Mit dem murinen ABC transporter Bcrp1 (ABCG2) als Beispiel in-silico - Protokolle werden dargestellt , um alternative Promotor Gebrauch in Gene in Mausgeweben exprimiert erkennen und die Funktionalität der alternativen Promotoren unter Verwendung von Reporter - Assays identifiziert , zu bewerten.
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Methodenartikel
Methoden Alternative Promoter Verwendung und Transkriptions-Verordnung von Murine Bcrp1 zu entdecken
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Genexpression in verschiedenen Geweben wird häufig durch alternative Promotoren gesteuert, die bei der Synthese der mRNA resultieren mit einzigartigen - in der Regel nicht-translatierten - erste Exons. Bcrp1 (ABCG2), der murine Ortholog des Protein ABC transporter Breast Cancer Resistance (BCRP, ABCG2) hat mindestens vier alternative Promotoren, die von den entsprechenden vier alternativen ersten Exons hergestellt bezeichnet sind: E1U, E1A, E1B und E1C. Hier in-silico - Protokolle werden vorgestellt für Bcrp1 alternative Promotor Gebrauch zu prognostizieren. Weiterhin sind, reporter Assayverfahren beschrieben Reporterkonstrukten für alternative Promotoren zu erzeugen, und die Funktionalität von putativen Promotoren stromaufwärts von den alternativen ersten Exons zu bestimmen, die gekennzeichnet sind.
Einleitung
Mehr als die Hälfte der menschlichen Gene sind 1 durch alternative Promotoren geregelt. Jede alternative Promotor kann regulatorische Elemente enthalten, die sich von denen in anderen alternativen Promotoren voneinander verschieden sein können. Der Promotor (en) in einem Gewebe verwendet werden, können sich von denen in einem anderen Gewebe verwendet werden, unterscheiden. Beispielsweise ist es möglich, dass die Aktivierung eines bestimmten Signalwegs die alternative Promotor für ein Gen in einem Gewebe verwendet auslösen können, aber keine Wirkung auf oder eine separate alternative Promotor für das gleiche Gen unterdrücken, die in einem anderen Gewebe ver....
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Protokoll
1. In Silico Vorhersage von alternativen ersten Exons von Bcrp1 Mit BLAST - Analyse von Maus - EST - Datenbank
Hinweis: Dieses Protokoll beschreibt, wie die Maus ausgedrückt Sequenz-Tag (EST) Datenbank für ESTs mit Sequenzähnlichkeit zu suchen, um Exon 2 von Bcrp1 (die die Translationsstartstelle enthält) und dann, wie die passenden EST-Sequenzen zu genomischen Sequenzen auszurichten ihre zu ermitteln Lage in der Maus Bcrp1 Gen in Bezug auf das 5'-Ende von Bcrp1 Exon 2.
- Erhalten Sie die Sequenz für Maus Bcrp1 Exon 2 durch die mRNA Referenzsequenz ID Eingeben (NM_011920.3) in das Suchfenster des Ensembl Genome Brows....
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Ergebnisse
Identifizierung von Bcrp 1 alternative Promotor Nutzung in Maus Hoden durch die Analyse der Leader - Exons
Wenn die EST - Datenbank bei NCBI sondiert wurde (April 2015) , erläutert die Schritte unter Verwendung von in Protokoll 1, fanden die ESTs , die mit dem 5' - Ende von Exon 2 in Bcrp 1 - mRNA sind in Tabelle .......
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Diskussion
Die Mehrzahl der Methoden und repräsentative Ergebnisse sind in früheren Arbeit mit dem Titel beschrieben "B CRP1 Transkription in Maus Hoden wird durch einen Promotor kontrolliert vor einem neuen ersten Exons (E1U) durch steroidogenen factor-1 reguliert" , die im Jahr 2013 5 veröffentlicht . Zusätzlich zu den hier gezeigten repräsentativen Ergebnissen, sofern die vorherige Papier Schätzungen von alternativen ersten Exons Nutzungs 5'-RACE PCR und RT-PCR-Methodik. Darüber hinaus.......
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Offenlegungen
Douglas D. Ross und der University of Maryland, Baltimore halten Patentrechte für die menschliche BCRP.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von Merit Review Awards Douglas D. Ross und Arif Hussain aus dem Department of Veterans 'Affairs unterstützt.
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Materialien
SOFTWARE:
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| COMMERCIAL BIOLOGIC MATERIALS AND KITS: | |||
| First Choice RLM-RACE kit | Ambion Inc., Austin, TX, derzeit erhältlich über Life Technologies | AM1700 | 5'-RACE PCR-Kit |
| TOPO TA Klonierungskit | Life Technologies | K450001 | Dieses Kit enthält die chemisch kompetenten TOP10 E. coli Bakterien. |
| T4 DNA-Ligase-Schnellligationskit | New England Biolabs | M2200 | |
| Faststart High-Fidelity Taq-DNA-Polymerase | Sigma-Aldrich/Roche | 3553400001/RMB-4738284001 | Enthält eine High-Fidelity-Taq-Polymerase-Enzymmischung |
| XtremeGENE HP DNA-Transfektionsreagenz | Roche | 6366236001 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay Kit | Promega | E1910 | Enthält den pGL3-basischen leeren Reportervektor (Glühwürmchen-Luziferase), den pRLTK-Renilla-Luziferase-Exprimationsvektor und andere Kontrollvektoren. |
| QIAprep | Qiagen | 27104 | Für Plasmid miniprep - Isolierung und Reinigung von Plasmid-DNA aus Bakterienkolonien |
| pCR2.1 Vektor | Teil des TOPO TA Klonierungskits | ||
| pGL3-basische Luciferase mit Vektor | Promega | E1751 | |
| pRL-TK Renilla Luciferase exprimierender Vektor | Promega | E2241 | |
| Bakterielles künstliches Chromosom | BACPAC Resources Center, Kinder s Krankenhaus Oakland Research Institute, Oakland, CA | RP23-285A12 und RP24-314E24 | http://bacpac.chori.org/clones.htm |
| REAGENTS/CHEMICALS/MEDIA/SUPPLIES | |||
| TRIzol | Life Technologies | 15596026 | |
| Wizard® SV Gel und PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | Nützlich für die Reinigung von PCR-Produkten nach dem Aufschluss mit Restriktionsendonukleasen |
| CRYOVIALS | Denville Scientific | V9012< | |
| Ensembl software | Ensembl Projekt | http://Ensembl.org | Das Projekt Ensembl erstellt Genomdatenbanken für Wirbeltiere und andere eukaryotische Arten und stellt diese Informationen online frei zur Verfügung. |
| Strahlsoftware | NCBI | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD= Web& PAGE_TYPE=BlastHome | |
| Primer 3 Software | Simgene | http://simgene.com/Primer3 | Nützlich für das Entwerfen von Primern für 5'-RACE PCR |
| NCBI Nukleotiddatenbank | NCBI | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/ | |
| CELL LINES: | |||
| TM4 murine Sertoli Zellen | ATCC, Manassas, Virginia | CRL-1715™ | |
| INSTRUMENTS: | |||
| Luminometer | Turner Biosystems | TD-20/20 | Dies ist ein relativ preiswertes, manuell betriebenes Luminometer. Es sind auch automatisierte Systeme vom selben Hersteller erhältlich, die 96-Well-Platten verwenden. |
| NanoDrop Spektralphotometer | Thermo Scientific, Inc. | Das NanoDrop 2000 | Spektralphotometer kann sehr kleine Probenmengen verwenden |
| DU 800 UV/VIS-Spektralphotometer und Software für die Nukleinsäureanalyse II | BeckmanCoulter Inc, Fullerton, CA | DU 800 |
Referenzen
- Kimura, K., et al. Diversification of transcriptional modulation: large-scale identification and characterization of putative alternative promoters of human genes. Genome Res. 16 (1), 55-65 (2006).
- Doyle, L. A., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
