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Methodenartikel

Exosomalen miRNA-Analyse in nicht-kleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) der Patienten Plasma durch qPCR: ein gangbarer Flüssiges Biopsy-Tool

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DOI:

10.3791/53900

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27. Mai 2016

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1Department of Biopathology and Medical Biotechnology, Section of Biology and Genetics, University of Palermo, 2Phase I-Early Clinical Trials Unit, Oncology Department, Antwerp University Hospital (UZA), 3Center for Oncological Research (CORE), Antwerp University, 4Department of Surgical, Oncological and Oral Sciences, Section of Medical Oncology, University of Palermo, 5Flemish Institute for Technological Research (VITO), 6CORE, Campus Groenenborger, Antwerp University, 7Molecular Pathology, Pathology Department, Antwerp University Hospital (UZA), 8Oncology Department, Antwerp University Hospital (UZA)

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Machbarkeit, miRNA-Profiling in Exosomen, die im Plasma von NSCLC-Patienten freigesetzt werden, durch ein kommerzielles Exosomen-Isolationskit mit Proteinase K- und RNAse-Behandlungen durchzuführen, um eine Kontamination mit zirkulierenden miRNAs zu vermeiden und ihre Biomarker-Eigenschaften bei NSCLC zu bewerten.

Zusammenfassung

Die Entdeckung von Veränderungen in den EGFR- und ALK-Genen, unter anderem, bei NSCLC hat die Entwicklung einer zielgerichteten medikamentösen Therapie mit selektiven Tyrosinkinase-Inhibitoren (TKIs) vorangetrieben. Um den Einsatz dieser TKIs zu optimieren, ist die Entdeckung neuer Biomarker für die Früherkennung und den Krankheitsverlauf zwingend erforderlich. Diese plasmaisolierten Exosomen können als nicht-invasive und wiederholbare Methode zum Nachweis und zur Nachverfolgung dieser Biomarker verwendet werden. Als Exosomenquelle wurde ein ml Plasma von 12 NSCLC-Patienten mit unterschiedlichen Mutationen und Behandlungen (und 6 gesunden Spendern als Kontrollen) verwendet. Nach der RNASE-Behandlung wurden die Exosomen zum Abbau zirkulierender miRNAs mit einem kommerziellen Kit isoliert und zur weiteren Analyse in spezifischen Puffern resuspendiert. Die Exosomen wurden durch Western-Blotting für ALIX und TSG101 und durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)-Analyse charakterisiert, die Standardtechniken zur Gewinnung biochemischer und dimensionaler Daten dieser Nanovesikeln. Die Gesamt-RNA-Extraktion wurde mit einem kommerziellen Kit mit hoher Ausbeute durchgeführt. Aufgrund des begrenzten miRNA-Gehalts in den Exosomen haben wir uns entschieden, eine Retrotranskriptions-PCR mit einem individuellen Assay für jede ausgewählte miRNA durchzuführen. Eine Reihe von miRNAs (30b, 30c, 103, 122, 195, 203, 221, 222), die alle mit der NSCLC-Erkrankung korrelierten, wurden unter Ausnutzung der bemerkenswerten Sensitivität und Spezifität der Real-Time-PCR-Analyse analysiert; Als endogene Kontrolle wurde mir-1228-3p verwendet und die Daten wurden nach der Formel 2-ΔΔct 13 verarbeitet. Die Kontrollwerte wurden als Ausgangswert verwendet, und die Ergebnisse sind in logarithmischer Skala dargestellt.

Einleitung

Die geringe Überlebensrate bei NSCLC (nicht-kleinzelligem Lungenkrebs) Patienten ist vor allem aufgrund der begrenzten Wirksamkeit von Behandlungen in fortgeschrittener Krankheit und schlechte Früherkennung 1. Aktivierende Mutationen in dem EGFR - Gen, das in einer Subpopulation von NSCLC - Patienten gefunden wurden, sind dafür bekannt , die Empfindlichkeit zu verleihen Kinaseinhibitoren zu Tyrosin (TKI). Leider entwickeln die Mehrheit der EGFR - mutierten NSCLC - Patienten TKI Widerstand 2. Gerade in diesem Zusammenhang ist eine korrekte Diagnose ist obligatorisch. In der Regel aufgrund Lokalisation von Tumoren, Biopsiegewebe bei NSCLC erhalten, ist nicht immer möglich. Daher sind mehrere Studien laufen, die nicht-invasive Methoden verwenden diese biologischen Daten zu erhalten. Exosomen sind als flüssige Biopsie Komponenten beschrieben , die untersucht werden , könnten drei diagnostische und prognostische Werte mit nicht-invasiven Techniken zu erhalten.

Exosomen sind Nanovesikeln (40-100 nm Durchmesser) von endocytic Ursprungs , die von 4 verschiedenen Zelltypen sowohl in physiologischen und pathologischen Bedingungen freigesetzt werden. Sie können Protein, Lipide, mRNA und microRNA tragen. Außerdem lassen sich mehrere Studien eine pleiotrope Rolle von Tumor abgeleitet Exosomen, das Wachstum und das Überleben von Tumorzellen beeinflussen können, Angiogenese, Stroma- und extrazelluläre Matrix Remodeling und drug resistance 5.

MicroRNAs (miRNAs) sind kurze nicht-codierende RNA , die in post-transkriptionalen Regulation beteiligt sind, die Bindung des 3'-UTR der Ziel - mRNAs und führt die mRNA zu einem Abbau oder zu einer nicht-Übersetzung 6. Selektive Sortierung von miRNAs in Exosomen beschrieben wurde. In diesem Zusammenhang wurde kürzlich gezeigt, in vitro und in vivo eine selektive Verpackung von miR-21 (einem bekannten miRNA mit onkogenen Effekte) in Exosomen von chronischer myeloischer Leukämie - Zelllinien nach Curcumin Behandlung 7 freigegeben.

Dasexosomalen miRNA Profil ist ähnlich dem miRNA - Profil des Primärtumors und dieses Merkmal kann 3 in frühen Diagnose und Prognose ausgenutzt werden. Genauer gesagt, besteht eine Möglichkeit , zu charakterisieren, durch Echtzeit - PCR, ausgewählt miRNAs mit dem molekularen Profil der Krankheit korreliert, z. B., EGFR - Mutationen unter anderem 8.

Hier ist die Analyse einer ausgewählten Gruppe von NSCLC-korrelierten miRNAs 8-9 beschrieben , die von Exosomen isoliert wurden im Blut von NSCLC - Patienten veröffentlicht. Nach Erhalt der Zustimmung Bericht von den Patienten, Plasma von 12 NSCLC-Patienten und 6 gesunden Kontrollen wurden analysiert informieren. Die exosome Isolierung wurde mit kommerziellen Kits durchgeführt nach dem Protokoll des Herstellers. Bevor exosome Isolierung Plasmaproben wurden mit RNAse behandelt, um miRNAs Verunreinigung zirkulierende abzubauen. Wir entschieden uns, diese Analyse mit einem kommerziellen Kit zur Durchführung aufgrund der begrenzten Standardisierung der anderen techniques (z. B. Ultrazentrifugieren) was besonders wichtig ist , wenn es mit klinischen Proben arbeiten. Dieses Kit enthält eine Proteinase K-Behandlung, die die RNAse abgebaut wird, und verringert somit das Risiko exosomalen miRNAs nach exosome Lyse abzubauen. MicroRNA-Analyse wurde durch sensitive und spezifische Real-Time PCR-Analyse durchgeführt; mir-1228-3p wurde als endogene Kontrolle verwendet und die Daten wurden normalisiert , gemäß der Formel 2 - ΔΔct. Die Kontrollwerte werden als Basislinie verwendet und die Ergebnisse werden in einer logarithmischen Skala dargestellt.

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Protokoll

1. exosome Isolation

Anmerkung: Die Isolierung von Exosomen aus Plasmaproben, mit einem handelsüblichen Kit durchgeführt wurde, entsprechend dem Protokoll des Herstellers und durch Zugabe von RNAse-Behandlung: (alle diese Schritte müssen mit persönlichen und Umweltschutzausrüstungen und folgende spezifische Rechts Verfahren zur Manipulation von biologischen Proben durchgeführt werden, ).

  1. Nehmen Sie 1 ml Plasma jeder Probe bei -80 ° C gelagert, und legen Sie es auf Eis.
  2. Zentrifugieren Sie die Probe bei 2000 × g für 20 min bei RT; Diese Passage ist zwingend erforderlich, um Zellen und Zelltrümmer zu entfernen.
  3. Den Überstand der sauberen Plasma in ein neues 1,5-ml-Röhrchen enthält.
  4. Zentrifugieren Sie die neue Röhre bei 10.000 × g für 20 min bei RT.
  5. Den Überstand der sauberen Plasma in ein neues 1,5-ml-Röhrchen enthält.
  6. Je 100 ng / ml RNAse zu dem Überstand und Inkubieren der Röhrchen bei 37 ° C für 10 min inUm RNAs zirkulierende abzubauen.
  7. Übertragen Sie alle das behandelte Plasma in ein neues 2-ml-Röhrchen und fügen 0,5 Volumen 1x PBS.
  8. Vortex, um die Probe, um die Lösungen zu mischen.
  9. 0.05 Volumina von Proteinase K - Lösung (umschließen im Kit) zur Probe.
  10. Vortex die Probe und dann 10 min bei 37 ° C inkubieren.
  11. In 0,2 Volumen von exosome Fällungspuffer auf die Probe und mischen Sie die Lösungen durch Umdrehen.
  12. Inkubieren der Probe bei 2 ° C bis 8 ° C für 30 min und dann die Probe bei 10000 × g für 5 min bei RT zentrifugiert.
  13. Absaugen und den Überstand verwerfen. Das Pellet enthält die isolierten Exosomen.
  14. In ausgewählten Puffer zur exosome Pellet, um die Exosomen zu suspendieren. Die Auswahl des Puffers hängt von der Downstream-Analyse geplant, in diesem Fall:
    1. 100 l 1x PBS, um die TEM-Analyse durchzuführen.
    2. In 346,5 ul der spezifischen Lyse buffer für die RNA-Extraktion (von kommerziellen Kit) (ACHTUNG: chemische Gefahr).
    3. Füge 100 & mgr; l Lyse-Puffer für die Proteinextraktion (Tris-HCl 50 mM pH 7,6 - NaCl 300 mM - Triton X-100 0,5% - PMSF 1 mM - Leupeptin / Aprotinin 10 & mgr; g / ml), um die Western Blotting-Analyse durchzuführen. (ACHTUNG: chemische Gefahren).
  15. Lagern Sie die resuspendierten Exosomen bei -20 ° C.

2. exosome Charakterisierung durch Western-Blot-Analyse

Hinweis: Um die isolierten Nanovesikeln, Western-Blot mit Antikörpern gegen ALIX und TSG101 (bekannte exosomalen Marker) wird empfohlen, zu charakterisieren.

  1. Nach der Resuspension des exosome Pellet in Lysepuffer, legen Sie sie auf Eis für 1 Stunde, um die exosomalen Membran aufzulösen.
  2. Zentrifugieren Sie das Lysat bei 12.000 g für 10 min und den Überstand in ein neues Röhrchen ohne das Pellet zu stören.
  3. Quantifizieren der Gesamt exosomalen Protein content durch Bradford-Assay oder andere Methoden und Last 50 ug Proteine ​​pro Vertiefung in einem Tris / Glycine SDS - 8% Polyacrylamidgel. (ACHTUNG: chemische Gefahren).
  4. Trennen Sie die Proteine ​​(und eine entsprechende Molekulargewichtsmarker) in 8% SDS-PAGE-Gel-Elektrophorese mit Laufpuffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0,1% SDS) für 1 Stunde und 30 Minuten bei 120 V (ACHTUNG: chemische Gefahren ).
  5. Übertragen, um das Protein auf eine Nitrocellulosemembran durch Elektroblotting mit 4 ° C kalten Übertragungspuffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 20% Methanol) für 1 h bei konstant 50 V. (Vorsicht: chemische Gefahren).
  6. Blockieren Sie die Membran für 1 Stunde in langsamem Rühren mit 5% fettfreie Trockenmilch in 1x TBS -Tween 0,1%.
  7. Waschen Sie die Membran 4 mal für 5 min in schneller Bewegung mit 1x TBS - Tween 0,1%.
  8. Fügen Sie die primären Antikörper gegen ALIX und TSG101 (einer pro-Membran) in einem geeigneten Puffer (entsprechend dem Antikörper Datenblatt des Herstellers) und Inkubation der Membran O / N; In langsamer Bewegung.
  9. Waschen Sie die Membran 5 mal 5 min in schneller Bewegung mit 1x TBS - Tween 0,1%, um eine übermäßige Antikörper zu entfernen.
  10. Fügen Sie den entsprechenden sekundären Antikörper in geeigneten Puffer (entsprechend dem Antikörper Datenblatt des Herstellers) und Inkubation der Membran für 1 Stunde in langsamer Bewegung.
  11. Waschen Sie die Membran 5 mal 5 min in schneller Bewegung mit 1x TBS - Tween 0,1%, um eine übermäßige Antikörper zu entfernen.
  12. Ermitteln Sie die ausgewählten Protein durch Chemilumineszenz - Analyse 11.

3. exosome Charakterisierung mit TEM-Analyse

Hinweis: Um zu visualisieren wurde die isolierten Exosomen, TEM (Transmissionselektronenmikroskopie) Analyse durchgeführt.

  1. Platz ~ 10 & mgr; g (vorher quantifiziert durch Bradford-Test) der Probe von intakten Exosomen resuspendiert in 1x PBS auf einem Parafilm und auf die Probe fallen ein Formvar Kohlenstoff beschichteten Nickelgitter für 1 Stunde.
  2. Waschen Sie das Gitter 3 Mal wurde sie auf drei 40 ul Positionierung 1x PBS fällt.
  3. das Gitter 5 mal waschen, indem es auf fünf 30 & mgr; l Reinstwasser Tropfen zu positionieren.
  4. Fixieren Sie die Probe durch einen Rückgang von 2,5% Glutaraldehyd Zugabe (ACHTUNG: chemische Gefahr) für 10 min.
  5. Waschen Sie das Gitter 3 mal durch die Positionierung auf drei 40 ul 1x PBS fällt.
  6. Fügen Sie einen Tropfen von 2% Uranylacetat (ACHTUNG: chemische Gefahren) und stellen Sie das Raster auf es für 15 Minuten, um die Probe zu kontrastieren.
  7. Einbetten der Probe auf einem Tropfen 0,13% Methylcellulose (ACHTUNG: chemische Gefahren) und 0,4% Uranylacetat und Inkubation das Gitter auf der Oberseite des Tropfens für 10 min.
  8. das Netz für 5 min mit der beschichteten Seite nach oben Entfernen Sie vorsichtig Flüssigkeit Überschuss mit einem absorbierenden Papier und trocknen.
  9. Untersuche das Gitter durch Transmissionselektronenmikroskop 12.

4. exosomalen RNA-Extraktion und Quantifizierung

Hinweis: Wir haben beschlossen, perform die Gesamt-RNA-Extraktion aus exosomalen Proben, die einen kommerziellen Kits, gemäß dem Protokoll des Herstellers: (ACHTUNG: chemische Gefahren, Protokoll des Herstellers und Richtlinien zu lesen).

  1. Nach der Resuspension des exosome Pellet in 346,5 ul Lysepuffer, fügen 3,5 ul β-Mercaptoethanol (ACHTUNG: chemische Gefahren) und Vortex kräftig; Diese Passage ist zwingend erforderlich, um die Lipidmembranen zu zerstören.
  2. Fügen Sie das Lysat in die Waschsäule in einem Sammelröhrchen und Zentrifuge bei 11.000 × g für 1 min. Nach der Zentrifugation verwerfen die Säule und übertragen das Filtrat in ein neues 1,5 ml RNase-freie Röhre.
  3. In 350 & mgr; l 70% Ethanol (ACHTUNG: chemische Gefahren) und mischen durch Vortexen für 5 Sek.
  4. Laden des Lysats in das Auflösungssäule und zentrifugieren für 30 Sekunden bei 8000 × g. Nach der Zentrifugation verwerfen die Durchflußleistung und übertragen Sie die Spalte an eine neue Sammelröhrchen.
  5. Laden Sie 350 ul Entsalzung buffer und Zentrifuge bei 11.000 × g für 1 min. die Durchflußleistung und gibt die Spalte in die gleiche Sammelröhrchen Nach der Zentrifugation verwerfen.
  6. Hinzufügen, 95 & mgr; l DNase I-Reaktionsgemisch (10 & mgr; l rekonstituiert DNase I + 90 ul DNase-Puffer für jede Probe) auf der Silica-Membran der Säule und Inkubation bei RT für 15 min bei RT. (ACHTUNG: chemische Gefahr)
  7. In 200 ul Waschpuffer (ACHTUNG: chemische Gefahr) an die Säule und Zentrifuge bei 11.000 × g für 1 min. Platzieren Sie die Säule in ein neues Sammelröhrchen.
  8. Hinzufügen, 600 & mgr; l Waschpuffer auf die Säule und Zentrifugieren bei 11.000 × g für 1 min. Durchflußleistung und legen Sie die Spalte in die gleiche Sammelröhrchen Nach der Zentrifugation verwerfen.
  9. Nach Eintragen von 250 & mgr; l Waschpuffer auf die Säule und Zentrifugieren bei 11.000 × g für 2 min. Die Säule in ein 1,5 ml RNAse-freies Röhrchen.
  10. Eluieren der RNA in 40 ul RNAse-freies Wasser und Zentrifuge bei 11.000 5; g für 1 min, um eine hohe RNA-Konzentration in diesem kleinen Volumen zu haben.
  11. Unmittelbar eluiert RNA auf Eis legen, um potenzielle Abbau oder bei -80 ° C zu verhindern.
  12. Quantifizierung der RNA-Gehalt. Anmerkung: Hier wurde die RNA-Quantisierung unter Verwendung von 1 & mgr; l der Probe durch Spektrophotometer durchgeführt.

5. Retrotrascription von exosomalen miRNAs

Hinweis: Durch die beschriebene begrenzte Menge miRNAs Gehalt in Exosomen, wurde beschlossen, die reverse Transkription von ausgewählten miRNAs durch einen kommerziellen Kit unter Verwendung eines einzelnen Assays für jede miRNA auszuführen, gemäß dem Protokoll des Herstellers. Für jede Probe 8 bis NSCLC Status korreliert miRNAs wurden ausgewählt (miR-30b; miR-30c; miR-103; miR-122, miR-195, miR-203; miR-221, miR-222 und miR-1228- 3p als endogene Kontrolle).

  1. Bereiten Sie die reverse Transkription Master-Mix (RT-Mix). Für jede Reaktion 7 & mgr; l RT Mischung herzustellen, wie beschrieben inhttps://www.jove.com/files/ftp_upload/53900/Table1.xlsx">Table 1 (hier klicken zum Download) (ACHTUNG: chemische Gefahr).
    Anmerkung: In diesem Experiment wurden 9 verschiedene RT-Mix für jede Probe hergestellt.
  2. Vorsichtig mischen und speichern Sie die RT-Mix auf Eis. In 7 ul RT-Mix pro Reaktionsrohr.
  3. Zugabe von 5 & mgr; l Proben-RNA (10 ug Gesamt-RNA) pro Reaktionsrohr und vorsichtig mischen.
  4. In 3 ul der 5-fach Reverse Transkription-Primer (ACHTUNG: chemische Gefahr) von jedem Test in die entsprechende Reaktionsrohr gesetzt.
  5. Mischen Sie langsam, schließen Sie das Rohr und Inkubation auf Eis für 5 min.
  6. Legen Sie das Reaktionsrohr in den Thermocycler und starten Sie die reverse Transkriptionsreaktion unter Verwendung der folgenden Parameterwerte (HOLD bei 16 ° C für 30 min; HOLD bei 42 ° C für 30 min; HOLD bei 85 ° C für 5 min; HOLD ∞ 4 ° C).

6. Real Time PCR Analyse von exosomalen miRNAs

Hinweis: Diese Analyse wareiner handelsüblichen Kit für Real Time PCR (qPCR), mit drei biologischen und technischen Replikate pro Probe verwendet.

  1. Für jede Reaktion, bereiten 17.67 ul von Real-Time-PCR-Mix (10 & mgr; l PCR Master Mix + 7,67 ul Nuklease-freies Wasser), es mischen und auf Eis gelegt. (ACHTUNG: chemische Gefahr)
  2. 1 & mgr; l für jedes PCR-Röhrchen, von 20x qPCR-Primer (ACHTUNG: chemische Gefahr).
  3. Legen 18.67 ul der qPCR-Mix in jedem Well-Platte.
  4. In 1,33 ul der reversen Transkription Produkt in der Korrespondent Well-Platte.
  5. Schließen Sie die Platte und drehen Sie es (300 gx 5 sec).
  6. Legen Sie die Platte in einer Echtzeit-PCR-System und starten Sie den Lauf der folgenden PCR-Bedingungen: Halten bei 95 ° C für 10 min; 40 Zyklen von 15 sec bei 95 ° C und 60 sec bei 60 ° C. Verfahren und Normalisieren von Daten gemäß der Formel 2 - ΔΔct 13.

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Ergebnisse

Insgesamt 12 Plasma von NSCLC-Patienten und 6 gesunden Kontrollen wurden mit im Handel erhältlichen Kits für exosome Isolierung von Plasma verarbeitet. Jede Probe wurde durch Western-Blot-Analyse verarbeitet, um die exosomalen Marker ALIX (96 kDa) und TSG101 (43 kDa) zu bewerten. Ein Beispiel dieser Ergebnisse ist für 3 Proben in 1 gezeigt , die anzeigt , dass exosome Isolierung von Plasmaproben , die mit diesem Protokoll möglich ist.

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Diskussion

Mit diesem kombinierten Protokoll war es möglich, eine exosomalen miRNA-Analyse von Plasma von NSCLC-Patienten durchzuführen. Diese Daten können den Krankheitszustand widerspiegeln, aber dies muss durch weitere Untersuchungen bestätigt werden.

Das Protokoll in diesem Artikel verwendet wurde, auf einem kommerziellen Kit für exosome Isolation basiert. Der Grund war , dass die anderen bekannten Isolierungsverfahren (z. B. Dichtegradient Ultrazentrifugation) erfordern manuelle Verfahren...

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Offenlegungen

Alle Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Danksagungen

Diese Studie wurde auch durch MOCA (Multidisciplinair Oncologisch Centrum Antwerpen) Stipendium 2014 finanziert.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Vollständiges Exosomen-Isolationskit (aus Plasma) Invitrogen4484450Anwendung Proteinase K-Behandlung
Ribonuklease ASigma-AldrichR4875-100MG
ALIX Antikörper (3A9)Cell Signaling2171S
TSG-101 Antikörper (C-2)SantaCruz BiotecnologySC-7964 
Anti-Maus HRP 1 ml   Cell Signaling7076P2
RNAspin Illustra Mini-Kit 50GE HealthCare25-0500-71
Taqman MicroRNA Reverse TranskriptionskitLife Technologies4366596
has-miR-1228-3p TaqMan MicroRNA-AssayLife Technologies002919
has-miR-30b TaqMan MicroRNA-AssayLife Technologies000602
has-miR-30c TaqMan MicroRNA-AssayLife Technologies000419
has-miR-122 TaqMan MicroRNA-AssayLife Technologies002245
has-miR-195 TaqMan MicroRNA-AssayLife Technologies000494
has-miR-203 TaqMan MicroRNA-AssayLife Technologies000507
has-miR-103 TaqMan MicroRNA-AssayLife Technologies
has-miR-221 TaqMan MicroRNA AssayLife Technologies000524
has-miR-222 TaqMan MicroRNA AssayLife Technologies002276
TaqMan Universal Master Mix II, ohne UNGLife Technologies4440043
000439

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

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