Abstract
כאן אנו מתארים הליך מפורט ביעילות ישירות לספק אינפלואנזה המופילוס לתוך שטחי הנשימה התחתונות של עכברים. אנו מדגימים את הליך הכנת H. בידוד אינפלואנזה, החדרת תוך-קנה נשימה של H. אינפלואנזה לתוך הריאות, אוסף של נוזל שטיפת broncho-מכתשים (BALF), ניתוח של תאים חיסוניים BALF, ובידוד RNA עבור ניתוח ביטוי גני הפרש. הליך זה יכול לשמש כדי לחקור את תגובת הריאות דלקתית לכל חיידקים, וירוסים או פטריות. החדרה קנה נשימה ישירה היא המועדפת בעיקר על נהלי משאיפת אפים או תרסיס כי זה יותר יעיל מספק את בידוד החיידקים לתוך דרך הנשימה התחתונה עם עמימות פחות.
Introduction
דלקת היא מנגנון חיסון יסוד של הגנה מפני גורמים מזהמים. זה מקדם מיגור פתוגן ותיקון של רקמות אשר ניזוקו. זה גם מקל על שחזור למצב נורמלי בריא 1. עם זאת, דלקת dysregulated מובילה לעיתים קרובות מחלות דלקתיות כרוניות 2. דלקת דרכי הנשימה היא טריגר ראשוני למחלות ריאה שונים כגון מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), אסטמה פיברוזיס ריאתי 3.
אינפלואנזה המופילוס הלא typeable (unencapsulated) (NTHi) קשורה למחלות ריאה דלקתיות העליון כרונית והתחתון 4,5. זהו המין השולט שבודד את דרכי הנשימה התחתונה של ילדים ומבוגרים עם 4,6,7 מחלת ריאות חסימתית כרונית. התגובה הדלקתית לאחר ההדבקה NTHi מתאפיין הגברת הביטוי של ציטוקינים מעודדי דלקת (כגון TNF ו- IL-1β), וזה מתווכת בmitogen y פרוטאין קינאז מופעל (MAPK) גורם-κB גרעיני (NF-κB) באמצעות קולטנים דמוי האגרה (TLRs) 8.
מודלי Mouse הם כלים שימושיים מאוד לניתוח הפתולוגיה הבסיסית של מחלה דלקתית ריאות בגלל הזמינות של קווי גן מחסר שונים. כמה שיטות שימשו לחסן חיידקים חיים / נחלש ומוצרים חיידקים, כולל החדרה אפי ו 9,10 משאיפת תרסיס. הנה, אנחנו מדגימים החדרת תוך-קנה נשימה. למרות בשימוש לעתים רחוקות, גישה זו היא יותר יעילה מאוד לשחזור בגלל המשלוח הישיר של הבידוד אל דרך הנשימה התחתונה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות של ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדית השתמש (IACUC) של מכון המחקר ביילור.
1. Culturing ללא typeable אינפלואנזה המופילוס (NTHi) ואת הכנת הבידוד
- פלייט NTHi על צלחת אגר שוקולד ולשמור הצלחת הפוכה CO 2 באינקובטור humidified לילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. למחרת, התרבות החיידקים במרק עירוי הלב והמוח. לאחר מכן, להוסיף 1 מ"ל של מרק לתוך צינור 1.5 מ"ל סטרילי.
- צנטריפוגה ב 4000 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. ואז, לבטל את supernatant מחדש להשעות גלולה ב 1 מ"ל של PBS 1x סטרילי. חזור על פעולה זו פעם.
- העברת 100 μl של פתרון מחדש מושעה לתוך 900 μl של 1x PBS ולמדוד את ספיגת התרבות המדוללת ב 600 ננומטר אורך גל ספקטרופוטומטר.
- לקבוע את הכדאיות ואת המושבה היחידה להרכיבs (CFUs) של הבידוד על ידי culturing דילולים 1:10 סדרתי על צלחות אגר שוקולד דוגרים לילה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- בהתבסס על הכדאיות CFUs נקבע מהשלב הקודם, להתאים את הבידוד לריכוז סופי של 20 x 10 6 CFU / ml.
2. Intra-קנה הנשימה (זה) החדרה
- להזריק את העכבר intraperitoneally (IP) עם 0.1 מ"ל / 10 g משקל הגוף של עכבר עם פתרון 150 מ"ג / מ"ל קטמין + 20 מ"ג / מ"ל xylazine. ההליך צריך להיעשות בשכונה עם מקור אור כדי לשמור על חומו של בעלי החיים.
- לצבוט את החלל interdigital של העכבר על מנת לוודא כי העכבר הוא מורדם כראוי.
- מניחים את העכבר על גבו. לגלח את האזור הגחון של הצוואר ולחטא עם chlorhexidine ואלכוהול אתיל 70%.
- הרם את העור של חלק הגחון העליון של הצוואר באמצעות מלקחיים שיניים חולדה. לעשות חתך קטן (0.5-1.0 ס"מ) מעל התימוס באמצעות אזמללנתח את השריר בזהירות כדי לחשוף את קנה הנשימה.
- באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט 27 G, להזריק לאט 0.05 מ"ל אוויר, ואחריו 0.05 מ"ל NTHi המתקבל בסעיף 1 או מלוחים כביקורת, ואחריו עוד אוויר 0.05 מ"ל. שמור חיה אנכי כ 1 דקות.
- סגירת החתך עם דבק כירורגי. שמור את העכבר רוחבי שכיבה וחמה למשך כ -10 דקות.
3. אוסף BALF
- להקריב את העכבר על ידי hr 24 נקע בצוואר הרחם לאחר ההדבקה.
- פתח את חלל הבטן של העכבר במספריים אנטומיים וחותכים האאורטה הגחון לדמם. לחשוף את החלק הגחוני של הריאה.
- לחשוף את קנה הנשימה לצנרר אותו עם קטטר 20 מד. להחדיר 0.8 מ"ל של חיץ BALF (PBS 1x, 0.1% דקסטרוז, 10 הפרין U / ml) לאסוף את שטיפה ידי שאיפה עדינה. חזור על הליך זה שלוש פעמים.
- לספור את המספר הכולל של תאים ב 100 μl של השעיה BALF באמצעות hemocytoמטר בהגדלה 10X עם מכתים כחול Trypan.
- כן שקופיות עבור מכתים Giemsa שונה. μl Aliquot 100 של BALF לתוך הבארות המתאימות של cytospin ו צנטריפוגות ב XG 500 במשך 5 דקות. לייבש את השקופיות עבור 10 דקות ו להכתים את התאים באמצעות צביעה גימזה מעודכנת על פי הפרוטוקולים של היצרן.
- השתמש התאים הנותרים לניתוח שלאחר מכן, כגון התא מופעל בתפרחת מיון (FACS), מיקרוסקופיה confocal, ביטוי גנים ומערב כתם 11-13.
4. הכנת Histopathology
- לניתוח histopathology, להדביק עכברים עם NTHi כמתואר בשלב 2.4. לאחר 24 שעות של זיהום, להקריב את בעלי החיים באמצעות פריקת צוואר רחם. גזור לפתוח את חלל בית החזה במספריים אנטומיים לחשוף את הריאות ואת קנה הנשימה כפי שהוזכר קודם לכן. לאחר מכן, הכנס את הקטטר 20 מד לתוך קנה הנשימה.
- מלאו את הריאות עם 2 פתרון agarose חם% מוכנים בפורמלין 4%. פעם הריאות מנופחות לחלוטין, במקום קרח על גבי הריאות כדי לחזק פתרון agarose.
- לאחר מכן, להסיר בזהירות את התקע החזה והכניס אותו בתמיסה 50 מ"ל של פורמלין 4% ב 1x PBS עד שהוא יעובד עבור hematoxylin ו eosin (H & E) סעיפים.
5. FACS מכתים תאים בתוך BALF
- שים 1 x 10 5 תאים מן הנוזל BALF בצלחת כייל מיקרו 96-גם V-התחתון.
- שטפו תאים עם 300 μl של 1X PBS ו ספין קר ב 4000 XG 3 דקות ב 4 ° C.
- כתם התאים עם פתרון כתם תא 100 μl 1x PBS (1: 1,000 דילול) לשמור בטמפרטורת חדר למשך 15 דקות.
- שטפו תאים עם 300 μl של PBS 1x קר ב 4000 XG 3 דקות ב 4 ° C.
- שמור את התאים ב 100 μl של חיץ לשטוף FACS [חיץ לשטוף (PBS 1x, 2% FBS, 1 mM EDTA, אזיד הנתרן 0.1%] המכיל 1: 100 Fc-בלוק בדילול במשך 15 דקות ב 4 ° C..
- תאים צנטריפוגה ב 4000 XG 3 דקות וזורקים supernatant.
- תאי כתם עם 100 קוקטייל משטח מכתים μl (1: 100 דילול) במאגר לשטוף FACS למשך 30 דקות ב 4 ° C..
- שטפו תאים שלוש פעמים עם 300 μl של חיץ לשטוף FACS ב 4000 XG 3 דקות ב 4 ° C.
- תקן תאים ב 100 μl של paraformaldehyde 4% במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
- פעמיים שטפו תאים עם 300 μl 1x PBS ב 400 XG 3 דקות ב 4 ° C מחדש להשעות ב 300 μl של חיץ לשטוף FACS.
- להפוך פקדים מכתימים יחיד צבע באמצעות זרימת cytometry חרוזים.
- הוסף טיפה אחת של חרוזים לתוך צלחת מיקרוליטר V-התחתון 96-היטב ולשטוף עם 200 μl 1x PBS.
- הוסף 1 μl של נוגדן מכתים 100 μl 1x PBS וחרוזים לדגור על טמפ 'החדר למשך 5 דקות.
- לשטוף חרוזים פעמיים עם 300 μl 1x PBS.
- לנתח שולטת חד מוכתמים ותאים ידי cytometry זרימת 14.
המגון 6. של רקמת הריאה כדי לבודד RNA
- לאחר ההדבקה, לאסוף חתיכה קטנה של הריאות (20-40 מ"ג) ולשמור אותו RNA ייצוב מגיב על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר מכן, ולאחסן אותו ב -80 ° C עד לשלב הבא.
- שטפו את רקמות הריאה ב PBS 1x קר להיפטר של מגיב ייצוב RNA.
- הנח את רקמת לתוך המאגר תמוגה המכיל צינור 1.5 מ"ל צנטריפוגה (חיץ תמוגה 1 מ"ל + 10 μl β-mercaptoethanol).
- קוצצי הרקמה לחתיכות קטנות באמצעות מספריים מחודדים homogenize באמצעות עלי גלול מנוע אלחוטי עבור 20-40 שניות.
- שמור על lysate על קרח למשך 5 דקות ולהמשיך עם צעד 7.1.
בידוד RNA 7. מן הריאות
- צנטריפוגה lysate ב 18,000 XG במשך 3 דקות. הסר את supernatant ידי pipetting ובזהירות להעביר אותו צינור 1.5 מ"ל חדש.
- הוסף 1 נפח של אתנול 70% על lysate. מערבבים מיד על ידי pipetting ולחכות 2-4 דקות.
- העבר עד 700 μl של lysate לעמודה ספין להציבבצינור אוסף 2 מ"ל.
- צנטריפוגה ב 9,600 XG במשך 15 שניות וזורקים את הזרימה דרך.
- להוסיף 350 μl לשטוף חיץ צנטריפוגות קפדני 9,600 XG במשך 15 שניות. מחק את הזרימה דרך.
- הוסף 80 μl DNase אני ישירות הממברנה טור ספין ולשמור אותו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
- להוסיף 350 חיץ לשטוף מחמירים μl לעמודה ספין צנטריפוגות ב 9,600 XG במשך 15 שניות. מחק את הזרימה דרך.
- הוסף 500 μl RNA לשטוף חיץ צנטריפוגות ב 9,600 XG במשך 15 שניות. מחק את הזרימה דרך.
- הוסף 500 μl RNA לשטוף חיץ ספין על 9,600 XG למשך 2 דקות. מחק את הזרימה דרך.
- מניחים את הטור ספין צינור צנטריפוגות הקולקציה החדשה 2 מ"ל ב 9,600 XG דקות 1. מחק את הזרימה דרך.
- להוסיף 30-50 מים RNase ללא μl ישירות לעמודת ספין צנטריפוגות ב 9,600 XG דקות 1. RNA החנות ב -80 מעלות צלזיוס.
- בצע RNA-seq ניתוח 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
החדרת Intra-קנה נשימה הביאה מספר גדל במידה ניכרת של לויקוציטים ב BALF (איור 1 א ', פנל משמאל) מ התקנה עם מי מלח. ניתוח ספירת ההפרש של לויקוציטים הראה חדיר נויטרופילים עלו בבירור (איור 1, פנל מימין). הניתוח FACS של התאים BALF עוד חיזק את מספר גדל של נויטרופילים (איור 1B). ניתוח היסטולוגית סעיפים H & E מוכתם של רקמת הריאה והראה הגדילה ודלקות בדרכי הנשימה (איור 1 ג). נתונים אלה מראים כי באופן קולקטיבי החדרת תוך-קנה נשימה גורמת לדלקת דרך נשימה אצל עכברים. כדי לתמוך בשימוש של גישה זו לחקר מסלולי איתות המווסתים בפתוגנזה דרכי הנשימה, השתמשנו עכברים כי הם לא מספיק עבור Itch האנזים היוביקוויטין E3. Itch ידוע להיות המעורבים בויסות אותות דלקתיים מסלולי 15. אנחנו מחוסניםלגיל וסוג בר בהתאמה מין שליטה C57BL / 6 ו Itch - / - עכברים עם NTHi. בודדנו RNA מרקמות הריאות של WT המלא Itch - / - עכברים בצענו רצף transcriptome שלם כדי לזהות את הגנים הדלקתיים שאינם לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי. כפי שניתן לראות בתרשים 2, מחסור Itch הביא ביטוי הפרש של מספר גנים. הדבר מצביע על כך החדרת תוך-קנה נשימה יכולה לשמש כדי לחקור דלקת ריאות, פרופילי ביטוי גני מסלולי איתות.
איור 1: Intra-קנה נשימת חיסון של NTHi גורם לדלקת ריאות בעכברי עכברים היו מחוסנים עם NTHi (10 6 CFU / עכבר) או פקד מלוח.. 24 שעות לאחר החיסון, עכברים הוקרבו (א) BALF נאסף. לויקוציטים סך הכל, מספרים מונוציטים ו נויטרופילים נקבעו. הנתונים מוצגיםכאמצעי ± SEM. n = 4 עכברים / קבוצה. * מציין p <0.05 בהשוואה לעכברים שטופלו מלוחים. ה (B) התאים BALF הוכתמו נוגדן אנטי Gr1 ונותחו על ידי FACS. (ג) H & E מוכתם סעיפי ריאה מראים חדירים לויקוציטים ודלקת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: ביטוי גנים דיפרנציאלי בתוך הריאות של WT ו Itch - / - עכברים הבאים חיסון התוך-קנה הנשימה NTHi 24 שעות לאחר חיסון NTHi, RNA היה מבודד מהריאות של שני WT (1, 2) ושני Itch - / -. (1, 2) עכברים. (א) איכות RNA נותח באמצעות bioanalyzer. (ב) המפה חומה מראה Z-score (פורש כמדד SD הרחקהממוצע) עבור ספירת log 2 למיליון (יומן 2 CPM) של 172 גנים לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי שזוהו באמצעות edger ב Itch - / -. לעומת עכברים WT אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בזאת, אנו מתארים הליך ייחודי פולשנית לחסן הריאות של עכברים עם פתוגן ריאות חיידקית. אנו מראים כי הליך זה יכול לשמש כדי לחקור את הפונקציה של גנים שונים באמצעות עכברים כי חסרים גנים של מסלולי איתות דלקתיים. הליך זה יכול לשמש גם כדי ללמוד את התגובות הדלקתיות לזיהומי ריאות ויראלית פטרייתי. היתרונות של הליך זה על פני שיטות אחרות כגון אף או שאיפת תרסיס הם (1) בהליך זה, הבידוד פתוגניים מוטמע ישירות דרכי הנשימה התחתונה; (2) את היכולת לשלוט על גודל הבידוד; ו (3) צמצם את הסיכון של חשיפת חיידקים למטפל.
חשיפה של קנה הנשימה בניתוח לצורך הקניית חיידקים היא צעד חיוני שבו יש לנקוט זהירות כדי למנוע גרימת נזק לרקמות שמסביב, במיוחד את כלי הדם.
החדרה של חיידקים לתוך קנה הנשימה shולד להיעשות בזהירות כדי למנוע את האפשרות של מוות של עכברים כתוצאה מחנק. הוא הציע כי הבידוד (סביב 50 μl) לשחרר באיטיות ואוויר להיות מוזרק לפני ואחרי הבידוד. שמירה על העכבר אנכי בעקבות ההחדרה לזמן ולשמור אותם רוחבי שכיבה מקלת התאוששות מהירה יותר. החסרון העיקרי של שיטה זו הוא בכך חשיפות מרובות בתוך פרק הזמן קצר אינן אפשריות בשל הדרישה של הניתוח. בעיה פוטנציאלית היא שאם את הקטטר ממוקם עמוק מדי הסמפונות, את ספירת תאי BALF תהיה נמוכה יותר. בעיה זו ניתן לפתור על ידי משיכת צינור מעט כלפי מעלה.
מאז בשכיחות מחלות דלקתיות בדרכי נשימה מתרבה ברחבי העולם 3,16, בהבנת פתופיזיולוגיה של מחלות אלה הוא בעל חשיבות מהמדרגה הראשונה. הטכנולוגיות המתוארות במחקר זה יכול לעזור לזהות מסלולי רגולטוריים מפתח יכולות להקל על הפיתוחשל שיטות טיפול חדשות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chocolate agar plate | Fisher Scientific | CAS50-99-7 | |
| Dextrose Anhydrous | Themo Scientific | R01300 | |
| Heparin | Hospira,Inc | RL-3010 | |
| Deft quick solution | Sigma | GS500-500ML | |
| Syringe needle 20/26G | BD | (REF305115/175) | |
| Iml syringe | BD | REF 309602 | |
| Catheter 20GA | BD | REF 381433 | |
| Dissecting Scissors, straight, 10 cm long | kentscientific | INS600393 | |
| Iris Forceps, serrated, 10cm long | kentscientific | INS650915 | |
| Tweezer #5 Stainless steel, 11cm long | kentscientific | INS600095 | |
| 10% Formalin | Fisher Scientific | CAS 67-56-1 | |
| Agarose | peqlab | 35-1020 | |
| 5ml polystyrene round-bottom tubes | BD | REF 352058 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Light Labs | A-7001-R | |
| Reasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Pellet pestile motor (Tissue homoginizer) | Sigma | Z359971-1EA | |
| 96 well microtiter plates V bottom | Thermo | 2605 | |
| 1X PBS | Gibco | 10010-023 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111-42 | |
| CD45.2-APC | eBioscience | 17-0454-81 | Working dilution 1:100 |
| Ly-6G-eFlor 450 | eBioscience | 48-5931-82 | Working dilution 1:100 |
| BSA | HyClone | SH30574.03 | |
| RBC Lysis Buffer (10X) | Biolegend | 420301 | |
| Live/Dead fixable aqua dead cell stain kit | Invitrogen | L-34957 | |
| EDTA (0.5M) | lifetechnologies | 15575-020 | |
| CD16/CD32 FcBlock | BD | 553142 | |
| Facs tubes polystyrene round bottom tube | BD | 352052 | |
| Formaldehyde | Polyscience | 4018 |
References
- Medzhitov, R.
- Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M.
- Barnes, P. J. Immunology of asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Nat Rev Immunol. 8, 183-192 (2008).
- Sethi, S., Murphy, T. F. Infection in the pathogenesis and course of chronic obstructive pulmonary disease. N Engl J Med. 359, 2355-2365 (2008).
- King, P. T., Sharma, R. The Lung Immune Response to Nontypeable Haemophilus influenzae (Lung Immunity to NTHi). J Immunol Res. 2015, 706376 (2015).
- Kapur, N., Grimwood, K., Masters, I. B., Morris, P. S., Chang, A. B. Lower airway microbiology and cellularity in children with newly diagnosed non-CF bronchiectasis. Pediatr Pulmonol. 47, 300-307 (2012).
- King, P. T., Holdsworth, S. R., Freezer, N. J., Villanueva, E., Holmes, P. W. Microbiologic follow-up study in adult bronchiectasis. Respir Med. 101, 1633-1638 (2007).
- Shuto, T., et al. Activation of NF-kappa B by nontypeable Hemophilus influenzae is mediated by toll-like receptor 2-TAK1-dependent NIK-IKK alpha /beta-I kappa B alpha and MKK3/6-p38 MAP kinase signaling pathways in epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 8774-8779 (2001).
- Moghaddam, S. J., et al. Haemophilus influenzae lysate induces aspects of the chronic obstructive pulmonary disease phenotype. Am J Respir Cell Mol Biol. 38, 629-638 (2008).
- Rajagopalan, G., et al. Intranasal exposure to bacterial superantigens induces airway inflammation in HLA class II transgenic mice. Infect Immun. 74, 1284-1296 (2006).
- Ganesan, S., et al. Elastase/LPS-exposed mice exhibit impaired innate immune responses to bacterial challenge: role of scavenger receptor A. Am J Pathol. 180, 61-72 (2012).
- Hogner, K., et al. Macrophage-expressed IFN-beta contributes to apoptotic alveolar epithelial cell injury in severe influenza virus pneumonia. PLoS Pathog. 9, e1003188 (2013).
- Karisola, P., et al. Invariant Natural Killer T Cells Play a Role in Chemotaxis, Complement Activation and Mucus Production in a Mouse Model of Airway Hyperreactivity and Inflammation. PloS one. 10, e0129446 (2015).
- Theivanthiran, B., et al. The E3 ubiquitin ligase Itch inhibits p38alpha signaling and skin inflammation through the ubiquitylation of Tab1. Sci Signal. 8, 22 (2015).
- Venuprasad, K., Zeng, M., Baughan, S. L., Massoumi, R. Multifaceted role of the ubiquitin ligase Itch in immune regulation. Immunol Cell Biol. , (2015).
- Decramer, M., Janssens, W., Miravitlles, M.
