateien (Kanal 00, cerulean, Kanal 01, Citrin), indem Sie Plugins> Stapel> Stapel-Interleaver. Alternativ Import konfokalen Datei (zB .lsm oder .lif Dateien) direkt in Bild J mit entsprechenden Plugins (verfügbar unter http://www.openmicroscopy.org) und gehe zu Schritt 4.1.14.
      1. Für Stack 1: Verwenden Sie Kanal 01 (Citrin).
      2. Für Stack 2: Verwenden Sie Kanal 00 (cerulean).
    14. Klicken Sie auf Bearbeiten> Auswahl> hinzufügenzum Manager, um den ROI-Manager-Fenster zu öffnen. Markieren Sie die Checkbox "Alle anzeigen".
    15. Zeichnen Sie ein paar Bereiche von Interesse (ROIs) in Bezug auf bestimmte Zellen, die mit dem ovalen Auswahlwerkzeug. Auch zeichnen einen Kreis in einem Bereich außerhalb Zellen oder in einer Zelle, die nicht den Sensor nicht ausdrücken, um das Hintergrundsignal zu bestimmen. Es ist ratsam, ROIs nicht sehr nahe am Umfang der Zelle in Experimenten zu ziehen, wenn Veränderungen in der Fluoreszenzintensität aufgrund von Fokusdrift (Zellen Bewegung in z-Richtung) oder die Zellmigration waren offensichtlich.
    16. Wählen Sie eine Zelle. Klicken Sie auf Plugins> Verhältnis Profiler. RAW, Verhältnis und Ratio_Profile: Dies wird in 3 Bildschirme führen. Die RAW-Fenster zeigt die Zunahme der Intensität der Citrin (blaue Linie) und eine Abnahme der cerulean (rote Linie), wenn es FRET. Der Ratio-Fenster gibt Auskunft über das Verhältnis Citrin / cerulean, die mit einer Zunahme der FRET erhöht. Das Fenster Ratio_Profile gibt die tatsächliche Zahl der Fluoreszenzintensität in beiden Kanälen gemessen. Wenn microsbewältigen Setup-spezifische Dateien (zB .lsm oder .lif anstelle von .avi-Dateien) werden verwendet, die Kanalreihenfolge könnte umgekehrt werden.
    17. Kopieren der Daten aus dem Ratio_Profile Fenster in der Tabelle als Ergänzungsdaten beigefügt. Machen Sie dasselbe für alle anderen Zellen (und Hintergrund ROI).
      Anmerkung: In der Online-Tabelle wird normalisiert, um den Zustand bei der eine maximale BAS Aktivierungs voraussichtlich alle Daten. Da GW4064 ist der stärkste Aktivator von FXR, das Fluoreszenzverhältnis nach der Inkubation mit einem Überschuss von GW4064 auf 1 gesetzt ist Es ist daher wichtig, um alle Experimente mit Zugabe von GW4064 beenden. Der Vorteil davon ist, dass die Daten nicht mehr abhängig von der Laserintensität oder Detektorverstärkung und Versuche an verschiedenen Tagen leichter verglichen werden. Ferner ist in dem unteren Diagramm der Tabellenkalkulation kann ein laufender Mittelwert verwendet, um die Kurven für experimentelle Rauschen zu glätten. Jedoch nicht verwenden diese Grafik bei der Analyse von kinetischen Daten, da die Lauf AveraGE wird auch glatt schnelle kinetische Reaktionen.
  2. FRET-Messungen mit Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)
    1. Verdünnter alle Verbindungen für die FACS-Experiment in sterile FACS-Aufnahme-Puffer (0,3 mM EDTA, 0,5% BSA, 0,01% NaN 3 und 10 mM D-Glucose).
    2. Ernten der Zellen aus einer 80% konfluenten T-160 cm 2 Zellkulturflasche mit 5 mM EDTA in PBS. Zentrifuge Zellen bei 250 g für 5 min. Wash Zellpellet 2 x in 5 ml FACS Aufnahmepuffer bei Raumtemperatur.
    3. Graf Zellen unter Verwendung des Coulter-Zähler oder ein Zählkammer.
    4. Verdünnter Pellet in FACS Aufnahmepuffer auf eine Konzentration von 1 x 10 6 Zellen / ml. Pipette nach oben und unten um eine homogene Suspension von Einzelzellen zu schaffen. Wenn Zellen sind schwierig zu zerlegen, legen Sie die Proben durch eine Zellsieb vor dem Sortieren zu Düse verstopft zu minimieren.
    5. Jeweils 200 ul Zellen pro FACS-Röhrchen und sie vor Licht zu schützen.
    6. Fügen Sie die gewünschte Konzentration der Verbindung (zB, Gallensäuren, synthetischen FXR-Liganden-Transporter-Inhibitoren). Wirbel. Inkubieren Sie für 20-30 Minuten bei Raumtemperatur unter Schütteln (im Dunkeln).
    7. Unterdessen beginnen die FACS (die Laser brauchen Zeit, um sich aufzuwärmen).
    8. Stellen Sie die Durchflusszytometrie Gating-Parameter für das Experiment (siehe Abbildung 3):
      1. Laden Sie rund 100.000-200.000 NucleoBAS oder CytoBAS transfizierten Zellen, die Tore zu bestimmen.
      2. Zuerst stellen Sie die FSC und SSC-Spannungen, um die Zellen in der Mitte des Grundstücks zu zeichnen.
      3. Unter Verwendung der violetten Laser, passen Sie die cerulean (450/40 nm) Spannungswert und Citrin (525/20 nm) Spannung und sicherzustellen, dass alle NucleoBAS oder CytoBAS positive Zellen werden im Streudiagramm dargestellt.
      4. Stellen Sie die richtige Gates (Tor P1 bis P4-Tor), siehe Abbildung 4.
        1. Verwenden Gate P1, um tote Zellen, in der Regel in der linken unteren Ecke angezeigt wird, indem Sie den Hauptpopulation in der Mitte des SSC-A / FSC-einem Grundstück auszuschließen.
        2. Verwenden Gate P2 inDie FSC-H / FSC-A Fenster Duolen von der Analyse zu entfernen. Einzelzellen in einer Diagonallinie als Dubletts dargestellt.
        3. Tor P3 in der Citrin (525/20 nm) / cerulean (450/40 nm) Fenster kann verwendet werden, um für NucleoBAS / CytoBAS positiven Zellen auszuwählen, durch Gating Citrin und cerulean hohen Zellen, in der rechten oberen Ecke des diagonal angezeigt eine Bevölkerung die Handlung.
        4. Zeichnen Gate P4 in der oberen linken der Bevölkerung, so nah wie möglich und stellen Sie sicher, dass nicht mehr als 5% der Zellen innerhalb dieses Tor fällt.
      5. Legen Sie ein paar nicht transfizierten Zellen (kein Ausdruck CytoBAS oder NucleoBAS), um Autofluoreszenz zu bestimmen. Die transfizierten Population kann nicht im Gate P3 befinden. Passen Gate P3, wenn notwendig, um auto-fluoreszierenden Zellen auszuschließen.
    9. Mischen Sie den Proben vor der Platzierung der Röhrchen im FACS. Für jede Probe zu messen, zumindest 10.000 Zellen in Gate-P3.
      Hinweis: Die Bevölkerung Hierarchiefenster gibt die Anzahl der Veranstaltungenwobei für jedes Gate und% der Mutter Gatter angezeigt. Im Gatter 4 die% der Mutter heißt Zellen, die mit einem erhöhten Citrine / cerulean Verhältnis als Prozentsatz aller NucleoBAS positiven Zellen.

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Ergebnisse

Die FRET-BAS Sensor enthalten, wird für die Ligandenbindungsdomäne von FXR (LBD-FXR) zwei Fluorophore Citrine und himmel) und ein LXXLL-Motiv angebracht basiert. Dieser Sensor ermöglicht Untersuchungen Gallensäuretransport in lebenden Zellen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung (Abbildung 1 A). Mutationen in cerulean und Citrin wurden angewendet, um die Bildung der intramolekularen Komplexes (Abbildung

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Diskussion

Wir stellen hier ein detailliertes Protokoll für die Verwendung eines neuen genetisch codierten Gallensäuresensor zur Überwachung des raumzeitlichen Dynamik der Gallensäure-Transport in lebenden Zellen. Dieser Biosensor besteht aus cerulean und Citrin fluoreszierende Proteine, die FXR-LBD verschmolzen werden, wodurch ein FRET-Gallensäuresensor (BAS) bilden.

Die Gallensäure-Sensor ist relativ einfach und bequem im Einsatz, wenn mit grundlegenden Erfahrungen mit Zellkultur und FACS oder (konfo...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch ERC Starting Grants (ERC-2011-StG 280255 und ERC-2013-StG 337479) und durch die niederländische Organisation für Gesundheitsforschung und -entwicklung (Vidi 91713319) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
CytoBAS Addgen62860
NukleoBAS Addgene62861
Dulbecco's modifizierte Eagles-Medien (DMEM)LonzaBE12-614FHohe Glukose ohne L-Glutamin
Penicillin-Streptomycin (Pen/Streptomycin)Lonza17-602E
L-Glutamin (200mM)Lonza17-605E
Fötales Kälberserum (FBS)Invitrogen102-70
Trypsin-EDTA (10x)LonzaCC-5012
T-25 ZellkulturflascheVWR international392-0253Lamininbeschichtete
T-175 ZellkulturflascheVWR international392-0238Lamininbeschichtete
6-Well-PlatteVWR international734-0229Poly-L-Lysin und Laminin beschichtete
10-cm-SchaleVWR international392-0243Laminin beschichtet
Diethylaminoethyl (DEAE) - DextranSigma-AldrichD9885
Polyethylenimin (PEI) Brunschwig23966-2
G418 (Geneticin) 50 mg/mlInvitrogen10131-027
Hygromycin B, 50 mg/mlInvitrogen10687-010
Klonierungszylinder (6 x 8 mm)Bellco2090-00608
L-15 Leibovitz KulturmediumInvitrogen21083-027Ohne Phenolrot
Polystyrol Rundbodenröhrchen (5 ml) Facs RöhrchenFalcon BD352008ohne Verschluss, unsteril
Falcon 2.063 Röhrchen (5 ml)Falcon BD352063Schnappverschluss, steril
Nunc Lab-Tek 8 Well DeckglasThermo Scientific155409Steril
Aktivkohlegefiltert FBSLife Technologies12676011
GW4064Sigma-AldrichG5172
TCDCASigma-AldrichT6260
CDCASigma-AldrichC9377
Sonstige ChemikalienSigma-Aldrichn.v.t.

Referenzen

  1. Aoki, K., Kamioka, Y., Matsuda, M. Fluorescence resonance energy transfer imaging of cell signaling from in vitro to in vivo: basis of biosensor construction, live imaging, and image processing. Dev. Growth Differ. 55 (4), 515-522 (2013).
  2. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. FRET imaging. Nature Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).
  3. Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).
  4. Li, I. T., Pham, E., Truong, K. Protein biosensors based on the principle of fluorescence resonance energy transfer for monitoring cellular dynamics. J. Biotechnol. Lett. 28 (24), 1971-1982 (2006).
  5. Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
  6. Merkx, M., Golynskiy, M. V., Lindenburg, L. H., Vinkenborg, J. L. Rational design of FRET sensor proteins based on mutually exclusive domain interactions. Biochem. Soc. Trans. 41 (5), 1201-1205 (2013).
  7. Lindenburg, L. H., et al. Quantifying Stickiness: Thermodynamic Characterization of Intramolecular Domain Interactions To Guide the Design of Förster Resonance Energy Transfer Sensors. Biochem. 53 (40), 6370-6381 (2014).
  8. van der Velden, L. M., et al. Monitoring bile acid transport in single living cells using a genetically encoded Förster resonance energy transfer sensor. J. Hepatol. 57 (2), 740-752 (2013).
  9. Dawson, P. A., et al. The heteromeric organic solute transporter α-β, Ostα-Ostβ, is an ileal basolateral bile acid transporter. J. Biol. Chem. 280 (8), 6960-6968 (2005).
  10. Meier, P. J., Stieger, B. Bile salt transporters. Annu. Rev. Physiol. 64 (1), 635-661 (2002).
  11. Klarenbeek, J. B., Goedhart, J., Hink, M. A., Gadella, T. W., Jalink, K. A mTurquoise-based cAMP sensor for both FLIM and ratiometric read-out has improved dynamic range. PLoS One. 6 (4), e19170(2011).
  12. Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr. Opin Biotechnol. 16 (1), 19-27 (2005).
  13. Plass, J. R., et al. Farnesoid X receptor and bile salts are involved in transcriptional regulation of the gene encoding the human bile salt export pump. J. Hepatol. 35 (3), 589-596 (2002).

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