Ein kombiniertes 3D-Gewebezüchtungen<em&gt; In Vitro</em&gt; /<em&gt; In Silico</em&gt; Lungentumormodell für Hintergründe in bestimmten Mutations Drug Wirksamkeit vorhersagen

Claudia Göttlich; Lena C. Müller; Meik Kunz; Franziska Schmitt; Heike Walles; Thorsten Walles; Thomas Dandekar; Gudrun Dandekar; Sarah L. Nietzer

doi:10.3791/53885

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Methodenartikel

Ein kombiniertes 3D-Gewebezüchtungen

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DOI:

10.3791/53885

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6. April 2016

Claudia Göttlich^*¹ , Lena C. Müller^*¹ , Meik Kunz^*³ , Franziska Schmitt¹ , Heike Walles¹^,⁴ , Thorsten Walles² , Thomas Dandekar³ , Gudrun Dandekar¹^,⁴ , Sarah L. Nietzer¹

¹Department of Tissue Engineering and Regenerative Medicine (TERM), University Hospital Wuerzburg, ²Department of Cardiothoracic Surgery, University Hospital Wuerzburg, ³Department of Bioinformatics, University Wuerzburg, ⁴Translational Center Wuerzburg, Fraunhofer Institute Interfacial Engineering and Biotechnology IGB

^* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein dreidimensionales (3D) Lungenkrebsmodell, das auf einem biologischen Kollagengerüst basiert, um die Empfindlichkeit gegenüber nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC)-zielgerichteten Therapien zu untersuchen. Wir demonstrieren verschiedene Auslesetechniken zur Bestimmung des Proliferationsindex, der Apoptose und des epithelial-mesenchymalen Übergangsstatus (EMT). Die gesammelten Daten werden in ein in silico-Modell zur Vorhersage der Arzneimittelsensitivität integriert.

Zusammenfassung

In der vorliegenden Studie, kombiniert wir ein in vitro - 3D - Lungentumormodell mit einem in silico - Modell Vorhersagen der Arzneimittelreaktion zu optimieren basierend auf einem bestimmten Mutations - Hintergrund. Das Modell ist auf einem dezellularisierter Schweine Gerüst erzeugt, die gewebespezifische Eigenschaften in Bezug auf extrazelluläre Matrix-Zusammensetzung und Architektur einschließlich der Basalmembran wiedergibt. Wir standardisiert ein Protokoll, das innerhalb von 14 Tagen mit drei Tagen der medikamentösen Behandlung künstlichen Tumorgewebe Generation ermöglicht. Unser Artikel stellt einige detaillierte Beschreibungen von 3D - Auslese Screening - Techniken wie die Bestimmung des Proliferationsindex Ki67 - Färbung der Apoptose von Überständen von M30-ELISA und Beurteilung von epithelialen zu mesenchymale Transition (EMT), die hilfreiche Werkzeuge sind für die Bewertung der Wirksamkeit von therapeutischen Verbindungen. Wir konnten zeigen, eine Reduktion der Proliferation in unserem 3D-Tumormodell in 2D-Kultur verglichen, die relat isted der klinischen Situation. Trotz dieser geringeren Proliferation prognostiziert das Modell EGFR -targeted Droge Antworten korrekt entsprechend dem Status von Biomarkern wie durch einen Vergleich der Lungenkarzinomzelllinien HCC827 (EGFR -mutated, KRAS - Wildtyp) und A549 (EGFR Wildtyp - KRAS - mutiert mit der Tyrosin-Kinase - Inhibitor (TKI) Gefitinib behandelt). Um Drogen Antworten von fortgeschrittenen Tumorzellen zu untersuchen, wir EMT durch langfristige Behandlung mit TGF-beta-1 induziert, wie durch Vimentin / pan-Zytokeratin Immunfluoreszenzanfärbung beurteilt. Ein strömungs Bioreaktor wurde verwendet Kultur physiologischen Bedingungen einzustellen, die Gewebebildung verbessert. Darüber hinaus zeigen wir die Integration von Drogen Antworten auf Gefitinib Behandlung oder TGF-beta-1 - Stimulation - die Apoptose, Proliferationsindex und EMT - in ein Boolean in silico - Modell. Darüber hinaus erläutern wir, wie Arzneimittelreaktionen von Tumorzellen mit einem bestimmten Mutations-Hintergrund und Zählungerstrategies gegen Widerstand vorhergesagt werden. Wir sind zuversichtlich , dass unsere 3D - In - vitro - Ansatz vor allem mit seinen in silico Expansion für die präklinische Drogentests in realistischer Bedingungen als in 2D - Zellkultur einen zusätzlichen Wert liefert.

Einleitung

Die pharmazeutische Industrie steht vor hohen Ausfallraten von bis zu 95% im Bereich der Krebstherapie in der klinischen Phase verursacht enorme Kosten ^1-5. Ein Grund für diesen Mangel ist die Tatsache, dass zur Zeit die Wirksamkeit von potentiellen neuen Verbindungen bewertet wird in großem Maßstab Screenings auf 2D-Zellkulturen von Krebszelllinien, oder in Tiermodellen. Tiermodelle haben eine höhere Komplexität , aber es gibt entscheidende Unterschiede zwischen Mäusen und Menschen ^6,7. In den letzten zehn Jahren Modelle 3D Krebs verschiedene Ansätze wurden erzeugt , um die Lücke zwischen 2D - Kultur von Krebszelllinien und einem Komplex in....