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Immunology and Infection

の気管内の管理 Published: March 2, 2016 doi: 10.3791/53964
Automatic Translation
1, 1, 1
1Baylor Institute for Immunology Research, Baylor Research Institute

Abstract

ここでは、効率的かつ直接的にインフルエンザ菌を提供するための詳細な手順について説明します マウスの下気道へ。我々は、Hを調製するための手順を示しますインフルエンザ接種 、Hの気管内点滴注入示差遺伝子発現分析のために、肺、気管支肺胞洗浄液（BALF）を収集、BALF中の免疫細胞の分析、およびRNA単離にインフルエンザ 。この手順は、任意の細菌、ウイルスまたは真菌に対する肺の炎症反応を研究するために使用することができます。あまり曖昧で、それがより効率的に下気道への細菌接種を実現しているため直接気管点滴注入は、主に鼻腔内またはエアロゾル吸入手順よりも好ましいです。

Introduction

炎症は、感染性病原体に対する防御の基本的な免疫機構です。これは、病原体の根絶や損傷を受けた組織の修復を促進します。また、正常な健康状態1への回復を促進します。しかしながら、調節不全の炎症は、多くの場合、慢性炎症性疾患2に導きます。気道炎症は、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、喘息および肺線維症3などの異なる肺疾患の初期のトリガーです。

非分類できる（カプセル化されていない） インフルエンザ菌 （のNTHi）は、慢性上下の肺の炎症性疾患4,5に関連しています。これは、慢性閉塞性肺疾患の4,6,7の小児および成人の下気道から単離された優占種です。 NTHi感染後の炎症反応は、（例えば、TNFおよびIL-1βなどの）炎症性サイトカインを上方制御することを特徴とする、それはB媒介されますyのマイトジェンは、Toll様受容体（TLR）8を介してタンパク質キナーゼ（MAPK）および核因子κB（NF-κB）を活性化しました。

マウスモデルが異なるため遺伝子欠損株の入手可能性の肺の炎症性疾患の根底にある病理を分析するために非常に便利なツールです。いくつかの方法は、生/弱毒化細菌および鼻腔内滴下し、エアロゾル化した吸入9,10などの細菌産物を、接種するために使用されています。ここでは、気管内点滴注入を実証します。あまり頻繁に使用されますが、このアプローチは、より効率的であるため下気道への接種物の直接送達の再現性が高いです。

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Protocol

全ての実験は、ベイラー研究所の施設内動物管理使用委員会（IACUC）のガイドラインに従って行いました。

1.培養非分類できるインフルエンザ菌 （のNTHi）及び接種物を準備

  1. チョコレート寒天プレート上にプレートのNTHiし、37℃で一晩、加湿CO 2インキュベーター内で逆さまにプレートを保持し、5％CO 2。次の日、文化ブレインハートインフュージョンブロス中の細菌。その後、滅菌1.5ミリリットルチューブに培養液の1ミリリットルを追加します。
  2. 室温で5分間、4000×gで遠心分離します。その後、上清を破棄し、滅菌1×1mlのPBSにペレットを再懸濁。一度、この手順を繰り返します。
  3. 1×PBS900μlの中に再懸濁した溶液100μlを移し、分光光度計で600 nmの波長で希釈した培養の吸光度を測定します。
  4. 生存率およびコロニー形成単位を決定しますチョコレート寒天プレート上で1：10の連続希釈を培養し、37℃、5％CO 2で一晩インキュベートすることによって接種物のS（のCFU）。
  5. 前のステップから決定生存率およびCFUをに基づいて、20×10 6 CFU / mlの最終濃度になるように接種材料を調整します。

2.気管内（it）点眼

  1. 150 mg / mlでケタミン+ 20 mg / mlとキシラジン溶液でマウスを0.1ml / 10g体重で腹腔内マウス（腹腔内）注射します。手順は、動物を暖かく保つために、光源とフードの中で行われるべきです。
  2. マウスが十分に麻酔をかけていることを確認するために、マウスのインターデジタルスペースピンチ。
  3. その背中の上でマウスを置きます。首の腹側領域を剃るとクロルヘキシジンと70％のエチルアルコールで消毒します。
  4. ラット歯鉗子を使用して、首の上部腹の部分の皮膚を持ち上げます。メスを用いて胸腺上記小切開（0.5〜1.0センチメートル）を作りますそして、慎重に気管を露出させるために筋肉を解剖。
    1. 27 G針を1 mlシリンジを使用して、ゆっくりと別の0.05ミリリットルの空気が続くコントロールとして第1または生理食塩水から得られた0.05ミリリットルのNTHi続いて0.05​​ミリリットルの空気を、注入します。約1分間の垂直動物を保管してください。
  5. 手術用接着剤で切開を閉じます。約10分間横に横臥と暖かいマウスを保管してください。

3. BALFコレクション

  1. 感染後頸​​椎脱臼により24時間を、マウスを生け贄に捧げます。
  2. 解剖学的はさみでマウスの腹腔を開き、出血腹大動脈を切りました。肺の腹の部分を公開します。
  3. 気管を露出し、20ゲージのカテーテルとそれを挿管。 BALFバッファー（1×PBS、0.1％デキストロース、10 U / mlのヘパリン）の0.8ミリリットルを植え付けると穏やかな吸引によって洗浄を集めます。この手順を3回繰り返します。
  4. hemocytoを用いBALF懸濁液100μl中の細胞の総数を数えますトリパンブルー染色で倍率10倍の下メートル。
  5. 修正されたギムザ染色のためのスライドを準備します。 5分間、500×gでサイトスピンし、遠心分離器の適切なウェルにBALFのアリコートを100μl。 10分間スライドを乾燥させ、製造業者のプロトコルに従って修正ギムザ染色を用いて細胞を染色します。
  6. このような選別（FACS）蛍光活性化細胞、共焦点顕微鏡、遺伝子発現およびウエスタンブロット11-13のように、その後の分析のために残りの細胞を使用してください。

4.組織病理学の準備

  1. ステップ2.4​​で説明したように組織病理学的分析のために、のNTHiをマウスに感染させます。感染の24時間後、頸椎脱臼により動物を生け贄に捧げます。前述したように、肺や気管を露出するために、解剖学的はさみで胸腔を開いてカットします。その後、気管に20ゲージのカテーテルを挿入します。
  2. 4％ホルマリン中で調製2％温かいアガロース溶液で肺を埋めます。かつて肺が完全に膨張され、アガロース溶液を固化させるの肺の上部に氷を置きます。
  3. その後、慎重に胸部プラグを取り外し、それを、ヘマトキシリン​​およびエオシン（H＆E）切片用に処理されるまで、1×PBS中4％ホルマリン50mlの溶液に入れます。

BALF中の細胞を染色する5. FACS

  1. 96ウェルV底マイクロタイタープレートにBALF流体から1×10 5個の細胞を置きます。
  2. 4℃で3分間、4000×gで300の冷1×PBSμlのスピンで細胞を洗浄。
  3. （1：1,000希釈）100μlの1×PBSで細胞を染色溶液で細胞を染色し、室温で15分間保ちます。
  4. 4℃で3分間、4000×gでの冷1×PBS300μlで細胞を洗浄。
  5. 1を含有するFACS洗浄緩衝液[洗浄緩衝液（1×PBS、2％FBS、1mMのEDTA、0.1％アジ化ナトリウム]100μlに細胞を維持：100に希釈したFc-ブロックを4℃で15分間。
  6. 3分間の4000×gで遠心分離細胞とsupを捨てますernatant。
  7. 4℃で30分間、FACS洗浄緩衝液中（100希釈）100μlの表面染色カクテルで染色細胞。
  8. 4℃で3分間、4000×gでのFACS300μlの洗浄緩衝液で三回細胞を洗浄します。
  9. 室温で15分間、4％パラホルムアルデヒド100μlの細胞を固定。
  10. 4℃で3分間400×gで300μlの1×PBSで2回細胞を洗浄し、FACS洗浄緩衝液300μlに再懸濁。
  11. ビーズ、フローサイトメトリーを用いて、単一色の染色のコントロールを行います。
    1. 96ウェルV底マイクロタイタープレートにビーズの一滴を追加し、200μlの1×PBSで洗浄しました。
    2. 100μlの1×PBSおよびビーズに染色する抗体の1μl添加し、5分間室温でインキュベートします。
    3. 300μlの1×PBSで2回ビーズを洗浄してください。
  12. 14フローサイトメトリーにより単染色コントロール細胞を分析します。

RNAを単離するために、肺組織の6.均質化

  1. 感染後、肺の小片（20-40 mg）を収集し、4℃で一晩試薬を安定化RNAに保管してください。そして、次のステップまで-80℃で保管してください。
  2. RNA安定化試薬を取り除くために、冷1×PBSで肺組織を洗ってください。
  3. 溶解バッファー（1ミリリットルの溶解バッファー+10μlのβメルカプトエタノール）を含む1.5 ml遠心チューブに組織を置きます。
  4. 尖ったハサミを使用して小片に組織をみじん切りにし、20-40秒のためのコードレス電動機ペレット乳棒を用いて均質化します。
  5. 5分間氷上で溶解液を保持し、ステップ7.1に進みます。

肺から7 RNAの単離

  1. 3分間18,000×gで溶解液を遠心。ピペットで上清を除去し、慎重に新しい1.5 mlチューブに移します。
  2. 溶解物に70％エタノールの1ボリュームを追加します。ピペッティングにより直ちに混合し、2-4分間待ちます。
  3. 配置されたスピンカラムに溶解物の700μlにまで移します2 mlのコレクションチューブインチ
  4. 15秒9600×gで遠心分離し、フロースルーを捨てます。
  5. 350μlの15秒間9600×gで厳しい洗浄バッファーと遠心を追加します。フロースルーを捨てます。
  6. 私が直接スピンカラム・メンブレンに80μlのDNA分解酵素を加え、15分間室温で保管してください。
  7. 15秒間9600×gでスピンカラムや遠心に350μlの厳格な洗浄バッファーを追加します。フロースルーを捨てます。
  8. 15秒間9600×gで500μlのRNA洗浄緩衝液および遠心分離を追加します。フロースルーを捨てます。
  9. 2分間9600×gで500μlのRNAの洗浄バッファーとスピンを追加します。フロースルーを捨てます。
  10. 1分間9600×gで新しい2 mlのコレクションチューブと遠心分離機でスピンカラムを配置します。フロースルーを捨てます。
  11. 1分間9600×gでスピンカラムや遠心に直接30-50μlのRNaseフリー水を追加します。 -80℃で保存するRNA。
  12. RNAseq解析14を実行します 。

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Representative Results

気管内点滴注入は、生理食塩水を使用してインストールよりもBALF（ 図1A、左パネル）中の白血球の著しく増加数をもたらしました。白血球の差分カウント分析は明らかに増加した好中球浸潤（ 図1、右パネル）を示しました。 BALF中の細胞のFACS分析は、さらに、好中球数の増加（ 図1B）を確認しました。肺組織のH＆E染色切片の組織学的分析は、気道炎症（ 図1C）の増加を示しました。これらのデータは、一括して気管内点滴注入がマウスにおいて気道炎症を誘導することを示唆しています。気道病因を制御するシグナル伝達経路を研究するためのこのアプローチの使用をサポートするために、我々は、E3ユビキチンリガーゼの浮気のために欠損しているマウスを使用していました。かゆみは、炎症性シグナル伝達経路15の調節に関与することが知られています。私たちは、接種しました年齢と性別をマッチさせた野生型C57BL / 6コントロールとかゆみ - / - のNTHiでのマウス。 / - - 私たちは、対照WTとの浮気の肺組織からRNAを単離したマウスと示差的に発現している炎症性遺伝子を同定するために全トランスクリプトームシーケンシングを行いました。 図2に示すように、かゆみ欠損は、いくつかの遺伝子の示差的発現をもたらしました。これは、気管内点滴注入は、肺の炎症、遺伝子発現プロファイルおよびシグナル伝達経路を研究するために使用することができることを示唆しています。

図1
図1：のNTHiの気管内接種は、マウスの肺の炎症を誘導するマウスをのNTHi（10 6 CFU /マウス）または生理食塩水コントロールを接種しました。 24時間接種後、マウスを（A）BALFを採取し屠殺しました。総白血球、単球及び好中球数を測定しました。データが提示されています±SEMを意味します。 n = 4のマウス/群。 *生理食塩水を投与したマウスと比較してp <0.05を示します。 BALF中の（B）細胞は、抗群Gr1抗体で染色し、FACSによって分析しました。 （C）白血球浸潤や炎症を示すH＆E染色した肺切片は、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
図2：WTとかゆみの肺における遺伝子発現差- / -気管内のNTHi接種のNTHi接種後24時間は、RNAは2 WTの肺から分離した後のマウス （1、2）と2つのかゆみ- / - 。 （1、2）マウス。 （A）RNAの質は、バイオアナライザーを用いて分析しました。 （B）熱マップから離れてSDの尺度として解釈さ（Zスコアを示します万人あたりのログ2カウントの平均）は（かゆみにedgeRとを用いて同定された172示差的に発現される遺伝子の2 CPM）をログ- / - 。WTマウスと比較して、 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

ここで、我々は、細菌性の肺病原体にマウスの肺を接種するためにユニークな低侵襲の手順を説明します。我々は、この手順では、炎症性シグナル伝達経路の遺伝子が欠損しているマウスを用いて異なる遺伝子の機能を研究するために使用することができることを示しています。この手順はまた、ウイルスおよび真菌肺感染に対する炎症応答を研究するために使用することができます。このような鼻腔内またはエアロゾル吸入などの他の方法に比べて、この手順の利点は、（1）この手順では、病原性接種物は、直接下気道に点眼されています。 （2）接種材料のサイズを制御する能力を、 （3）ハンドラに対する細菌の曝露の危険性を減少させました。

外科的に細菌を浸透させるための気管の曝露は、ケアが周囲の組織、特に血管に損傷を与えないように注意しなければならない重要なステップです。

気管のshへの細菌の点滴窒息によるマウスの死亡の可能性を回避するために慎重に行うことがウルド。接種物（約50マイクロリットル）をゆっくりと放出され、空気が前と接種菌後に注入されていることが示唆されました。しばらく点眼後および横方向に早い回復を容易に横臥それらを維持する垂直マウスを維持します。この手順の主な欠点は、時間の短い期間内に複数回の露光が原因で手術の要求に可能ではないということです。潜在的な問題は、カテーテルが気管支に深すぎに配置されている場合は、BALF細胞数は低くなるということです。この問題は、わずかに上向きにチューブを引っ張ることによって解決することができます。

気道の炎症性疾患の発生率は、これらの疾患の病態生理を理解し、世界的に3,16増加しているので、最も重要です。この研究に記載された技術は、重要な調節経路を同定するのに役立つ可能性があり、開発を容易にすることができます新しい治療法の。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chocolate agar plate Fisher Scientific CAS50-99-7
Dextrose Anhydrous Themo Scientific R01300
Heparin Hospira,Inc RL-3010
Deft quick solution Sigma GS500-500ML
Syringe needle 20/26G  BD (REF305115/175)
Iml syringe BD REF 309602
Catheter 20GA BD REF 381433
Dissecting Scissors, straight, 10 cm long kentscientific INS600393
Iris Forceps, serrated, 10cm long kentscientific INS650915
Tweezer #5 Stainless steel, 11cm long kentscientific INS600095
10% Formalin Fisher Scientific CAS 67-56-1
Agarose peqlab 35-1020
5ml polystyrene round-bottom tubes BD REF 352058
1.5 ml Microcentrifuge tubes Light Labs A-7001-R
Reasy Mini  kit  Qiagen 74104
Pellet pestile motor (Tissue homoginizer) Sigma Z359971-1EA
96 well microtiter plates V bottom Thermo 2605
1X PBS Gibco 10010-023
OneComp eBeads eBioscience 01-1111-42
CD45.2-APC eBioscience 17-0454-81 Working dilution 1:100
Ly-6G-eFlor 450 eBioscience 48-5931-82 Working dilution 1:100
BSA HyClone SH30574.03
RBC Lysis Buffer (10X) Biolegend 420301
Live/Dead fixable aqua dead cell stain kit Invitrogen L-34957
EDTA (0.5M) lifetechnologies 15575-020
CD16/CD32 FcBlock BD 553142
Facs tubes polystyrene round bottom tube BD 352052
Formaldehyde Polyscience 4018

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References

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免疫号109、炎症、
の気管内の管理<em&gt;インフルエンザ菌</em&gt;マウスモデルにおいて気道炎症を研究します
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Venuprasad, K., Theivanthiran, B.,… More

Venuprasad, K., Theivanthiran, B., Cantarel, B. Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation. J. Vis. Exp. (109), e53964, doi:10.3791/53964 (2016).

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