Methodenartikel

Ein kombiniertes 3D-Gewebezüchtungen

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DOI:

10.3791/53885

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6. April 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Tissue Engineering and Regenerative Medicine (TERM), University Hospital Wuerzburg, 2Department of Cardiothoracic Surgery, University Hospital Wuerzburg, 3Department of Bioinformatics, University Wuerzburg, 4Translational Center Wuerzburg, Fraunhofer Institute Interfacial Engineering and Biotechnology IGB

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein dreidimensionales (3D) Lungenkrebsmodell, das auf einem biologischen Kollagengerüst basiert, um die Empfindlichkeit gegenüber nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC)-zielgerichteten Therapien zu untersuchen. Wir demonstrieren verschiedene Auslesetechniken zur Bestimmung des Proliferationsindex, der Apoptose und des epithelial-mesenchymalen Übergangsstatus (EMT). Die gesammelten Daten werden in ein in silico-Modell zur Vorhersage der Arzneimittelsensitivität integriert.

Zusammenfassung

In der vorliegenden Studie, kombiniert wir ein in vitro - 3D - Lungentumormodell mit einem in silico - Modell Vorhersagen der Arzneimittelreaktion zu optimieren basierend auf einem bestimmten Mutations - Hintergrund. Das Modell ist auf einem dezellularisierter Schweine Gerüst erzeugt, die gewebespezifische Eigenschaften in Bezug auf extrazelluläre Matrix-Zusammensetzung und Architektur einschließlich der Basalmembran wiedergibt. Wir standardisiert ein Protokoll, das innerhalb von 14 Tagen mit drei Tagen der medikamentösen Behandlung künstlichen Tumorgewebe Generation ermöglicht. Unser Artikel stellt einige detaillierte Beschreibungen von 3D - Auslese Screening - Techniken wie die Bestimmung des Proliferationsindex Ki67 - Färbung der Apoptose von Überständen von M30-ELISA und Beurteilung von epithelialen zu mesenchymale Transition (EMT), die hilfreiche Werkzeuge sind für die Bewertung der Wirksamkeit von therapeutischen Verbindungen. Wir konnten zeigen, eine Reduktion der Proliferation in unserem 3D-Tumormodell in 2D-Kultur verglichen, die relat isted der klinischen Situation. Trotz dieser geringeren Proliferation prognostiziert das Modell EGFR -targeted Droge Antworten korrekt entsprechend dem Status von Biomarkern wie durch einen Vergleich der Lungenkarzinomzelllinien HCC827 (EGFR -mutated, KRAS - Wildtyp) und A549 (EGFR Wildtyp - KRAS - mutiert mit der Tyrosin-Kinase - Inhibitor (TKI) Gefitinib behandelt). Um Drogen Antworten von fortgeschrittenen Tumorzellen zu untersuchen, wir EMT durch langfristige Behandlung mit TGF-beta-1 induziert, wie durch Vimentin / pan-Zytokeratin Immunfluoreszenzanfärbung beurteilt. Ein strömungs Bioreaktor wurde verwendet Kultur physiologischen Bedingungen einzustellen, die Gewebebildung verbessert. Darüber hinaus zeigen wir die Integration von Drogen Antworten auf Gefitinib Behandlung oder TGF-beta-1 - Stimulation - die Apoptose, Proliferationsindex und EMT - in ein Boolean in silico - Modell. Darüber hinaus erläutern wir, wie Arzneimittelreaktionen von Tumorzellen mit einem bestimmten Mutations-Hintergrund und Zählungerstrategies gegen Widerstand vorhergesagt werden. Wir sind zuversichtlich , dass unsere 3D - In - vitro - Ansatz vor allem mit seinen in silico Expansion für die präklinische Drogentests in realistischer Bedingungen als in 2D - Zellkultur einen zusätzlichen Wert liefert.

Einleitung

Die pharmazeutische Industrie steht vor hohen Ausfallraten von bis zu 95% im Bereich der Krebstherapie in der klinischen Phase verursacht enorme Kosten 1-5. Ein Grund für diesen Mangel ist die Tatsache, dass zur Zeit die Wirksamkeit von potentiellen neuen Verbindungen bewertet wird in großem Maßstab Screenings auf 2D-Zellkulturen von Krebszelllinien, oder in Tiermodellen. Tiermodelle haben eine höhere Komplexität , aber es gibt entscheidende Unterschiede zwischen Mäusen und Menschen 6,7. In den letzten zehn Jahren Modelle 3D Krebs verschiedene Ansätze wurden erzeugt , um die Lücke zwischen 2D - Kultur von Krebszelllinien und einem Komplex in vivo Tumor 6,8,9 zu überbrücken. Die Auswirkungen der 3D - Umgebung auf die Zelldifferenzierung und auch Signalisierung in mehreren Studien wurde Jahren gezeigt (z. B. durch Mina Bissell) 10,11. Heute sind viele 3D - Zellkulturmodelle zur Verfügung, wie Sphäroid - Kulturen, Hydrogele oder Mikrofluidik - Chips 12-16. Obwohl these-Modelle Komplexität im Vergleich zu herkömmlichen 2D-Kultursystemen zu verbessern, sie eine Gewebemikroumgebung meist fehlen, die bekannt ist, Tumor-tragenden Effekte und hat auch Auswirkungen auf die Arzneimittelwirksamkeit zu haben.

Um dieses Problem zu beheben, haben wir einen ein 3D - Modell Tumor auf der Basis eines biologischen Gerüst SISmuc (small-Darm-Submukosa + Schleimhaut) genannt , die von einem dezellularisierter Schweine Jejunum abgeleitet wird. Dadurch werden die Gewebearchitektur und wichtige Komponenten der ECM wie verschiedene Kollagene sowie der Basalmembran Struktur 17 erhalten. Diese einzigartige Funktion ist für die Tumormodellgeneration von Karzinomen von entscheidender Bedeutung, die von Epithelien und umfassen etwa 80% von soliden Tumoren entstehen. Darüber hinaus wird die Proliferationsrate in unserem Tissue-Engineering-Tumormodell reduziert im Vergleich zu den künstlich hohen Raten in 2D-Kultur erreicht. Wie Proliferation bei der Beurteilung der Wirksamkeit von Medikamenten ist ein wichtiger Parameter, Drogentests ist in unserem Modell ermöglicht in ähnlicherBedingungen in vivo Tumoren 17.

Um das Potenzial unseres Modells zu bewerten Biomarker-abhängige Wirksamkeit von Medikamenten , korrekt vorherzusagen, wir hier vorliegenden Daten für zwei verschiedene Lungenkrebszelllinien , die in ihrem EGFR -biomarker Status unterscheiden. Dieser Mutationsstatus hat begonnen routinemßig in NSCLC-Patienten bestimmt werden. Gezielte Behandlungen mit TKI wie der EGFR -Inhibitor Gefitinib gegen Tumoren eine aktivierende EGFR - Mutation zeigen hervorragende Ergebnisse tragen im Vergleich zu denen mit einer platinbasierten Chemotherapie 18-21.

Wir stellten verschiedene Techniken Auslesen, die zur Bewertung der Wirksamkeit Verbindung relevant sind. Weiterhin wird nach TGF-beta-1 - Stimulation sind wir in der Lage Verbindung Aktionen in Tumorzellen zu untersuchen, die die EMT - Prozess gestartet, der angenommen wird , ein wichtiger Schritt in der malignen Transformation 22,23 zu sein , und die mit dem Drogen resistan verbunden istce 24.

Das 3D-Modell Tumor ermöglichen die Überwachung zellspezifische Antworten auf gezielte Behandlungen, Chemotherapie oder Medikamentenkombinationen mit guten Kontrasten. Zur weiteren Verbesserung und Drogen-Screening zu beschleunigen und Widerstand zu begegnen, wird dies durch eine in silico Simulation ergänzt. Basierend auf einigen Versuchen kann der Tumor - Antwort in silico vorhergesagt werden , in Bezug auf das Ergebnis für eine breite Palette von Medikamenten und deren Kombinationen.

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Protokoll

1. Zweidimensionale (2D) Cell Culture

  1. Im Handel Tumorzelllinie HCC827 (DSMZ) zu erhalten. Kultur der Lunge Adenokarzinom - Zelllinie HCC827 (EGFR mutierten KRAS - Wildtyp) in RPMI-1640 mit 20% FCS ergänzt. Ändern Sie das Medium alle 2 - 3 Tage. Teilen die Zellen zweimal in der Woche. Zellen verwendet werden, bis Kanal 20 erreicht ist.
  2. Im Handel Tumorzelllinie A549 (DSMZ) zu erhalten. Kultur der Lungenkarzinomzelllinie A549 (EGFR Wildtyp - KRAS mutiert) in RPMI-1640 mit 10% FCS ergänzt. Führen Sie die Kultur wie oben angegeben. Zellen verwendet werden, bis Kanal 20 erreicht ist.
  3. Testen Sie die Zellen regelmäßig (alle 4 - 6 Wochen) für Verunreinigungen wie Mykoplasmen-Kontaminationen.
  4. Die Kultivierung A549 oder HCC827 Zellen auf Glasplättchen
    1. Platz 1 sterile Deckglas in jeder Vertiefung einer 24-Well-Platte mit einer Pinzette verwenden.
    2. Seed 50.000 Tumorzellen von beiden Zelllinien in einem Volumen von 500 & mgr; l in den Wells mitdie Glasplättchen sind.
    3. Kultur die Zellen bis zum Erreichen einer Konfluenz von 70% unter Standardkulturbedingungen (37 ° C, 5% CO 2). Während dieser Zeit absaugen das alte Medium mit einer Pasteurpipette und fügen 500 ul frisches Medium alle 2 - 3 Tage der Kultur.

2. Erzeugung von Tumor-Testsysteme auf einem biologische Kollagengerüsts

  1. Statische Kulturbedingungen
    1. Generieren Sie die dezellularisierter kleinen Darm-Submukosa + Schleimhaut (SISmuc) und befestigen Sie es zwischen zwei Metallringen, die so genannten Zelle Kronen, wie 25 in einer früheren Veröffentlichung beschrieben.
    2. Seed 100.000 Zellen entweder HCC827 oder A549-Zellen in einem Gesamtvolumen von 500 & mgr; l auf die Seite des ehemaligen Lumens des Darms in Zellkronen befestigt.
    3. Erlauben Tumorzellen 2 Stunden lang bei 37 ° C, 5% CO 2 anhaften. 1 ml Medium innerhalb der Zelle Krone und 1 ml außen.
    4. Kultur der TumorModell unter statischen Bedingungen bei 37 ° C, 5% CO 2 im Inkubator für 14 Tage. Ändern Kulturmedium alle 2 - 3 Tage. Daher aspirieren das Medium mit einer Pasteurpipette und Pipette 1 ml frischem RPMI mit der entsprechenden Menge von FCS mit (A549: 10%, HCC827: 20%) innerhalb der Zelle Krone und 1,5 ml des gleichen Mediums außerhalb.
  2. Dynamische Kulturbedingungen
    1. Stellen Sie den Tumortestsystem mit der dezellularisierter Matrix innerhalb der Zelle Kronen und Zellaussaat auf, als nach Absatz 2.1.1 bis 2.1.3 beschrieben.
    2. Kultur der Tumormodell unter statischen Bedingungen 37 ° C, 5% CO 2 im Inkubator für 3 Tage.
    3. Montieren Sie den autoklaviert Bioreaktor und legen Sie die ausgesäten SISmuc wie zuvor 25 veröffentlicht.
    4. Pipette 45 ml RPMI mit der entsprechenden Menge von FCS (A549: 10%, HCC827: 20%) in den Kolben und verbinden die nadelfreie Probenahmevorrichtung zu dem Rohrsystem zwischen dem Bioreaktor und derMedium Kolben.
    5. Setzen Sie den Bioreaktor in den Inkubator, schließen Sie es an die Pumpe und die Kultur der Tumormodell für weitere 14 Tage mit einer konstanten Mediumstrom (3 ml / min) bei 37 ° C, 5% CO 2.
    6. Ändern Sie den gesamten Kulturmedium nach 7 Tagen. Dazu bewegen Sie den Bioreaktor aus dem Inkubator unter einer Laminar-Flow-Haube. Saugen Sie das Medium in den Medien Kolben mit einer Pasteurpipette. Heben Sie den Bioreaktor, während Ansaugen des Mediums, in dem Schlauchsystem loszuwerden. Pipette 45 ml frisches Medium in den Kolben. Setzen Sie den Bioreaktor wieder in den Inkubator und verbinden Sie es mit der Pumpe.

3. Behandlung des statischen Tumormodell mit Gefitinib

  1. Kultur der Tumormodell wie in Abschnitt 2.1 beschrieben.
  2. Am Tag 11 der Kultur, RPMI / FCS mit 1 uM Gefitinib (2,5 ml für jede Zelle Krone) vorzubereiten. Saugen Sie das alte Medium aus den Vertiefungen mit einer Pasteurpipette und 1 ml vorbereitet RPMI / FCS / Gefitinib innen ter Zell Krone und 1,5 ml des gleichen Mediums außerhalb.
    HINWEIS: Die aufgetauten Gefitinib Stammlösung kann für eine Woche bei 4 ° C gelagert werden.
  3. Ändern Sie das Medium am Tag 13, wie unter Ziffer 3.2 beschrieben.

4. Die Stimulation des statischen Tumormodell mit TGF-beta-1 für EMT Induction

  1. Kultur der Tumormodell wie in Abschnitt 2.1 beschrieben.
  2. Am Tag 3 der Kultur, RPMI / FCS mit 2 ng / ml TGF-beta-1 mit dem Träger (2,5 ml für jede Zelle Krone) vorzubereiten. Saugen Sie das alte Medium aus den Vertiefungen mit einer Pasteurpipette und 1 ml vorbereitet RPMI / FCS / TGF-beta-1 im Inneren der Zelle Krone und 1,5 ml des gleichen Mediums außerhalb. 3 Tage bis zum Tag 14, wie unter 4.2 beschrieben - Änderungsmedium mit TGF-beta-1 alle 2 ergänzt.

5. Lesen-outs

  1. Entnahme von Proben für ELISA - Messungen
    1. Nehmen Sie Proben aus den Überständen von statischen (Abschnitt 2.1) und dynamisch (Abschnitt 2.2) Kultur währendBehandlung mit Gefitinib (Abschnitt 3) an den Tagen 11-14 der Kultur , wie in Abbildung 2 dargestellt. Zusätzlich nehmen eine Probe vor der Behandlung (T0).
    2. Unter statischen Kulturbedingungen, nehmen 100 ul Probe aus dem Inneren der Zelle Krone. Unter dynamischen Kulturbedingungen, schrauben Sie die Spritze an der Probenahmevorrichtung und nehmen Sie 1 ml Medium aus dem Bioreaktor-System. Speichern aller gesammelten Überstände bei -80 ° C, bis der ELISA durchgeführt wird.
  2. M30-ELISA für Apoptosis Quantifizierung
    1. Zur Quantifizierung der Apoptose in den Überständen der Zelltod-Assay gemäß den Anweisungen des Herstellers durchzuführen. Alle Reagenzien RT zu erreichen, bevor der Test durchgeführt wird.
    2. Vortex alle Reagenzien. Man löst den Waschtablette in 500 ml frischem entionisiertem Wasser. Verdünnen HRP-Konjugat mit 9,2 ml Konjugat-Verdünnungspuffer und mischen. Pipette 25 ul Standard oder Probe pro Vertiefung.
    3. In 75 ul des verdünnten HRP ConjuGate-Lösung pro Vertiefung. Decken Sie die Platte und Inkubation auf einem Schüttler für 4 Stunden bei RT. Waschen Sie die Platte manuell, 5-mal mit 250 ul Waschlösung vorbereitet.
    4. In 200 ul 3,3 ', 5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB) Substrat in jede Vertiefung. Inkubieren im Dunkeln bei RT für 20 min. In 50 ul Stopplösung in jede Vertiefung geben. Schütteln Sie die Mikrotiterplatte für 10 Sekunden und lassen Sie die Mikrotiterplatte für 5 min vor der Ermittlung der Absorption. Bestimmung der Extinktion bei 450 nm in einem Mikroplatten-Lesegerät. Berechnen Sie die Standardkurve und die Konzentrationen in den Proben ein geeignetes Programm für den Umgang mit ELISA-Typ Daten wie Herkunft.
  3. Beispiel Anfärben
    1. Befestigung, Paraffineinbettung und Schnittpräparation des 3D - Modells
      1. Befestigen Sie den ausgesäten SISmuc unter Verwendung von 2,5 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) pro Zelle Krone für 2 Stunden und binde sie in Paraffin
      2. Bereiten Sie 3 um Gewebeschnitte für die Färbung wie zuvor veröffentlicht25.
    2. Fixierung von Zellen gezüchtet in 2D Kulturbedingungen
      1. Bei 70% Konfluenz erreicht ist, waschen Sie die Zellen kultiviert auf Glasplättchen in 24-Well-Platte einmal mit PBS und fixieren Sie diese mit 500 ul 4% PFA / gut 10 min.
      2. Entfernen PFA und speichern die Deckgläser in der Well-Platte bedeckt mit PBS bei 4 ° C bis zur Färbung durchgeführt wird.
    3. H & E - Färbung
      1. Beflecken die rehydratisierten Schnitte mit Hematoxylin / Eosin als Übersicht Färbung nach Standardprotokollen.
    4. Immunfluoreszenzfärbung des 3D - Modells
      1. Für Immunfluoreszenzanfärbung, führen Sie eine Antigen-Retrieval die deparaffinierten und rehydriert Dias in einem Dampfgarer mit vorgewärmter Citratpuffer (pH 6,0) für 20 Minuten, indem.
        HINWEIS: Siehe Tabelle von Material und Ausrüstung, die für Citratpuffer vorbereitet.
      2. Die Objektträgerzu dem Waschpuffer (0,5 M PBS-Puffer + 0,5% Tween), Kreisabschnitte mit einem PAP Stift das erforderliche Volumen für Färbelösungen und Objektträger in einer Feuchtekammer zu minimieren.
      3. Block Gewebeschnitte mit 5% Serum von der Wirtsspezies der sekundären verwendeten Antikörper im Unterabschnitt 5.3.4.6 für 20 min bei RT.
      4. Entfernen Sie blockiert Serum vorsichtig die Folien zu einem Papiertuch klopfen und Anwendung der primären Antikörpers an die eingekreisten Abschnitte in einer Verdünnung gemäß den Anweisungen des Herstellers (Kaninchen anti Ki67 1: 100, Kaninchen anti Vimentin 1: 100, Maus anti pan-Zytokeratin 1 :100). Inkubieren O / N bei 4 ° C. Für double-Färbung muss primäre Antikörper aus verschiedenen Wirtsspezies verwendet werden.
      5. werden gründlich ungebundenen Antikörper mit Waschpuffer dreimal für 5 Minuten ab.
      6. Für den Nachweis von spezifischen Antigen-Antikörper-Bindungen gelten Sekundärantikörper in der Verdünnung 1: 400 zu den Abschnitten und für 1 h bei RT inkubiert.
      7. Abwaschen unbound Antikörper mit Waschpuffer dreimal 5 min.
      8. Montieren Sie die Folien mit einem wässrigen Medium DAPI haltigen Kerne Gegenfärben und lassen Sie sie trocknen O / N.
    5. Immunfluoreszenzanfärbung von 2D - kultivierten Zellen
      1. Entfernen PBS und decken die ausgesäten Glasplättchen mit 0,2% Triton-X100 in PBS für 5 min zur Permeabilisierung. Waschen der Glasdeckgläser mit Waschpuffer (0,5 M PBS-Puffer + 0,5% Tween) für 5 min.
      2. Führen Sie die Schritte 5.3.4.3 bis 5.3.4.7. Führen Sie alle Schritte in der Well-Platte auf einem Wippschüttler und entfernen Reagenzien durch Umdrehen der Platte.
      3. Zur Montage einen Tropfen wässrigen Medium vor Ort DAPI haltigen Kerne auf einem unbeschichteten Glasträger auf Gegenfärben und das Deckglas, um es mit den Zellen übertragen das Eindeckmedium mit einer Pinzette gegenüber. Lassen Sie es trocknen, bevor Bildgebung.
  4. Bestimmung der Proliferationsindex
    1. Führen Sie ImmunofluoreszenzAnfärbung gegen Ki67 gemäß Abschnitt 5.3.4. oder 5,3 5.
    2. Nehmen Fluoreszenzbilder der Gewebeschnitte oder 2D-kultivierter Zellen mit einem inversen Mikroskop. Verwenden Sie verschiedene Filter für Bilder von DAPI-Färbungen und von Ki67 Anfärbungen nehmen. Für die Quantifizierung verwenden 10 Bilder von 3D-Abschnitte oder 5 Bilder von 2D-Kulturen (Vergrßerung 20X) jeder Bedingung von nicht überlappenden Teilen der Probe.
    3. Bestimmen Sie Anzahl der Kerne und die Anzahl der Kerne positiv für Ki67 in 2D
      1. Graf Ki67 positive Kerne manuell über das Plugin Zellzähler der Software Fiji 26. Daher öffnen Sie das Bild und klicken Sie auf "Plugins" → "Analyze" → "Cell Counter". Drücken Sie auf "Initialisieren" und einen Zählertyp auswählen. Klicken Sie auf jedes Ki67 positiven Kern. Die Anzahl der Klicks ist neben dem ausgewählten Zählertyp gezeigt.
      2. Für die automatische Zellzählung der Gesamtzahl der Kerne mit einem Makro Fidschi 27,28 erstellen. Adjust das Makro für jede Färbung und Zelllinie. siehe folgenden wird ein Beispiel, wie ein Makro zu erstellen.
        1. Starten Sie Makro-Rekorder. Öffnen Sie eine DAPI-Bild und wandelt es in 8-Bit-Format, das von "Bild" → "Typ" → "8-Bit" klicken. Klicken Sie auf "Kontrast verbessern", stellen Sie "gesättigt" als "1" und "normalisieren".
        2. Set "Unscharf Maskieren", um das Bild zu schärfen. Verwenden Sie einen "Radius" von "1" und einer "Maske" von "0,60". Klicken Sie auf "Auto-Schwelle", wählen Sie Methode "RenyiEntropy" mit "weiße Objekte auf schwarzem Hintergrund 'das Bild zu binarise.
        3. Klicken Sie auf "Plugins" → "BioVoxxel" → "Watershed unregelmäßige Merkmale" mit einem Erosionsradius von "5", um die Zellen zu trennen. Klicken Sie auf "Analysieren" → "Analyze Particles" und stellen Sie die "Größe" auf "0,02-Infinity".
          HINWEIS: Die Anzahl der Partikel / Zellenin der Übersichtstabelle als Zählungen gezeigt.
        4. Klicken Sie auf "Erstellen" Makro für die Analyse weiterer Bilder zu speichern.
    4. Bestimmen Sie Anzahl der Kerne und die Anzahl der positiven Kerne für Ki67 in 3D manuell wie in Abschnitt 5.4.3.1 beschrieben.
    5. Berechne die mittlere Proliferationsindex (PI) entsprechend der folgenden Formel:
      figure-protocol-1
      n = Anzahl der Bilder (3D: 10, 2D: 5)

6. In Silico Tumormodellgenerierung und Simulation von Anti - EGFR - Therapie in HCC827 Zellen

  1. Netzwerk - Generation mit einer Netzwerkanalyse - Software
    1. Verwenden Sie unterschiedliche bekannte Datenbanken, um den Tumor-Netzwerk erzeugen, basierend auf den wichtigen experimentellen Ausleseparameter und die Mutations Hintergrund der HCC827 Zelllinie.
    2. Öffnen Sie die Netzwerk - Analyse - Software 21 zur Visualisierung derNetzwerk.
      1. Klicken Sie auf "Datei" → "Neu" → Typ 'JoVE_tumor Modelle' → klicken Sie auf "OK", um ein neues Netzwerk zu erzeugen. Klicken Sie auf "Platz Nahaufnahme Nord" → "OK", um den Rezeptor in einer Doppelmembran zu visualisieren. Klicken Sie auf "Generic Protein" zu visualisieren Knoten (= Proteine) als Rechtecke → Typ "EGFR" → klicken Sie auf "OK"; Wiederholen Sie das für jeden Knoten in dem Netzwerk.
      2. Beschriften Sie die Knoten im Netz: Rechtsklick → "Farbe ändern & Shape ..." → für Knoten EGFR und (EGF-EGFR) Farbcode "255,0,0" (Farbe rot); für Knoten c-MET und (c-MET) Farbcode "0,255,0" (Farbe grün); für Gefitinib Farbcode "255,255,0" (Farbe gelb); für PI3K-Inh Farbcode "204204204" (Farbe hellgrau); MEK-Inh Farbcode "102102102" (Farbe dunkelgrau); für alle anderen Knoten im Netzwerk auswählen Farbcode4; 255255255 "(Farbe weiß).
      3. Klicken Sie auf "Phänotyp" zu visualisieren Auslesen Parameter als Hexagone → Typ "Proliferation" → klicken Sie auf "OK" → Rechtsklick → "Farbe ändern und Form ..." → Farbcode "255204204" (Farbe Lachs); Wiederholen Sie diesen Vorgang für den Parameter Apoptose → wählen Sie Farbcode "255,51,204" (Farbe violett).
      4. Visualisieren Kanten (= Wechselwirkungen): Klicken Sie auf "State Transition" für Aktivierungen (Pfeile), klicken Sie auf "Hemmung" für Hemmungen (abgestumpft Pfeile); wiederholen dies für jede Interaktion in dem Netzwerk.
    3. Klicken Sie auf "Datei" → "Speichern unter ..." → Typ 'JoVE_tumor models.xml' → klicken Sie auf "Speichern", um die erzeugte Signalisierungsnetz als .xml-Format speichern.
  2. In Silico Simulation mit SQUAD
    HINWEIS: SQUAD repräsentiert the Netzwerktopologie als diskrete logische Boolesche System (AND, OR, NOT) und führt eine Steady-State-Analyse. Die stationäre Analyse spiegelt das System das Gleichgewicht und die Verantwortung auf Signalisierungs Reize (z. B. Medikamentenapplikation oder Mutation).
    1. Offene SQUAD 17 Software, klicken Sie auf "Load Network" → Upload 'JoVE_tumor models.xml' Datei. Klicken Sie auf "Run-Analyse":
      HINWEIS: Als nächstes gilt SQUAD Exponentialfunktion der Booleschen Netzwerk-Konnektivität zu interpolieren, die dynamische Simulation des Netzwerkverhaltens über die Zeit erlaubt (farbige sigmoid Aktivitätskurven).
    2. Klicken Sie auf "Erweitert" → "Perturbator", um ein Simulationsprotokoll schreiben. Simulieren anti- EGFR Widerstand: Klicken Sie auf "Edit Protocol"
      1. Klicken Sie auf "Störung" → Standard verwenden "initial = SS-4" (steady state 4) → Klicken Sie auf "Hinzufügen" hinzufügen "neue Constant Pulse '→ Select Parameter "Zustand" → Ziel wählen "FLIP" → Wählen Sie Zeit "0" → Wählen Sie Wert "0,4" → Klicken Sie auf "OK".
      2. Wiederholen Sie diesen Vorgang: Klicken Sie auf "Hinzufügen" → Parameter "Zustand" → Ziel "c-MET" → Wählen Sie Zeit "0" → Wählen Sie Wert "0,4" → Klicken Sie auf "OK"; Klicken Sie auf "Hinzufügen" → Parameter "Zustand" → Ziel wählen "Gefitinib" → Wählen Sie Zeit "0" → Wert "1" → Klicken Sie auf "OK".
      3. Stellen Sie einen Zustandswert aktiven Knoten (EGF-EGFR): Klicken Sie auf "activenode" → Klicken Sie auf "Bearbeiten" → Zustand "0.8" → Klicken Sie auf "OK"; für alle anderen Knoten: Klicken Sie auf "Bearbeiten" → Wählen Zustand "0" → "OK" klicken. Klicken Sie auf "OK", um das Protokoll zu speichern.
      4. Bestimmte Kurven: Zum Panel "Optionen" → "(EGF-EGFR)", "* (EGF-EGFR)", "* MEK", "Caspasen", "(c-MET)", "PI3K", "Gefitinib", "Apoptose", "Proliferation", "MEK-Inh" und "PI3K-Inh" für die grafische Darstellung. Klicken Sie auf "initialisieren" → "Ausführen" eine vollständige Simulation der Reaktion des Systems zu starten. Klicken Sie auf "Reset", um eine neue Simulation starten.
    3. Simulieren kombiniert PI3K und MEK-Inhibitor-Behandlung: Klicken Sie auf "Edit Protocol"
      1. Verwenden Sie Parameter demselben Knoten wie unter 6.2.2.1 beschrieben - 6.2.2.3. Klicken Sie auf "Störung" → Klicken Sie auf "Hinzufügen" hinzufügen "neue Constant Pulse '→ Parameter" Zustand "→ Ziel wählen" PI3K-Inh "→ Wählen Sie Zeit" 0 "→ Wählen Sie Wert" 1 "→ Klicken Sie auf" OK "; Klicken Sie auf "Hinzufügen"'Neue Constant Pulse' → Parameter "Zustand" → Ziel wählen "MEK-Inh" → Wählen Sie Zeit "0" → Wert "1" hinzufügen → Klicken Sie auf "OK".
      2. Klicken Sie auf "OK", um das Protokoll zu speichern. Zum Panel "Optionen": Verwenden Sie denselben Knoten für die grafische Darstellung, wie unter 6.2.2.4 beschrieben. Klicken Sie auf "initialisieren" → "Ausführen" eine vollständige Simulation der Reaktion des Systems zu starten. Klicken Sie auf "Reset", um die Simulation zu beenden.

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Ergebnisse

Auf der Grundlage des SISmuc Gerüst (2A bis C), haben wir ein standardisiertes Betriebsprotokoll für die Erzeugung, Stimulierung und Behandlung eines Testsystems 3D - Tumor (2D). Dieses Modell ermöglicht die Bestimmung des Proliferationsindex und die Quantifizierung der Apoptose unter Verwendung von M30-ELISA , wie jeweils in Figur 1 und Figur 3 gezeigt. 3 zeigt repräsentative H & E - Färbung von A54...

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Diskussion

Wir haben eine in vitro kombiniert etabliert / in silico Tumortestsystem für die Biomarker-gestützte Behandlung Vorhersagen. Die in - vitro - Modell bewertet verschiedene wichtige Aspekte der Verbindung Maßnahmen wie beispielsweise Veränderungen der Tumorzellproliferation und Apoptose auf einer spezifischen Mutations Hintergrund, der auch 17 in silico simuliert werden können. Hier präsentieren wir das standardisierte Protokoll für die 3D - Tumormodell Erzeugung und...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Diese Forschung wurde durch das Zentrum für Interdisziplinäre Klinische Forschung (IZKF, Zuschuss BD247) der Universitätsklinik Würzburg und der Bayern Fit-Programm (erteilt Heike Walles) gefördert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
BioreaktorenLehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin, Wü rzburg (D)Bioreaktor-Aufbau
BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fidschi)Jan Brocher, Thorsten Wagner, https://github.com/biovoxxel/BioVoxxel_Toolbox
ZellkronenLehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin, Wü rzburg (GER)für statische 3D-Kultur
CellDesignerhttp://www.celldesigner.org/-Diese Software wurde zum Zeichnen des Netzwerks verwendet.
Citrat-Pufferlösung (10x)Eigenproduktion42 g/l Zitronensäure-Monohydrat, 17,6 g/l Natronlauge-Pellets in entionisiertem Wasser, pH 6,0, gelagert bei RT.
Citrat-Puffer-Arbeitslösungin der Eigenproduktion10%ige Citrat-Pufferlösung in demineralisiertem Wasser, gelagert bei RT.
ZitronensäuremonohydratVWR, Darmstadt (GER)1002441000wird für den Citratpuffer verwendet
Deckgläser VWR, Darmstadt (GER)631-1339
DAPI Fluoromount-GTMSouthernBiotech, Birmingham (USA)SBA-0100-20
Datenbanken wie KEGG, HPRD und QIAGEN (Gene & Pathways)http://www.genome.jp/kegg/pathway.html; http://www.hprd.org/; https://www.qiagen.com/de/geneglobe/-Verschiedene bekannte Literaturdatenbanken wurden für die Generierung der Netzwerktopologie verwendet.
Weibliches Luer Lug Style T-ShirtMednet, Mü nster (GER)FTLT-1Bioreaktor-Setup
Weiblicher Luer-Gewinde-Stil mit 5/16" Sechskant auf 1/4-28 UNF GewindeMednet, Mü nster (GER)SFTLL-J1A Aufbau des Bioreaktors
Fötales KälberserumBio& VERKAUFEN, Feucht (GER)FCS. ADD.0500nicht wärmeinaktiviert
GefitinibAbsource Diagnostics GmbH, Mü nchen (GER)S1025-100 mg100 mM Stammlösung mit DMSO
Glaskolben (Schott, GER) mit Glasschlauchanschluss versehenWeckert, Kitzingen (GER)Sonderanfertigung
Histofix 4% (Paraformaldehyd)Carl Roth, Karlsruhe (GER)P087.1
SchlauchkupplungMednet, Mü nster (GER)CC-9Bioreaktor Aufbau
Inkubator für BioreaktorenLehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin, Wü rzburg (GER)Aufbau des Bioreaktors
M30 CytoDeathTM ELISAPeviva, Bromma (SWE)10900
Männlicher Luer Integral Lock RingMednet, Mü nster (GER)MTLL230-J1ABioreaktor setup
Feuchtigkeitskammernach Maß
Maus anti Pan-CytokeratinSigma-Aldrich, München (GER)   C2562-2MLKlon C-11+PCK-26+CY-90+KS-1A3 +M20+A53-B/A2, verwendet 1/100 für Immunfluoreszenz
Nadelfreies Tupferventil WeiblichesLuer Mednet, Mü nster (GER)NVFMLLPCBioreaktoraufbau, für Probenahme, gammasterilisiert
O-Ring MVQ 10 rot 37 x 3 mmArcus Dichtelemente, Seevetal (GER)21444O-Ring groß, Bioreaktoraufbau
O-Ring MVQ 70 rot 27 x 2,5 mmArcus Dichtelemente, Seevetal (GER)19170O-Ring klein, Bioreaktoraufbau
PAP penDako, Hamburg (GER)S002
ParaffinCarl Roth, Karlsruhe (GER)6642.6
SchlauchpumpeIsmatec, Wertheim-Mondfeld (GER)Aufbau des Bioreaktors
Phosphatgepufferte KochsalzlösungSigma-Aldrich, München (GER)   D8537-6x500ml
PumpenschlauchkassetteIsmatec, Wertheim (GER)IS 3710Bioreaktor Aufbau
Kaninchen anti Ki67Abcam, Cambridge (UK)ab16667Klon SP6, verwendet für 1/100 für IF
Kaninchen anti VimentinAbcam, Cambridge (UK)ab92547gebraucht 1/100 für IF
RPMI-1640 mediumLife technologies, Darmstadt (GER)61870-044warm in 37 °; C Wasserbad vor Gebrauch
SilikonschlauchCarl Roth GmbH, Karlsruhe (GER)HC66.1Bioreaktoraufbau
NatriumhydroxidSigma-Aldrich, Mü nchen (GER)30620-1KG-Rfür den Citratpuffer
SQUADhttp://sbos.eu/docu/docu/SQUAD/doku.php.htm-DieseSoftware wurde für die Durchführung der semiquantitativen Simulationen verwendet.
Sterilluftfilter, Porengröße 0,2 &Mikro; mSartorius Stedium Biotech, Gö ttlingen (GER)16596-HYKBioreaktoraufbau
Spritze Luer Lok 5 mlBD Biosciences, Heidelberg (GER)309649für die Probenahme von Bioreaktoren
Gewebekultur-Testplatten: 6-,          12-, 24-, 96- BohrlochTPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen (GER)92006, 92012, 92024, 92048 
Transformierender Wachstumsfaktor-beta 1 (TGF-β 1) mit CarrierCell Signaling, Frankfurt (GER)8915LCStammlösung in sterilem Citratpuffer pH 3,0
Triton X-100Sigma-Aldrich, Mü nchen (GER)X100-1L
Tween-20Sigma-Aldrich, Mü nchen (GER)P7949-500mlzum Waschen von Puffern aus Immunfluoreszenzfärbungen

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