Introduction
All'inizio perdita embrionale nelle vacche ad alta produzione di latte è una delle principali sfide del settore lattiero-caseario 1, 2. Bovina è diventato un modello interessante per studiare lo sviluppo preimpianto dell'embrione umano a causa del loro processo di sviluppo simile a 3, 4. Tuttavia, più ricerca è necessaria per avere una migliore comprensione di geni coinvolti nello sviluppo embrionale precoce bovina.
Dopo venti anni dalla prima tecnologia microarray sviluppato nel 1995 5, lo sviluppo di più sofisticate tecnologie sonda fabbricazione errori di stampa ridotti e variabilità dei chip a matrice all'interno e tra le diverse piattaforme di microarray 6. La tecnologia microarray migliorata determinato un ampiamente l'applicazione di questa tecnologia nel campo della ricerca clinica 7 e, più recentemente, in embrione precoce qvalutazione ualità 8.
La grande quantità di materiale necessario per la tecnologia microarray è la ragione principale per cui la tecnologia microarray inizialmente non è riuscito a entrare in un certo numero di campi di ricerca come sviluppo embrionale precoce. Più di recente, i metodi di amplificazione di RNA sono stati migliorati per amplificare linearmente RNA fino al livello microgrammi da sub-nanogrammo materiale di partenza di RNA 9. Ci sono diversi kit RNA amplificazione commerciali disponibili sul mercato; tuttavia, il più popolare kit ben sviluppati sono legati alla Ribo-Single Primer isotermica di amplificazione 10 e T7 promotore guidato 11 metodi. Il più popolare di amplificazione RNA antisenso utilizza nella trascrizione vitro con un oligo dT fondo il collegamento a un promotore T7 a 5 '12. Questa tecnologia consente di mantenere più di trascritti rappresentativi anti-senso dopo amplificazione lineare fo array ibridazione 13. Questo metodo è stato adattato per amplificare il livello picogrammi di RNA totale estratto da embrioni bovini 8.
Universale Linkage System (ULS) è il metodo di etichettatura che incorpora direttamente il DNA o RNA amplificato con colorante fluorescente in platino-linked sia Cyanine 547 o 647 Cyanine, formando un legame coordinativo sulla posizione N7 della guanina 14. Questo metodo è stato adattato nella ricerca embrioni per generare più stabile amplificato ARNA senza modifiche rispetto al aminoallyl modificati su ARNA generata dal metodo enzimatico 15. metodi sia singolo colorante ed etichettatura due coloranti sono stati adattati utilizzando universale Linkage System nella microarray. Un ampio studio confronti microarray è che vi è una buona correlazione della qualità dei dati tra le piattaforme di array uno o due colori 6.
Recentemente, sia in auto promotore T7Metodi n amplificazione RNA antisenso ed etichettatura ULS sono stati sviluppati per fornire un protocollo più affidabile per generare una quantità sufficiente di alta qualità etichettati materiali ARNA per microarray ibridazione 8, 16. Pertanto, questo studio fornisce un protocollo per dimostrare alcune importanti passi da estrazione di RNA per l'analisi dei dati coinvolti in microarray due colori usando Giorno 7 embrioni bovini come esempio.
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Protocol
La parte animale di questo studio è stato condotto presso l'Unità di Ricerca metabolica della University of Alberta, Edmonton, Canada, con tutte le procedure sperimentali su animali approvato (protocollo # AUP00000131) per l'Università di Alberta cura degli animali e del Comitato uso, e gli animali curati secondo al Consiglio canadese delle linee guida per la cura degli animali (1993).
1. di produzione di embrioni, Isolamento di RNA totale e trattamento DNasi
- Per i protocolli sperimentali animali e di raccolta degli embrioni riferimento nelle nostre precedenti pubblicazioni 17, 18.
- Piscina e scatto congelare simili embrioni palco da ogni mucca in azoto liquido e poi continuare a -80 ° C fino a quando l'estrazione di RNA.
- Estrarre RNA totale tramite un kit di estrazione di RNA colonna-based che consente di estrarre l'RNA da campioni pico-scala (informazioni kit è disponibile in Lista dei Materiali).
NOTA: consigliato kit contiene: condizionata Buffer, estrazione Buffer, il 70% di etanolo, il tampone di lavaggio 1, il tampone di lavaggio 2, tampone di eluizione, colonne di purificazione RNA con tubi di raccolta e tubi microcentrifuga. - Aggiungere 10 ml Extraction Buffer al tubo contenente gli embrioni e incubare per 30 minuti a 42 ° C. provetta da centrifuga a 800 xg per 2 minuti per raccogliere estratto cellulare nella provetta.
- Pipettare 250 microlitri condizionata tampone sulla membrana del filtro colonna di purificazione. Incubare la colonna di purificazione dell'RNA con condizionata tampone per 5 min a temperatura ambiente. Centrifugare la colonna di purificazione nel tubo di raccolta in 16.000 xg per 1 min.
- Pipettare 10 ml di etanolo al 70% nella miscela di RNA Extraction Buffer ed embrioni. Mescolare bene pipettando su e giù. miscela Pipettare nella colonna di purificazione precondizionato.
- Per legare RNA, centrifugare la colonna di purificazione per 2 min a 100 xg e seguire immediatamente da una centrifugazione a 16.000 xg per 30 s per rimuovere flusso attraverso.
- Dispensare 10081; L di tampone di lavaggio 1 nella colonna di purificazione e centrifugare per 1 min a 8000 x g.
NOTA: DNase trattamento è consigliato se si esegue la trascrizione inversa o di amplificazione dopo l'isolamento di RNA. - Digest DNA genomico dopo passo 1.8.
NOTA: consigliato kit DNasi è disponibile in Lista dei Materiali. Kit consigliato contiene: soluzione di riserva DNasi I e Buffer. - Preparare miscela di incubazione DNase mescolando 5 soluzione madre microlitri DNasi I con 35 microlitri di buffer. Mescolare capovolgendo delicatamente.
- Pipettare il microlitri DNasi miscela 40 di incubazione direttamente nella membrana colonna di purificazione. Incubare a temperatura ambiente per 15 min.
- Pipettare 40 microlitri tampone di lavaggio 1 nella membrana colonna di purificazione e quindi si centrifuga a 8000 xg per 15 s.
- Pipettare 100 microlitri tampone di lavaggio 2 nella colonna di purificazione e centrifugare per 1 min a 8000 x g.
- Pipetta altri 100 microlitri tampone di lavaggio 2 nella colonna di purificazione e centrifugareper 2 minuti a 16.000 x g.
- Trasferire la colonna di purificazione di un nuovo 0.5 mL provetta. Pipettare 11 ml di tampone di eluizione direttamente sulla membrana della colonna di purificazione. Per garantire il massimo assorbimento di Elution Buffer nella membrana, toccare delicatamente la punta della pipetta alla superficie della membrana, mentre l'erogazione del tampone di eluizione.
- Incubare la colonna per 1 min a temperatura ambiente. Centrifugare la colonna per 1 min a 1000 xg per distribuire Elution Buffer nella colonna, e poi girare per 1 min a 16.000 xg per eluire RNA.
- Utilizzare strumento bioanalizzatore secondo le istruzioni del produttore per valutare la qualità e la quantità di RNA 19.
- Conservare il campione di RNA a -80 ° C fino al momento dell'uso.
2. RNA di amplificazione e di etichettatura per l'analisi di microarray
NOTA: Per l'utente prima volta a lavorare con le procedure di amplificazione di RNA e di etichettatura, utilizzare cinque ng di spike-in RNA along con i campioni reali ARNA per monitorare la misura di controllo della qualità dell'amplificazione RNA e ibridazione. Il picco-in mix RNA contiene dieci in vitro di sintesi, trascrizioni poliadenilato in rapporti prestabiliti. Quando la procedura eseguita correttamente, le trascrizioni etichettati specificamente ibridano solo per sonde di controllo complementari matrici ei dati possono essere acquisiti per monitorare la garanzia di controllo della qualità con sé il minimo o cross-ibridazione. Maggiori dettagli descrizione per quanto riguarda la procedura di spillo-in intensità di controllo e di normalizzazione dopo la scansione l'array e analisi dei dati è fare riferimento a precedenti pubblicazioni 20, 21. La procedura seguente viene data agli utenti di microarray di routine.
- Preparare alta qualità (valore numerico RNA Integrity (RIN) almeno> 7.0) 100 pg campione di RNA in un volume totale di 10 - 11 microlitri.
- Amplificare i campioni di RNA con un kit di amplificazione in grado dilavorare con i campioni pico-scala (non più di 100 pg).
NOTA: Consigliato informazioni kit di amplificazione è disponibile in Lista dei Materiali e segue le istruzioni del produttore, senza alcuna modifica. - Utilizzare una quantificazione basato sulla fluorescenza per valutare il profilo della gamma di dimensioni del ARNA amplificato.
- Utilizzare lo strumento spettrofotometro (basato sul assorbanza a 260 e 280 nm) per misurare la concentrazione della ARNA amplificato.
- Conservare il ARNA amplificato a -80 ° C fino al momento per l'etichettatura.
- Utilizzare 2 mg di RNA amplificato per l'etichettatura fluorescente secondo le ULS ARNA manuale d'uso Kit di etichettatura.
NOTA: Poiché Cyanine 547 e 647 Cyanine colorante sono sensibili a foto-degradazione e Cyanine 647 colorante è facilmente degradato dall'ozono, la procedura di etichettatura avviene in una quantità minima di luce e sotto un ambiente privo di ozono. - Attiva la casella di ozono (Figura 1A) finché il livello di ozono è 0,001 ppm.
- Miscelare delicatamente e incubare le provette in un termociclatore a 85 ° C per 15 min. I campioni in ghiaccio per almeno 1 min. Spin down per raccogliere il contenuto dei tubi prima di procedere con il kit di estrazione di RNA, salvo passaggi relativi al trattamento DNasi (1,9-1,11), per ripulire l'RNA amplificato Cy-dye-etichettati.
- Utilizzare lo strumento spettrofotometro per misurare e determinare la concentrazione di RNA amplificato marcato e mantenere il ARNA etichettati a -80 ° C al massimo per 3 giorni prima dell'uso.
3. microarray ibridazione e di lavaggio
NOTA: Le seguenti passi importanti sono adattate in base a due colori per microarray a base di analisi di espressione genica Protocol (versione6.5, maggio 2010).
- Aggiungere la stessa quantità di 825 ng da ciascuna Cyanine 547- e 647 Cyanine marcati ARNA e mescolare con 25x e 10x frammentazione buffer di blocco.
- Riscaldare il miscuglio a 60 ° C per 15 minuti e raffreddare in ghiaccio per 1 min.
- Aggiungere la stessa quantità di tampone di ibridazione 2x e mescolare bene.
- Centrifugare a 13.000 rpm, quindi la miscela è pronta per l'ibridazione.
- Carica 100 microlitri dalla miscela sul vetrino matrice e sigillare la slitta all'interno della camera di ibridazione.
- Caricare la camera montata nel forno di ibridazione per 17 ore a 65 ° C rotante a 10 rpm in forno.
- Lavare le matrici secondo protocollo con trattamento protettivo di ozono mediante immersione in stabilizzazione ed essiccazione soluzione per 30 s.
- Rimuovere le matrici dalla soluzione e assicurarsi che la superficie array è asciutta, senza particelle di polvere
4. La scansione microarray diapositive
- Mantenere gli array in luogo buio e accendere scanner finché è pronto per l'uso (15 min tempo di attesa).
- Caricare il codice a barre serie a sinistra, nello scanner e avviare la scansione. Fare l'analisi loco secondo il manuale d'uso del software e salvare i dati come (GPR) formato di file.
5. Analisi statistica
- Scaricare il software FlexArray http://genomequebec.mcgill.ca/FlexArray/license.php Clicca su "dati grezzi di importazione" e caricare i file GPR in FlexArray.
- Eseguire la normalizzazione e l'analisi statistica, se necessario, seguendo le istruzioni. Nota: Calcolare la soglia per la selezione positiva posto in questo studio come è stato descritto in precedenza 22.
- Selezionare il menu a tendina dal visualizzatore trama del FlexArray per visualizzare tutti i punti ibridate e segnali di fondo. Nota: Un quadro analogo di spillo nei controlli dopo l'ibridazione di microarray può essere visto in precedente studio 8.
- Seleziona unnormalizzazione Loess all'interno dell'array seguito da un quantile tra processo di normalizzazione array dal FlexArray discesa manuale di conseguenza.
- Esportare tutti i dati normalizzati da FlexArray in un file Excel per un ulteriore utilizzo.
6. Analisi Bioinformatica
L'annotazione originale delle sequenze di scansione da trascrizioni specifici embrione bovino (BESTv1) microarray è stato descritto in precedenza 8. Nel presente studio, 20,403 Simboli Gene unici (GS) sono stati ottenuti ( Supplemento File1 ) attraverso il EmbryoGENE Laboratory Information Management System (LIMS) ELMA (http://elma.embryo-gene.ca). Un elenco di 6.765 geni unici ( Supplemento File2 ) è stato selezionato e corrispondeva ai segnali tutti positivi dopo il processo di normalizzazione microarray (punto 5.5) Bovine 7 ° giorno gene embrioni profilo di espressione. Soglia di segnale positivo è stato calcolato sulla base di pubblicazione pervio 16 dalla intensità di un valore di un segnale.
- Per eseguire l'analisi funzionale con PANTHER (Protein analisi tramite evolutivi Relationships) Sistema di Classificazione 23, 24, aprire il seguente link (http://www.pantherdb.org/about.jsp).
- Carica un elenco di 6.765 GS-specific di embrioni per identificare specifici processi biologici durante lo sviluppo embrionale utilizzando il test sovrarappresentazione statistiche e di utilizzare l'impostazione predefinita di Bos taurus (tutti i geni nel database) come elenco di riferimento 25.
NOTA: Questo permette l'identificazione dei processi di sviluppo legati dai termini GO che sono statisticamente sovra o sotto-espressi utilizzando un test binomiale. - Set soglia P-value <0.05 di default del software. I dati possono essere scaricati e expoari in file di Excel per ulteriore selezione 16.
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Representative Results
Un risultato rappresentativo di RNA totale e amplificato aRNA dal Giorno 7 embrioni di bovini è mostrato in figura 3 e riassunti nella Tabella 1.
integrità dell'RNA e profilo possono essere valutate dopo l'estrazione di RNA. Valutazione della qualità di RNA potrebbe essere fatto per strumento Bioanalyzer (figura 3A) e solo i campioni con un valore superiore a 7,0 RIN sono qualificati per essere utilizzati per l'amplificazione (Tabella 1).
La qualità e la quantità di RNA amplificato devono essere valutate dopo l'amplificazione. La somiglianza del profilo RNA amplificato e intervallo di dimensioni adeguate sono i fattori principali per il controllo della qualità (Figura 3B). Dopo l'amplificazione a doppio turno, i frammenti di RNA amplificati sono molto simili per dimensioni, compresa tra 200 e 800 bp (Figura 3B) etutti Arnas della gamma di dimensioni simili vengono selezionati per l'ulteriore etichettatura fluorescenza. Inoltre, un'amplificazione successo del RNA totale iniziale produrrà almeno più di mille volte maggiore di aRNA (Tabella 1).
Fluorescenza efficienza etichettatura può essere calcolato in base al livello di rapporto di etichettatura. La formula è disponibile nel manuale d'uso kit di etichettatura ULS ARNA. Il manuale d'uso suggerisce il livello di rapporto di etichettatura dovrebbe essere 1,0-3,6%, indicando che la media di 1 - 3,6 ULS molecole per 100 nucleotidi.
I file di immagine dopo l'ibridazione e la scansione possono essere visualizzate da FlexArray. Una buona qualità dell'immagine digitalizzata dopo microarray ibridazione e lavaggio è mostrato in Figura 4A. Se i materiali etichettati sono inferiori o superiori a questo intervallo, i segnali saranno troppo bassi per rilevare o alti livelli di sfondo sarà rilevato dopo Scanning (Figura 4B).
Nel corso di studio, di soglia segnale positivo è stato fissato a 7,6 (segnale della sonda superiore a 7,6 o di sfondo <7.6 considerato positivo). Circa il 46% dei gruppi di sonde che rappresentano 20826 punti positivi sono indicati in colore rosso in giorno bovina 7 embrioni (Figura 5). Dopo aver rimosso i simboli dei geni non annotate e duplicato, solo 6.765 simboli di geni unici è lasciato per l'analisi PANTHER.
Questi 6.765 geni rappresentano i trascritti di RNA uniche espresse nella blastocisti bovina 7 ° giorno. Al fine di trovare il processo biologico specifico per blastocisti bovina, PANTHER overrepresentation prova viene eseguita. I primi 10 ID Gene Ontology (GO) periodo con il più alto indice di piegatura arricchimento è selezionato (Figura 6). In generale, questi termini GO specifici largamente rappresentano il processo di divisione cellulare attiva come mitosis e la segregazione dei cromosomi, regolazione del ciclo cellulare e l'inizio della traduzione citoplasmatica e mitocondriale.
Figura 1: Ozono-libera di sicurezza (A) e Array etichettatura di reazione (B). A) Ozone Free Box consiste di un'unità convertitore catalitico che ricicla l'aria e distrugge l'ozono e un sensore di ozono altamente sensibile per monitorare il livello di ozono all'interno della scatola durante prestazioni microarray. B) procedura di etichettatura e la matrice ibridazione svolgono all'interno della scatola per evitare la fluorescenza Cyanine 647 degrado colorante dall'ozono. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: PANTHER Gene Lista Analysis. Le frecce rosse indicano l'area ha bisogno di essere riempito. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Un Bioanalyzer rappresentativa elettroferogramma di RNA totale (A) e il Gel Immagine di Amplified RNA (B). A) Mostrando risultato complessivo con un valore RIN, la concentrazione di RNA e rapporto di rRNA. B) Il profilo di RNA amplificato dopo l'amplificazione a doppio turno. frammenti di RNA amplificati dovrebbero essere in un intervallo tra 200 e 800 bp. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Immagine di Array Intensità Map. (A) Una buona immagine di una sagoma serie che mostra canale verde e rosso corrispondono a Cyanine 547 e Cyanine 647 segnali dopo la scansione con elevata intensità di spot (indicato con il colore verde blu a sinistra) e bassa di fondo (indicato a destra con il blu scuro colore). (B) Una cattiva immagine di una sagoma matrice che mostra un'immagine molto elevata sfondo da canale rosso (indicato dal pannello superiore con il simile colore verde blu dall'immagine di Cyanine 647 intensità spot). Colore grafico indica l'intensità del segnale con valori numerici corrispondenti a diversi colori. Il valore dell'intensità del segnale è il più basso nella gamma di colore blu scuro. Cliccate qui per vedere una grander Versione di questa figura.
Figura 5: MA Plot per il giorno 7 bovino embrione espressione genica profilo. 20,826 macchie rosse rappresentano i segnali positivi di cui sopra segnali di fondo. macchie di sfondo sono evidenziati in colore nero. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Gli ID Term Top 10 Gene Ontology (GO) con il più alto Fold arricchimento indice. Questi termini GO specifici in gran parte rappresentano il processo di divisione cellulare attivo, come la mitosi e la segregazione dei cromosomi, regolazione del ciclo cellulare e l'avvio di citoplasmatica e mitocondriale transmento. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Campione | Numero di embrioni | Digitare | Qualità morfologica degli embrioni | Concentrazione di RNA (pg / mL) | RIN | RNA totale utilizzato per l'amplificazione (pg) | Concentrazione di RNA amplificato (ng / mL) | ||||||||
| S1 | 4 | blastocisti | Grade 1 & 2 | 101 | 8.6 | 858.5 | 3.498,4 | ||||||||
| S2 | 1 | blastocisti | grado 2 | 142 | 7.4 | 1207 | 1.682,4 | S3 | 2 | blastocisti | grado 1 | 135 | 8.8 | 1.147,5 | 3.185,3 |
| S4 | 3 | blastocisti | grado 1 | 177 | 9 | 1.504,5 | 2.906,4 | ||||||||
| S5 | 5 | blastocisti | grado 1 | 636 | 8.3 | 5406 | 3.437,5 | ||||||||
| S6 | 3 | blastocisti | Grade 1 & 2 | 159 | 9.1 | 1.351,5 | 1.689,8 | ||||||||
| S7 | 3 | blastocisti | grado 1 | 154 | 9 | 1309 | 4.507,1 | ||||||||
| S8 | 4 | blastocisti | grado 1 | 304 | 8.5 | 2584 | 3.089,3 | ||||||||
| S9 | 5 | blastocisti | grado 1 | 282 | 9.1 | 2397 | 3.917,8 | ||||||||
| S10 | 6 | blastocisti | Grade 1 & 2 | 374 | 9.4 | 3179 | 2979 | ||||||||
| S11 | 5 | blastocisti | grado 1 | 272 | 9.3 | 2312 | 2576 | ||||||||
| S12 | 3 | blastocisti | grado 1 | 206 | 9 | 1751 | 2.567,9 |
Tabella 1: campione e informazioni RNA. La concentrazione e la qualità dell'RNA devono essere valutate dopo l'estrazione. integrità dell'RNA e la concentrazione possono essere valutate da qualsiasi Bioanalyzer. RNA numero integrità dovrebbe essere più di 7,0. La concentrazione di RNA dovrebbe essere esaminata per strumento spettrofotometro dopo l'amplificazione. Embryqualità o è stata valutata secondo il manuale della Società Internazionale Embryo Transfer (3 ° ed., Savoia, IL).
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Discussion
Il primo problema di effettuare analisi di microarray usando Giorno 7 embrioni di bovini non è sempre una quantità sufficiente di RNA di alta qualità per lo studio dell'espressione genica. estrazione di RNA fenolo Tradizionale / cloroformio e metodo di precipitazione in etanolo non è raccomandato per Giorno 7 embrioni, con conseguente bassa resa e la possibile fenolo avanzi di inibire la reazione di amplificazione di RNA. Invece, un metodo basato su colonne standard è preferibile isolare l'RNA totale e quindi eluire l'RNA con tampone di eluizione minimo per aumentare la concentrazione. Una media di 780 pg di RNA totale per ogni embrione viene ottenuto in studio che è paragonabile con altri rapporti che utilizzano una metodologia identica 26 e lo stesso RNA kit di estrazione 27, 28 utilizzati attualmente. Per l'estrazione dell'RNA, si raccomanda di sciogliere precipitato prima dell'uso mescolando accuratamente o riscaldare il flaconcino tampone di estrazione di ri-sciogliere il tampone di estrazione primausare. Inoltre, il tempo di incubazione è importante anche per la resa di RNA in fase di estrazione. Il tempo di incubazione meno di un pieno 30 minuti a 42 ° C ridotto rendimento RNA.
Sulla colonna DNasi digestione è necessario rimuovere la contaminazione del DNA genomico durante la purificazione dell'RNA totale. L'enzima DNasi è molto sensibile al vortex e centrifugare. Pertanto, DNase e tampone devono essere miscelati delicatamente per inversione.
La qualità del RNA è molto importante in microarray e campioni con un RIN inferiore a 7 non dovrebbero essere considerati per l'ibridazione. Nel corso di studio, i profili di RNA totale ottenuti da Bioanalyzer sono simili a quelli osservati in precedenza negli studi da blastocisti bovina 26, 27. Vale la pena di notare che quando si usa embrioni pre-tratteggiati, in particolare RNA preparati da ovociti ed embrioni prima materna transizione embrionale, il valore RIN è spesso inferiore 7 rispettol'RNA totale da giorno 7 embrioni e questo è dovuto ad una variazione del rapporto 28S / 18S rRNA 27.
La quantità di RNA estratto da embrioni di bovini non è sufficiente per la piattaforma ibridazione, di conseguenza, è necessaria l'amplificazione di RNA. Ci sono diversi metodi disponibili per l'amplificazione di RNA come la PCR, in vitro trascrizione (IVT), e Ribo-SPIA (singolo iniettore isotermico di amplificazione). Sebbene il secondo metodo è più veloce e in un giorno fornisce materiale sufficiente per array, è richiesto almeno 5 ng come materiale 29 di partenza. Quindi, abbiamo scelto il metodo IVT che è in grado di lavorare con i materiali di partenza bassi di 12 (non più di 100 pg). Inoltre, è già stato testato per amplificare RNA totale estratto da bovini embrione successo 29. Nel corso di studio, il nostro metodo di amplificazione prodotta ~ 28 mg di RNA amplificato per embrione da 598 RNA totale pg per embrione. Additioinfine, dopo l'amplificazione a doppio turno, i nostri campioni ha mostrato un profilo simile e la gamma dimensioni adeguate (tra 200 e 800 bp), che sono in accordo con studi precedenti 13, 15.
In questo protocollo, abbiamo utilizzato un non-enzimatica protocollo di etichettatura, cianina platino-linked (Cyanine 547 e Cyanine 647) coloranti. Questo metodo consente l'etichettatura di RNA amplificato o non amplificato. Avendo fase di amplificazione prima di etichettatura permette di utilizzare nucleotidi naturali, portando a rendimenti più elevati RNA amplificati, ridurre i pregiudizi e generare frammenti più lunghi rispetto al metodo enzimatico. I Cyanine 547 e 647 Cyanine coloranti sono comuni coloranti fluorescenti raccomandano per array a due colori. Tuttavia, Cyanine 647 colorante è sensibile alla degradazione dell'ozono. monitor di ozono tenuto in mano dovrebbe essere usato per assicurarsi che il livello di ozono al di sotto di 2 ppb. Inoltre, ambiente privo di polvere è necessario per evitare polvere cadere nella soluzione di ibridazione o during scansione.
esperimento microarray può essere progettato in approccio di uno o due colori. Ogni approccio sperimentale ha alcuni vantaggi e svantaggi. Utilizzando i disegni a due colori riduce il rumore variabilità e di fondo, permette la comparazione diretta e per il ciclo disegna con la definizione di un campione di riferimento comune. Sebbene pregiudizi specifici colorante può incidere in maniera sostanziale i risultati quando gli esperimenti vengono eseguiti utilizzando i disegni a due colori, questi pregiudizi possono essere mitigati eseguendo dye swap. Tale replica tecnico aggiunge ai costi sperimentali, ma può migliorare sia la precisione e la sensibilità nella misurazione differenziale espressione 31.
Confrontarle con altre software di bioinformatica (come gorilla) PANTHER permette il confronto di dati con Bos taurus genoma come riferimento. I nostri risultati indicano che durante il 7 ° giorno bovina sviluppo embrionale i seguenti componenti biologiche e funzioni sono coinvolti: regolazione della metafase / ANAPtransizione Hase del ciclo cellulare, la regolazione di transizione mitotico metafase / anafase, regolazione della segregazione dei cromosomi, traslazione mitocondriale, la proteina K48-linked ubiquitination, ER al Golgi trasporto delle vescicole-mediata, processo catabolico mRNA nucleare trascritto, iniziazione traslazionale, sorella mitotico cromatidi segregazione , divisione nucleare mitotico.
I protocolli presentati in questo documento, dalla marcatura fluorescente del RNA amplificato per la scansione di array devono essere eseguiti con la consapevolezza in più dei fattori ambientali di cui sopra per mantenere dati di alta qualità.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| RNase-Free DNase Set (50) | Qiagen | 79254 | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Arcturus RiboAmp HS PLUS Kit | Applied Biosystems | KIT0505 | |
| 2100 Bioanalyzer Instruments | Agilent Technologies | G2940CA | |
| RNA Screen Tape | Agilent Technologies | 5067-5576 | |
| ULS Fluorescent Labeling Kit | Kreatech Diagnostics | EA-021 | |
| Custom Gene Expression Microarrays | Agilent Technologies | G2514F | |
| Agilent Gene Expression wash buffer 1 | Agilent Technologies | Part #5188-5325 | |
| Agilent Gene Expression wash buffer 2 | Agilent Technologies | Part #5188-5326 | |
| 2x Hi-RPM Hybridization buffer | Agilent Technologies | Part #5190-0403 | |
| 25x Fragment buffer | Agilent Technologies | Part #5185-5974 | |
| 10x GE Blocking Agent | Agilent Technologies | Part #5188-5281 | |
| Stabilization and drying solution | Agilent Technologies | Part #5185-5979 | |
| Gasket slides enabled by Agilent SureHyb techonolgy | Agilent Technologies | G2524-60012 | Pack of 20 gasket slides, 4 microarrays/slide |
| Two-Color RNA Spike-In Kit | Agilent Technologies | Cat# 5188-5279 | |
| GenePix 4000B array scanner | Molecular Devices | GENEPIX 4000B-U | |
| Ozone Free Box | BioTray | OFB_100x200 | |
| GAL file | Agilent Technologies | - |
References
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