Methodenartikel
Die Proteinhäufigkeit spiegelt die Raten sowohl der Proteinsynthese als auch des Proteinabbaus wider. Dieser Artikel beschreibt die Verwendung von Cycloheximid-Chase gefolgt von Western Blotting zur Analyse des Proteinabbaus im einzelligen Modell-Eukaryoten Saccharomyces cerevisiae (knospende Hefe).
Regulation der Proteinmenge ist entscheidend für nahezu jeden zellulären Prozess. Protein Fülle spiegelt die Integration der Geschwindigkeiten der Proteinsynthese und Proteinabbau. Viele Tests auf Proteinmenge Berichterstattung (zB Single-Zeitpunkt Western - Blot, Durchflusszytometrie, Fluoreszenzmikroskopie oder wachstumsbasierten Reporter - Assays) keine Diskriminierung der relativen Auswirkungen der Übersetzung und Proteolyse auf Protein - Ebene ermöglichen. Dieser Artikel beschreibt die Verwendung von Cycloheximid durch Western - Blot gefolgt Chase speziell Proteinabbau im Modell einzelliger Eukaryonten, Saccharomyces cerevisiae (Bäckerhefe) zu analysieren. In diesem Verfahren werden Hefezellen in Gegenwart des Translationsinhibitor Cycloheximid inkubiert. Aliquots von Zellen unmittelbar nach und in bestimmten Zeitpunkten nach der Zugabe von Cycloheximid gesammelt. Die Zellen werden lysiert und die Lysate werden durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt for Westernblot-Analyse von Proteinmenge zu jedem Zeitpunkt. Die Cycloheximid chase Verfahren ermöglicht die Visualisierung der Abbaukinetik der Steady-State-Population einer Vielzahl von zellulären Proteinen. Das Verfahren kann die genetische Anforderungen und Umwelteinflüsse auf den Proteinabbau zu untersuchen, verwendet werden.
Proteine erfüllen wichtige Funktionen in praktisch jeder zelluläre Prozess. Viele physiologische Prozesse erfordern die Anwesenheit eines spezifischen Proteins (oder Proteine) für einen definierten Zeitraum oder unter bestimmten Umständen. Organismen deshalb überwachen und Proteinmenge regulieren die zelluläre Bedürfnisse 1 erfüllen. Zum Beispiel Cycline (Proteine, die Zellteilung kontrollieren) vorhanden sind , in bestimmten Phasen des Zellzyklus und der Verlust der geregelten cyclin Ebenen hat mit malignen Tumorbildung 2 verbunden. Zusätzlich Proteinspiegel zu regulieren zelluläre Bedürfnisse zu erfüllen, verwenden Zellen zersetzenden Qualit....
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1. Wachstum und Ernte von Hefezellen
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Zu Cycloheximid chase Methodik, die Stabilität der deg1 -Sec62 (Abbildung 1), ein Modell Hefe endoplasmatischen Retikulum (ER) -assoziierten Degradation (ERAD) -Substrat wurde 42-44 veranschaulichen analysiert. In ERAD, Qualitätskontrolle Ubiquitin-Ligase-Enzyme kovalent an die ER-Membran lokalisiert Ketten des kleinen Proteins Ubiquitin an anomale Proteine anhängen. Solche polyubiquitylated Proteine werden anschließend aus dem ER und durch das Pr.......
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In diesem Dokument wird ein Verfahren Protein Abbaukinetik zur Analyse dargestellt. Diese Technik kann leicht zu einer Reihe von Proteinen, die durch eine Vielzahl von Mechanismen abgebaut angewendet werden. Es ist wichtig zu beachten, daß Cycloheximid chase-Experimente berichten über Abbaukinetik des steady state Pool eines bestimmten Proteins. Andere Techniken können die Abbaukinetik von spezifischen Populationen von Proteinen zu analysieren. Zum Beispiel kann die degradative Schicksal von naszierenden Polypeptiden du.......
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Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Die Autoren danken aktuellen und ehemaligen Mitgliedern des Rubenstein-Labors für die Bereitstellung einer unterstützenden und enthusiastischen Forschungsumgebung. Die Autoren danken Mark Hochstrasser (Yale University) für die Bereitstellung von Reagenzien und Fachwissen. E.M.R. dankt Stefan Kreft (Universität Konstanz) und Jennifer Bruns (University of Pittsburgh) für die Bereitstellung von unschätzbarem Fachwissen in der kinetischen Analyse von Proteinen. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Institutes of Health (R15 GM111713) an E.M.R., einen ASPiRE-Forschungspreis der Ball State University für E.M.R., einen Forschungspreis des Ball State University....
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Gewünschte Hefestämme, Plasmide, Standardmedium und Pufferkomponenten | |||
| Einweg-Borosilikatglasröhrchen | Fisher Scientific | 14-961-32 | Erhältlich von einer Vielzahl von Herstellern |
| Temperaturgeregelter Inkubator (z.B. Heratherm Inkubator Modell IMH180) | Dot Scientific | 51028068 | Erhältlich von einer Vielzahl von Herstellern |
| New Brunswick Austauschbare Trommel für 18-mm-Röhrchen (Röhrchenrolle) | New Brunswick | M1053-0450 | Eine Röhrchenrolle wird empfohlen, um Starterkulturen von Hefezellen über Nacht in Suspension zu halten. Wenn eine Röhrchenwalze nicht verfügbar ist, kann alternativ ein Plattformschüttler in einem temperaturgesteuerten Inkubator für Starterkulturen über Nacht verwendet werden. Ein Plattformschüttler oder eine Röhrchenrolle kann verwendet werden, um größere Kulturen in Suspension zu halten. |
| New Brunswick TC-7 Walzentrommel 120 V 50/60 H | New Brunswick | M1053-4004 | Zur Verwendung mit Rohrwalze |
| SmartSpec Plus Spektralphotometer | Bio-Rad | 170-2525 | Von verschiedenen Herstellern erhältlich |
| Zentrifuge 5430 | Eppendorf | 5427 000.216 | Der Rotor, der mit dem Gerät verkauft wird, fasst 1,5 und 2,0 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Rotor kann gegen einen Rotor ausgetauscht werden, der 15 und 50 ml konische Röhrchen fasst |
| Festwinkelrotor F-35-6-30 mit Deckel und Adaptern für Zentrifuge Modell 5430/R, 15/50 ml konische Röhrchen, 6-fach | Eppendorf | F-35-6-30 | |
| 15 ml Siebdruck-Schraubverschlussröhrchen 17 x 20 mm konisch, Polypropylen | Sarstedt | 62.554.205 | Erhältlich von einer Vielzahl von Herstellern |
| 1,5 ml Flex-Röhrchen, PCR-saubere, natürliche Mikrozentrifugenröhrchen | Eppendorf | 22364120 | Erhältlich von einer Vielzahl von |
| Herstellern Analoge Dri-Bad-Heizgeräte | Fisher Scientific | 1172011AQ | Es wird empfohlen, zwei Heizgeräte zur Verfügung zu stellen (einen zum Inkubieren von Zellen während der Cycloheximid-Behandlung und einen zum Kochen von Lysaten zur Denaturierung von Proteinen). Alternativ 30 Grad C-Wasserbad kann zur Inkubation von Zellen in Gegenwart von Cycloheximid verwendet werden. Ein kochendes Wasserbad mit Heizplatte kann alternativ zur Denaturierung von Proteinen verwendet werden. |
| Heizblock für 12 x 15 ml konische Röhrchen | Fisher Scientific | 11-473-70 | Zur Verwendung mit Dri-Bath Heater während der Inkubation von Zellen in Gegenwart von Cycloheximid. |
| Heizblock für 20 x 1,5 ml konische Röhrchen | Fisher Scientific | 11-718-9Q | Zur Verwendung mit Dri-Bath Heater zum Kochen von Lysaten für die Proteindenaturierung. |
| SDS-PAGE Betriebs- und Übertragungsgeräte, Netzteile und bildgebende Geräte oder Dunkelkammern für SDS-PAGE und Übertragung auf Membran | Variiert je nach Labor und Anwendung | ||
| Western-Blot-Bildgebungssystem (z. B. Li-Cor Odyssey CLx Scanner und Image Studio Software) | Li-Cor | 9140-01 | Variiert je nach Labor und Anwendung |
| EMD Millipore Immobilon PVDF-Transfermembranen | Fisher Scientific | IPFL00010 | Variiert je nach Labor und Anwendung |
| Primäre Antikörper (z. B. Phosphoglyceratkinase (Pgk1) Monoklonaler Antikörper, Maus (Klon 22C5D8)) | Life Technologies | 459250 | Variiert je nach Labor und Anwendung |
| Sekundäre Antikörper (z. B. Alexa-Fluor 680 Kaninchen Anti-Maus IgG (H + L))Life | Technologies | A-21065 | Variiert je nach Labor und Anwendung |
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