Summary
Con el murino transportador ABC BCRP1 (Abcg2) como un ejemplo, en-silico protocolos se presentan para detectar el uso de promotor alternativo en los genes expresados en tejidos de ratón, y para evaluar la funcionalidad de los promotores alternativos identificados mediante los ensayos de reportero.
Abstract
La expresión de genes en diferentes tejidos es a menudo controlado por promotores alternativos que resultan en la síntesis de ARNm con únicas - por lo general no traducidas - primeros exones. BCRP1 (Abcg2), el ortólogo murino de la mama ABC transportador de proteína de resistencia al cáncer (BCRP, ABCG2), tiene por lo menos cuatro promotores alternativos que son designados por los correspondientes cuatro primeros exones alternativos producidos: E1U, E1A, E1B, y E1C. En este documento, en silico protocolos se presentan para predecir el uso promotor alternativo para BCRP1. Además, se describen métodos de ensayo reportero para producir construcciones de reportero de promotores alternativos y para determinar la funcionalidad de los promotores putativos aguas arriba de los primeros exones alternativos que se identifican.
Introduction
Más de la mitad de los genes humanos están regulados por promotores alternativos 1. Cada promotor alternativo puede contener elementos reguladores que pueden ser diferentes de los de otros promotores alternativos. El promotor (s) utilizado en un tejido puede diferir de los utilizados en otro tejido. Por ejemplo, es posible que la activación de una vía de señalización dado puede desencadenar el promotor alternativo para un gen utilizado en un tejido, sin embargo, no tienen efecto sobre o reprimir un promotor alternativo separado para el mismo gen que se utiliza en otro tejido.
La expresión del gen BCRP1 se rige por los promotores alternativos. BCRP1 es el ortólogo murino del gen humano de mama proteína de resistencia al cáncer (BCRP). BCRP es un transportador de casete de unión a ATP (ABC), ABCG2 2, 3 designado formalmente. Como una proteína de la membrana plasmática apical, funciones BCRP / BCRP1 de flujo de salida de una amplia variedad de sustratos naturales y xenobióticos
A principios de trabajo para entender la regulación de la expresión de BCRP en células normales y neoplásicas, se realizó 5 'rápida amplificación de cDNA extremos (5'-RACE) análisis de ARNm de BCRP para determinar su sitio de inicio de la transcripción exacta 13. No sólo eran múltiples sitios de inicio de la transcripción que se encuentran; También se encontraron tres formas alternativas del primer exón, que a su BCRP es sin traducir. Estos primeros exones alternativos - designados E1a, E1b, E1c - se expresaron de manera diferente en una variedad de tejidos humanos. Dos variantes adicionales primer exón fueron descubiertos en una búsqueda BLAST de la base de datos de EST humano utilizando el segundo exón del BCRP 13. Cuatro partidos revelaron una primera exón> 70 kb aguas arriba del exón 2 que fueron designados E1U; otros cuatro partidos reveló ARNm de BCRP que carecía de un primer exón del todo, que fueron designados E1- 13. La presencia de exones líder alternativos se considera que es una manifestación del uso promotor alternativo 14.
En ratones, cuatro exones primera alternativa de BCRP1 se describen que pueden corresponder a otros promotores que regulan la transcripción BCRP 1 en diferentes tejidos de ratón; estos exones / promotores se designan E1U, E1A, E1B y E1C, y se encuentran a unos 70, 58, 15 y 5 kb aguas arriba del exón 2 BCRP1 5, 15. Se encontró que la isoforma E1A ARNm ser predominante en Murine las células madre hematopoyéticas, corazón, pulmón, bazo y cerebro, mientras que la isoforma E1B se expresó en intestino de ratón, células de hígado fetal, y las células precursoras eritroides en la médula ósea 5, 15. El promotor aguas arriba de E1B ha demostrado ser el principal promotor alternativo de gobierno BCRP1 transcripción en intestino de ratón, regulada al menos en parte, por-cíclico-fosfo AMP proteína elemento de respuesta de unión (p-CREB) y un elemento de respuesta CREB única para esa alternativa promotor BCRP1 16. La isoforma E1C mRNA se expresa predominantemente en el hígado murino adulto y riñón 5. La isoforma E1U es indetectable en la mayoría de los tejidos a prueba a excepción de testículo murino, donde es la isoforma predominante expresado 5. BCRP1 expresa en los testículos de ratas se encuentra en ambas uniones endoteliales (células cerradas, myoid peritubulares y células de Sertoli) somáticas y las células germinales (en el endotelio seminíferos, donde se puede proteger espermátidas la última etapa 4). el region aguas arriba de E1U contiene un elemento de respuesta funcional para steroidogenic factor 1 (SF-1) 5. BCRP1 ARNm y proteínas se reducen notablemente en los testículos de SF-1 knockout mice específicos de células de Sertoli, lo que sugiere que la expresión BCRP1 en células de Sertoli murinas se controla mediante SF-1 5.
Los protocolos presentados detalle métodos para detectar exones primera alternativa de BCRP1 en silico, y establecer reportero ensayos basados en la luciferasa para supuestos promotores aguas arriba de los primeros exones alternativos identificados.
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Protocol
1. predicción in silico de los primeros exones alternativos de BCRP1 Uso del análisis BLAST de la base de datos de EST de ratón
Nota: Este protocolo se describe cómo buscar la etiqueta de secuencia expresada ratón (EST) base de datos de EST con similitud de secuencia con el exón 2 de BCRP1 (que contiene el sitio de iniciación de la traducción) y luego la forma de alinear las secuencias EST que coinciden con las secuencias genómicas para determinar su ubicación en el gen BCRP1 ratón en relación con el extremo 5 'de BCRP1 exón 2.
- Obtener la secuencia de BCRP1 ratón exón 2 mediante la introducción del ARNm secuencia de referencia ID (NM_011920.3) en la ventana de búsqueda de la Ensembl Genome Browser 17, haga clic en "IR". En la siguiente pantalla, seleccione una secuencia de longitud completa (contiene 16 exones):
- En la siguiente pantalla ( "Pantalla basada en la transcripción"), seleccione "16 exones." Esto mostrará una pantalla que contiene la secuencia de todos los exones de BCRP1. Exón 2 de BCRP1 leerá "59; -AAAGGC ... TATCAA-3 ' "Los resultados obtenidos serán similares a los mostrados en la referencia 18..
- Haga clic en la opción "Descargar secuencia". En la siguiente pantalla, seleccione el formato FASTA, y luego haga clic en "Vista previa". En la siguiente pantalla, copiar la secuencia preliminar del exón 2 en el portapapeles.
- Navegue hasta la página 19 BLAST en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) sitio web 20.
- Seleccionar genoma "ratón". Pegue la secuencia del exón 2 del portapapeles en el cuadro de consulta.
- Seleccione "EST" en el menú desplegable de base de datos, optimizar para "secuencias muy similares," y luego elija "BLAST". El tiempo de ejecución se llevará unos minutos. Cuando la carrera BLAST se haya completado, aparecerá la página "Resultados".
- Bajo el subtítulo "Descripción" de la página "Resultados", seleccione "TODO", después en "Descargar" y luego "FASTA (completasecuencia) "en el menú desplegable, y luego elegir la opción" Continuar "aparecerá un archivo .txt;. abierta y copiar todo el archivo en el portapapeles El archivo .txt contiene las secuencias de todas las tecnologías ecológicamente racionales con alta similitud de secuencia con el exon2 BCRP1 ratón. pero no su posición en relación con el exón 2 del gen BCRP1.
Nota: Un análisis realizado el 15 de abril el año 2015 identificó 14 EST murinos que alineado con BCRP1 exón 2. Estos se enumeran en la Tabla 1.
- Identificar la localización de la secuencia de EST que es 5 'para el exón 2 en el gen BCRP1. El gen de ratón BCRP1 se encuentra en el cromosoma 6 NC_000072.6 contig (GI: 372099104).
- En la página de inicio BLAST bajo el subtítulo "explosiva Especializada", seleccione "Alinear dos (o más) secuencias utilizando BLAST (bl2seq)."
- Pegar el archivo de texto del portapapeles en el cuadro de búsqueda y escriba en el cuadro 372099104 secuencia sujeto. Optimizar para "secuencias muy similares" del programaselección, y la explosión de correr.
- Una vez que aparezca la ventana de resultados, ver las alineaciones gráficamente haciendo clic en "Gráficos" en la ventana "alineaciones". Usa las flechas derecha e izquierda y hacer zoom para centrarse en BCRP1 / Abcg2 y los alineamientos de secuencias.
- Guarde los alineamientos de secuencias: seleccionar "ALL" en el cuadro "Descripción", a continuación, en el menú desplegable "descarga" seleccionar "Hit mesa (CSV)," y haga clic en "continuar". Este archivo contiene la secuencia de alineación de BCRP1 exón 2 y la alineación de todas las secuencias EST con similitud de secuencia a BCRP1 exon2 relativos a la numeración de los nucleótidos en el cromosoma de ratón contig 6. Cada secuencia completa EST puede generar múltiples alineaciones que abarcan las regiones 5 'y 3' con el exón 2, incluyendo las secuencias solapantes con BCRP1 exón 2.
- A medida que la posición del extremo 5 'del exón 2 corresponderá al nucleótido 58.655.638 en el contig cromosoma 6, designar esto como1, y luego calcular la posición de las secuencias parciales de cada EST 5 'a 58.655.638. Los resultados para los 14 ESTs se dan en la Tabla 1.
Nota: Tenga cuidado para analizar secuencias EST que son 5 'a 1 (es decir, tienen un valor de nucleótidos negativo) como posibles primeros exones. Por ejemplo, en dos de los ESTs que alineados con BCRP1 exón 2 se muestra en la Tabla 1 (AI647825 y AI664571) la secuencia restante era 3 'al exón 2.
Función 2. Evaluación de BCRP1 Alternativa Promotor
- Diseño del reportero construye para BCRP1 E1U, E1A, E1B y promotores E1C
- Utilizando la secuencia de E1U obtenido a partir de la búsqueda de la base de datos de EST, designar a la primera 5 'de nucleótidos de E1U como 1.
- Obtener un cromosoma artificial bacteriano (BAC) en los clones de ratón cromosoma 6 que contiene la secuencia del gen BCRP1 / Abcg2 y la secuencia de al menos 100 kb aguas arriba de laBCRP1 / gen Abcg2 (véase la lista de materiales y equipos).
- Identificar un vector indicador adecuado, tal como la luciferasa plásmido reportero pGL3-Basic.
- Determinar los múltiples sitios de clonación en el vector reportero. KpnI, SacI, Mlu1, NheI, SmaI, XhoI, BglII y HindIII son los sitios de endonucleasas de restricción en el sitio de clonación múltiple del vector pGL3-Basic, en el 5 'a 3'.
Nota: La secuencia de los sitios de digestión está disponible de catálogos de productos de empresas que producen las enzimas de restricción. - Identificar todos los sitios de digestión en el exón E1U y la región 2 kb 5 'de E1U el uso de programas de software como DNA5. Identificar al menos dos sitios de digestión en el sitio de clonación múltiple pGL3-Basic que no se encuentran en E1U o la región aguas arriba 2 kb.
Nota: Asegúrese de elegir un sitio de restricción sitio de clonación múltiple para el cebador directo que se encuentra aguas arriba de la elegida para el cebador inverso para garantizar que la inserción Will estar en la orientación apropiada.
- Preparar adelante y cebadores para PCR que contienen las secuencias de los sitios de restricción múltiples sitios de clonación de endonucleasa de pGL3-basic seleccionados utilizando servicios de síntesis de genes / cebadores comerciales o software de selección de imprimación (véase la lista de materiales y equipos) revertir. Seleccionar un cebador directo localizado ~ 2 kb aguas arriba de la secuencia de E1U y un cebador inverso dentro de la secuencia E1U. Los cebadores utilizados en los autores anteriores trabajos incorporan un sitio SacI en el cebador directo y un sitio NheI en el cebador inverso, y se amplificaron la región genómica de aproximadamente -1906 a 64 con el primer nucleótido 5 'de E1U especificado como + 1 (véase el paso 2.1.1 anterior), y se proporcionan en la referencia 16.
- Amplificar por PCR la región genómica E1U usando estos cebadores, 0,01 a 1 g de la CAV, y PCR Master Mix contiene polimerasas Taq de alta fidelidad (véase la lista de materiales y equipos) con desnaturalización a95 ° C durante 30 segundos, luego 35 a 40 ciclos de PCR, con extensión a 72 ° C (2 min), y el recocido y las temperaturas de fusión en base a las características de fusión de los cebadores utilizados.
Nota: El uso de polimerasas Taq de alta fidelidad es esencial para la secuenciación de regiones promotoras que tienen un alto contenido de GC. Cuando el uso de grandes fragmentos de ADN genómico como un BAC como la plantilla, la estructura secundaria del ADN genómico puede hacer que sea difícil para los cebadores de PCR para unen. Si surge este problema, mejores resultados de la PCR se pueden obtener si la plantilla de ADN genómico largo se corta suavemente mediante sonicación antes de la reacción PCR. - Verificar la longitud del producto de PCR amplificado mediante la comparación contra una escalera de ADN de 1 kb mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8% TAE.
- Amplificar por PCR la región genómica E1U usando estos cebadores, 0,01 a 1 g de la CAV, y PCR Master Mix contiene polimerasas Taq de alta fidelidad (véase la lista de materiales y equipos) con desnaturalización a95 ° C durante 30 segundos, luego 35 a 40 ciclos de PCR, con extensión a 72 ° C (2 min), y el recocido y las temperaturas de fusión en base a las características de fusión de los cebadores utilizados.
- Se digiere el producto de PCR obtenido y el vector pGL3-Basic, utilizando las endonucleasas de restricción específicas para los sitios de digestión de restricción introducidos en el avance y retroceso cebadores según instrucciones suministradas con las enzimas de digestión de restricción.
- Purificar las reacciones de digestión usando gel SV comercial y kit de PCR Clean-Up Sistemas (véase la lista de materiales y equipos), siguiendo el protocolo del kit 21.
- Verificar la digestión y linealización del vector mediante la comparación contra el vector sin cortar utilizando electroforesis en gel de agarosa, luego se corta y se purifica la banda de ADN vector digerido. Medir la concentración del producto de PCR purificado y el vector se purificó usando espectrometría UV (véase la lista de materiales y equipos).
- Purificar las reacciones de digestión usando gel SV comercial y kit de PCR Clean-Up Sistemas (véase la lista de materiales y equipos), siguiendo el protocolo del kit 21.
- Prepare la construcción de reporte E1U ligando el purificada, la enzima de restricción digiere el producto PCR y la luciérnaga vector indicador de luciferasa pGL3-Basic (contenida en el kit de ensayo de indicador; véase la lista de materiales y equipo) a insertar: relaciones vectoriales de 11, 21 y 31, utilizando el "T4 ADN ligasa kit de ligación rápida" según las instrucciones del kit 22, produciendo de este modo la E1U rconstructo eporter, llamado pGL3-E1U.
- Utilice el plásmido pGL3-E1U para transformar bacterias para ampliar clonal pGL3-E1U siguientes instrucciones en el kit de clonación TA (véase la lista de materiales y equipos).
- Confirmar la orientación y la fidelidad del inserto mediante análisis de secuencia.
- Preparar reportero construye para E1A, E1B y E1C utilizando metodología similar a la de E1U. Confirmar la fidelidad de los insertos mediante secuenciación descrito en el apartado 2.1.5.2.
Nota: Los insertos de promotor para E1A, E1B y E1C deben ser aproximadamente -1875 / + 10, -1847 / + 60, y -1904 / + 83 con relación a la primera 5 'de nucleótidos (designada como 1) de E1A, E1B, o E1C, respectivamente.
- Métodos de ensayo de indicador
Nota: Estrategia general de los ensayos de reportero: el promotor putativo (región 5 'aguas arriba) de un gen se inserta en el sitio de clonación múltiple de un vector vacío "reportero" que contiene un "Reporter gen "(por ejemplo, luciferasa de luciérnaga) aguas abajo del sitio de clonación múltiple. El vector se transfecta luego en células eucariotas que expresan el gen de interés. Los factores que actúan en trans que promueven la expresión del gen de interés en estas células debe activar el promotor en el vector reportero transfectadas, causar la expresión de la luciferasa de luciérnaga, que puede ser fácilmente cuantificó con un ensayo de luminiscencia.- Seleccione la línea celular apropiada a utilizar para el ensayo de indicador.
Nota: Para evaluar la actividad del constructo reportero de promotor alternativo E1U, es necesario transfectar que constructo en células que expresan BCRP1 bajo el control del promotor E1U. La línea de células de Sertoli murino TM4 (véase la lista de materiales y equipo) y expresa la proteína BCRP1 BCRP1 ARNm contiene E1U, así como E1A, E1B, y E1C 5. Como control negativo, considerar el uso de una línea celular que no expresa la proteína BCRP1 o ARNm. - Cultura del ce TM4LLS en placas de 24 pocillos a una densidad inicial de 200.000 células / pocillo en una mezcla 1: 1 de medio F12 de Ham y medio de Eagle modificado de Dulbecco con bicarbonato de sodio 1,2 g / L, HEPES 15 mM suplementado con suero de caballo al 5%, 2,5% suero fetal bovino, penicilina (100 UI / ml) y estreptomicina (100 mg / ml), a 37 ° C, 5% de CO 2, como se describe anteriormente 5.
- Seis horas después de colocar las células en cultivo, transfectar las células con 0,2 g de vacío vector pGL3-basic o con 0,2 g de vector pGL3 que contiene el E1U -1906 / + 64 o -1875 / + 10 E1A o -1847 / + 60 E1B o -1904 / + 83 E1C BCRP 1 deleción construir junto con 4 ng de pRL-TK (una luciferasa que expresan vector de Renilla) como control interno, utilizando un kit de transfección de ADN comercial y el protocolo del fabricante 23 (véase la lista de materiales y equipos) .
- 30 horas después de la transfección, retire el medio de crecimiento de la cultured células transfectadas. Se lavan las células una vez con 200 l de PBS, a continuación, eliminar la solución de lavado.
- Medida de la luciérnaga y la actividad de luciferasa de Renilla utilizando un kit comercial de acuerdo con los protocolos del fabricante 24.
- Expresar la actividad para cada tubo como la relación de la actividad luciferasa de luciérnaga dividido por el control interno (Renilla luciferasa); resultados globales se expresan generalmente como la actividad de cada construcción informadora con relación a la de las células transfectadas con el vector básico pGL3 vacío, que se da un valor de 1.
- Seleccione la línea celular apropiada a utilizar para el ensayo de indicador.
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Representative Results
1 Identificación de BCRP alternativa la utilización del promotor en los testículos del ratón mediante el análisis de los exones líder
Cuando se sondeó la base de datos de EST en NCBI (abril de 2015) siguiendo los pasos descritos en el Protocolo 1, la EST encontraron que eran contiguo con el extremo 5 'del exón 2 en BCRP 1 mRNA se muestran en la Tabla 1, junto con su posición en genómica DNA con respecto al inicio del exón 2. Una EST derivada de C57BL / 6J testículo de ratón que es contiguo al exón 2 en BCRP 1 mRNA tiene secuencias en el ADN genómico de 70 kb aguas arriba del exón 2, que corresponde a E1U (Tabla 1). De manera similar, se detectaron ESTs correspondientes a E1A, E1B, y E1C. Cabe destacar que las dos ESTs correspondientes a E1C también contenían E1B empalmado al extremo 5 'de E1C. La ubicación de estos primeros exones predichos enrelación con BCRP1 exón 2 en el cromosoma de ratón 6 se muestra en la Figura 1.
La evaluación de la función del promotor BCRP 1 alternativo
Los resultados del ensayo de luciferasa típicos correspondientes a E1U, E1A, E1B y E1C construcciones de reportero de luciferasa promotor-transfectadas en células de Sertoli murino TM4 (ver sección 2.2) se muestran en la Figura 2A.
En trabajos anteriores, un elemento de respuesta SF-1 se prevé que sea en el promotor E1U 5. Si este SF-1 elemento de respuesta putativo está implicado en la regulación de BCRP1 transcripción en los testículos de ratón, a continuación, la mutación (como se describe en un trabajo anterior 5), de dicho elemento de respuesta en el constructo informador promotor E1U reducirá la actividad de la luciferasa producida por esa construcción cuando se transfecta enTM4 células. Los resultados de un experimento típico se muestran en la Figura 2B. La construcción mutada muestra una menor actividad de la luciferasa que el constructo de un-mutada, con actividad comparable a la del vector pGL3-basic vacío, incluso en células con expresión forzada de SF-1 (descrito en un trabajo previo 5). expresión forzada de SF-1 aumenta la actividad de la construcción de un-mutada, pero no la de la mutado.
Figura 1. Diagrama de la alineación genómica de tecnologías ecológicamente racionales con identidad de secuencia con BCRP1 exón 2 con el cromosoma murino 6. Estas alineaciones fueron identificados en una búsqueda BLAST dbEST realizado en abril de 2015. Se encontraron cuatro alineaciones distintas, correspondientes a BCRP1 exones primera alternativa E1U, E1A, E1B, y E1C. Esta figura se reproduce a partir de una publicación anterior 5. 
La Figura 2. Ensayo (A) Reportero para BCRP1 promotores E1U, E1A, E1B, y E1C en células de Sertoli TM4 Balb / c derivadas de las células. Los datos se expresan como la luminiscencia de la luciferasa de luciérnaga se normalizó a la de la luciferasa de Renilla, usando métodos descritos en la sección 2. Los datos mostrados son la media y la desviación estándar de tres experimentos diferentes, hecho en días diferentes. El asterisco indica una diferencia significativa con respecto al control pGL3 vector vacío utilizando la prueba t (p <0,01). Esta figura se reproduce a partir de una publicación anterior 5. (B) Efectos de la mutación del elemento de respuesta SF-1 en el BCRP1 E1U rePorter construir sobre la actividad de la luciferasa. reportero BCRP1 construye con la región de unión putativo SF-1 (mutado o no-mutado) se transfectaron en células TM4 con (SF-1 transfectadas) y sin (vector transfectadas) la expresión forzada de datos SF-1.Las muestran son la media de 3 experimentos diferentes, realizado en diferentes días; las barras de error representan desviaciones estándar. Para cada experimento, los ensayos individuales se realizaron por duplicado. En la figura, (A) indica una diferencia significativa del control pGL3 vector vacío (P <0,05), utilizando la prueba t; (B) significa una diferencia estadísticamente significativa en comparación con la construcción de promotor E1U utilizando la prueba t (P < 0,05). Esta figura se reproduce a partir de una publicación anterior 5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1. Explosiva busca de la base de datos de EST de ratón contra la secuencia del segundo exón del BCRP1 25 -28. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta tabla.
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Discussion
La mayoría de los métodos y resultados representativos presentados se describen en el trabajo anterior titulado "B CRP1 la transcripción en los testículos del ratón es controlado por un promotor aguas arriba de un nuevo primer exón (E1U) regulada por el factor 1 de esteroides, a la" que fue publicado en 2013 5 . Además de los resultados representativos representados aquí, en el documento anterior proporciona estimaciones de primera utilización exón alternativo utilizando 5'-RACE PCR y RT-PCR metodología. Además, en-silico se llevó a cabo la identificación de un elemento de respuesta SF-1 putativo en el promotor corriente arriba de E1U, y la inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) ensayos demostró que SF-1 unido al elemento de respuesta SF-1 putativo. Los estudios funcionales revelaron que en las células de Sertoli murinas, BCRP 1 transcripción se controla mediante SF-1 a través del elemento de respuesta SF-1 en el promotor E1U. Estos estudios funcionales incluyen la regulación positiva de SF-1 en las células TM4 por transfection o por el uso de un inhibidor de histona desacetilasa (vorinostat), que dio lugar a una mayor expresión de BCRP 1 E1U mRNA, y un aumento de la proteína BCRP 1 así como la actividad del promotor de BCRP 1 E1U en un ensayo de informador. Finalmente, estos estudios proporcionan evidencia de que en los testículos de los ratones knock-out para adultos de células de Sertoli específicos SF-1, la expresión de ARNm de BCRP 1 E1U, proteínas totales BCRP 1 mRNA, y BCRP1 disminuyeron marcadamente 5. El mismo trabajo también informó de los patrones de expresión de isoformas de ARNm BCRP1 en una variedad de tejidos murinos, incluyendo riñón, hígado, testículos, cerebro, corazón, pulmón, músculo, bazo y 5.
Los protocolos descritos aquí - con ayuda de la regulación específica de tejido de BCRP 1 como modelo - proporcionan un marco experimental fácil de desentrañar la complejidad de la transcripción de cualquier gen para determinar su diferencialexpresión en diversos tejidos o subtipos celulares. Se debe destacar que los resultados obtenidos a partir de los pasos del protocolo descrito para las evaluaciones a silico pueden ser dependiente del tiempo ya que los diversos sitios web que albergan el software y bases de datos utilizadas pueden estar sujetos a cambios. La metodología silico-en el que aquí se presenta utiliza buscar la base de datos EST (dbEST) como se informó anteriormente 29, que estima que aproximadamente el 18% de todos los genes humanos en el conjunto de datos EST emplean promotores alternativos. Buscando en la dbEST puede subestimar exones primera alternativa, ya que otros investigadores - utilizando un método "oligo-tapado" para producir 1,8 millones de secuencias del extremo 5 'del ADNc de muchos tejidos humanos - fueron capaces de identificar los sitios de inicio de transcripción putativo de los genes humanos y estimación que el 52% de los genes humanos RefSeq estudiados fueron posiblemente regulada por promotores alternativos 1. Curiosamente, este último estudio encontró que latejidos que utilizan promotores alternativos putativos los testículos eran más y el cerebro; Además, encontraron que los genes que codifican proteínas relacionadas con la señal de las vías de transducción eran más propensos a emplear otros promotores específicos de tejido 1. A pesar de los inconvenientes mencionados, dbEST análisis proporcionan una visión general de "uso 5 UTR de un gen particular en múltiples tejidos con el mínimo esfuerzo.
Aunque el análisis de dbEST ofrece una visión simplista en un principio el uso alternativo del exón, es muy recomendable realizar 5 'rápida amplificación de cDNA extremos análisis (5'-RACE) para verificar primer uso exón en una línea de células o tejidos bajo investigación. kits comerciales están disponibles para la 5'-RACE, con procedimientos detallados y directas proporcionadas por el fabricante (ver Lista de Materiales y Equipos). Aunque algo que consume tiempo, los estudios 5'-RACE proporcionan estimaciones reales de la presencia, así como la secuencia de primera ex alternativaons en el ARNm de interés; Además, la presencia de múltiples sitios de inicio de la transcripción también se puede detectar 13. Para asegurar la representación suficiente, se requiere la secuenciación de al menos 15 a 25 clones. Antes de la secuenciación, es esencial para eliminar las secuencias del vector contaminantes de productos de RACE 5 '. Si esto no se hace, el análisis BLAST puede fallar completamente para detectar una alineación de secuencia con el genoma del ratón. Una vez se establece primero el uso de exón, los hallazgos 5'-RACE se pueden utilizar para validar ensayos cuantitativos subsiguientes RT-PCR para primeros exones alternativos. En general, el trabajo anterior de los autores encontraron que existe una buena correlación entre el porcentaje de los primeros clones de ARNm exón recuperados por 5 'RACE y el porcentaje de producto de la PCR recuperado por un primer exón alternativo dado de la misma línea de tejido o célula 5. Además, se encontró una buena correlación entre las actividades de las construcciones del promotor de luciferasa de alternativas BCRP1 promotores de unand la expresión del correspondiente primer exón alternativo en una línea celular particular 5.
En la búsqueda de uso promotor alternativo específico de tejido, si se utilizan órganos completos, uno debe ser consciente de que los promotores / exones primera alternativa que se encuentran reflejarán la heterogeneidad del tejido del órgano, tales como elementos glandulares, vasos sanguíneos, estroma, etc. Para ejemplo, el testículo es una mezcla de (somática, Sertoli, myoid, y endotelial de Leydig) las células y las células germinales (haploides), así como la vasculatura. Para sondear para la expresión primer exón específico de tejido, será necesario aislar los tejidos específicos de los órganos.
Otros métodos se han reportado para identificar el uso promotor alternativo y regulación; sin embargo, estos requieren secuenciación de próxima generación y la bioinformática de computación capaz de analizar la gran cantidad de datos producidos. Estos métodos incluyen la secuenciación transcriptosome conjunto (ARN ss), y chip-sshistonas tales como H3K4me3, que se une preferentemente a los promotores 30. Aunque estos métodos pueden ser costosos para llevar a cabo de novo, cuando la atención se centra en la expresión de algunos genes y tejidos específicos, minería de datos existentes puede ser un enfoque más práctico.
Los ensayos para la estimación de la actividad del promotor que se presenta aquí emplean el vector pGL3-basic, que contiene una región de clonación múltiple aguas arriba del gen de la luciferasa de luciérnaga. La actividad del promotor se mide por la producción de luciferasa de luciérnaga, que se cuantifica con facilidad, después de la adición de cofactores y un sustrato luminiscente, mediante la medición de la luminiscencia en un luminómetro comercial (véase la lista de materiales y equipos). El vector pGL4 relacionados se puede hacer para contener marcadores seleccionables (por ejemplo, neomicina, higromicina, puromicina), lo que permite la producción de células transfectadas de manera estable. Los protocolos que figuran en este documento utilizan la transfección transitoria. Por lo general, los ensayos de reportero para promoactividad er terminado de utilizar co-transfección con un vector que expresa constitutivamente Renilla (Mar del pensamiento) de luciferasa (pRL-TK), para controlar las variaciones en el número de células y la eficiencia de la transfección. Un paso crítico en el establecimiento de un ensayo de promotor de un gen dado es para asegurarse de que el gen de interés se expresa en la línea celular que se transfectaron con la construcción de reporte. En segundo lugar, cuando el uso de promotor alternativo está presente, es importante utilizar la construcción de promotor que corresponde a la primera alternativa exón expresado en la línea celular transfectada. Por ejemplo, no se puede esperar para ver la luminiscencia para la construcción de promotor E1U que se transfectaron en células que expresan BCRP1 exclusivamente bajo el control del promotor de E1B. Alternativamente, como control negativo, la transfección de la construcción informadora en una línea celular que no expresa el gen o mRNA isoforma de interés deberían dar lugar a ninguna producción de luciferasa de luciérnaga.
La CONSECUENCIAS de uso promotor alternativo incluyen la producción de la misma proteína, la producción de proteínas con diferentes N-terminales, o la producción de diferentes proteínas 29. En el caso de BCRP1 / BCRP, múltiples (de tipo específico de tejido o de células) promotores controlan la producción de la misma proteína. Existe un patrón similar para el gen CYP19 (aromatasa) 29, 31. Los protocolos presentados aquí proporcionan los pasos fundamentales que uno puede utilizar para descifrar en un tejido o línea celular los complejos mecanismos de control transcripcional de una proteína de interés.
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Disclosures
Douglas D. Ross y la Universidad de Maryland, Baltimore tienen derechos de patente a BCRP humana.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por becas por mérito de revisión a Douglas D. Ross y a Arif Hussain, del Departamento de Asuntos de Veteranos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| COMMERCIAL BIOLOGIC MATERIALS AND KITS: | |||
| First Choice RLM-RACE kit | Ambion Inc., Austin, TX, currently available through Life Technologies | AM1700 | 5'-RACE PCR kit |
| TOPO TA cloning kit | Life Technologies | K450001 | This kit contains the TOP10 chemically competent E. coli bacteria. |
| T4 DNA ligase quick ligation kit | New England Biolabs | M2200 | |
| Faststart high-fidelity Taq- DNA polymerase | Sigma-Aldrich/Roche | 3553400001/RMB-4738284001 | Contains a high-fidelity Taq polymerase enzyme blend |
| XtremeGENE HP DNA transfection reagent | Roche | 6366236001 | |
| Dual-luciferase reporter assay kit | Promega | E1910 | Includes the pGL3-basic empty reporter vector (firefly luciferase), pRLTK renilla luciferase expressing vector, and other control vectors. |
| QIAprep | Qiagen | 27104 | For plasmid miniprep - isolation and purification of plasmid DNA from bacterial colonies |
| pCR2.1 vector | part of the TOPO TA cloning kit | ||
| pGL3-basic luciferase containing vector | Promega | E1751 | |
| pRL-TK Renilla luciferase expressing vector | Promega | E2241 | |
| Bacterial artificial chromosome | BACPAC Resources Center, Children’s Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CA | RP23-285A12 and RP24-314E24 | http://bacpac.chori.org/clones.htm |
| REAGENTS/CHEMICALS/MEDIA/SUPPLIES | |||
| TRIzol | Life Technologies | 15596026 | |
| Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | Useful for purifying PCR products following digestion with restriction endonucleases |
| CRYOVIALS | Denville Scientific | V9012 | |
| SOFTWARE: | |||
| Ensembl software | Ensembl project | http://Ensembl.org | The Ensembl project produces genome databases for vertebrates and other eukaryotic species, and makes this information freely available online. |
| Blast software | NCBI | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD= Web&PAGE_TYPE=BlastHome |
|
| Primer 3 software | Simgene | http://simgene.com/Primer3 | Useful for designing primers for 5'-RACE PCR |
| NCBI Nucleotide database | NCBI | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/ | |
| CELL LINES: | |||
| TM4 murine Sertoli cells | ATCC, Manassas, Virginia | CRL-1715™ | |
| INSTRUMENTS: | |||
| Luminometer | Turner Biosystems | TD-20/20 | This is a relatively inexpensive, manually operated luminometer. Automated systems are also available from the same manufacturer that utilize 96 well plates. |
| NanoDrop spectrophotometers | Thermo Scientific, Inc. | NanoDrop 2000 | Spectrophotometer can use very small quantities of sample |
| DU 800 UV/VIS spectrophotometer and Nucleic Acid Analysis II software | BeckmanCoulter Inc, Fullerton, CA | DU 800 | |
References
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