Die Isolierung von murinen Coronary glatten Gefäßmuskelzellen

Zusammenfassung

Der Zweck dieses Protokolls ist es, die Isolierung und Kulturtechniken von murinen primären vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs) aus dem koronaren Kreislauf zu demonstrieren. Sobald VSMCs isoliert wurden, können sie für viele Standardkulturtechniken verwendet werden.

Zusammenfassung

Während die Isolierung und Kultivierung von glatten Gefäßmuskelzellen (VSMCs) aus großen Gefäßen gut etabliert ist, haben wir versucht und Kultur VSMCs aus dem Herz-Kreislauf zu isolieren. Herzen mit intakten Aortenbogen wurden über retrograden Langendorff mit Verdauungslösung , enthaltend 300 Einheiten / ml Kollagenase Typ II, entfernt und perfundiert 0,1 mg / ml Sojabohnen - Trypsin - Inhibitor und 1 M CaCl _2. Die perfusates wurden 90 min bei 15 Minuten-Intervallen gesammelt, durch Zentrifugation pelletiert, in plating Medien resuspendiert und auf Gewebekulturschalen plattiert. VSMCs wurden durch die Anwesenheit von SM22α, α-SMA und Vimentin gekennzeichnet. Einer der Hauptvorteile dieser Technik der Verwendung ist die Fähigkeit VSMCs aus dem koronaren Kreislauf von Mäusen zu isolieren. Obwohl die geringe Anzahl von Zellen, für die die Zellen können isoliert koronaren VSMCs werden werden in einer Vielzahl von gut etablierten Zellkulturtechniken und ASSA erhalten können einige Anwendungen begrenzen verwendet, verwendetys. Studien VSMCs aus genetisch veränderten Mäuse können weitere Informationen über Struktur-Funktions-und Signalprozesse, verbunden mit vaskulären Erkrankungen bieten zu untersuchen.

Einleitung

Das Ziel dieser Methode ist, vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs) von der murine Koronarzirkulation für die Verwendung in der Zellkultur und Standard-Zellkultur-Assays zu isolieren. Wir entwickelten diese Technik, die molekularen Mechanismen des vaskulären Remodelling bei Diabetes zu beurteilen. Wir haben früher nach innen hypertrophen Umbau in den septalen koronarer Arteriolen in der db / db - Maus - Modell von Diabetes ¹ berichtet. Aufgrund der begrenzten Menge an in den murinen septalen Koronararterien, experimentellen Standardtechniken gefunden Körpergeweben Protein Veränderungen (zB Western - Blot) in db / db Mäusen und Kontrollmäusen sind bestenfalls schwierig. Darüber hinaus haben wir bereits gezeigt , dass der Angiotensin - Rezeptor - Blocker (ARB) Losartan den Umbau in db / db - Mäusen beobachtet ² reduziert. Daher Isolierung von primären VSMCs aus dem Herz-Kreislauf ermöglicht es uns, weitere Veränderungen im Phänotyp VSMC untersuchen oder aktivierten Signalwege in diabetischen Mäusen, die Beiträgen sein kannting widriger koronaren Arteriolen Umbau.

Zahlreiche Studien haben canonical Signalwege VSMCs isoliert aus Nagetier Aorta, anstatt in jedem spezifischen Gefäßbett unter Verwendung erläutert. Wir haben jedoch Gefäßbett spezifischen Umbau in Koronar-, Aorten gezeigt, und mesenterialen Zirkulationen von db / db - Mäusen ^1, die VSMCs in jedem Gefäßbett was darauf hindeutet , kann unterschiedlich sein. Daher ist es notwendig, VSMCs von jedem Gefäßbett zu isolieren, um besser auf die pathologischen Veränderungen verstehen in jedem Satz von VSMCs auftreten. Es gibt eine Vielzahl von verschiedenen Methoden zur Isolierung und Kultivierung von Aorten-VSMCs. Jedoch Derzeit gibt es nur eine Studie , die auf die Isolierung von VSMCs von der Maus Koronarzirkulation ³ veröffentlicht wurde. Teng et al. war der Erste, der ein Verfahren zur Isolierung von VSMCs von der Maus Koronarkreislaufs Bericht zu erstatten; jedoch haben wir das Protokoll erheblich geändert, da sie auch endothelial cel isoliertls. Andere Labors habe auch das Protokoll von Teng et al. Koronaren Arterienmuskelzellen und glatten Atemwegsmuskelzellen ^4,5 zu isolieren. Die Veränderungen, wir aufgenommen haben, wird eine Population von Zellen ergeben hoch für VSMCs aus dem Herz-Kreislauf angereichert.

Die retrograden Perfusion des isolierten Säugetierherzens oder Langendorff - Technik wurde 1897 von ⁶ Oscar Langendorff etabliert und wird noch heute weit verbreitet für die Isolierung von Herz - Kreislauf - Zellen verwendet. Die Technik, die hier präsentiert, gepaart mit dem Fortschritt der modernen murinen genetischen Veränderungen, stellt ein wertvolles Instrument zur näheren Untersuchung des molekularen Verhalten von VSMCs aus dem Herz-Kreislauf.

Protokoll

Ethik-Erklärung: Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Leitlinien durchgeführt, und es wurde von der Institution Animal Care und Use Committee bei Nationwide Kinderkrankenhaus zugelassen.

1. Vorbereitung / Einstellungen

Anmerkung: Diese Isolationstechnik erfordert zwei Langendorff Heizschlangen Seite an Seite angeordnet auf einem Ringständer, und parallel zu einem zirkulierenden Wasserbad verbunden.

1. Schalten Sie Wasserbad zirkuliert und die Temperatur anpassen eine endgültige Temperatur von 33-34 ° C an der Spitze der Langendorff-Kanüle (das Wasserbad verwendet in diesem Satz zu erreichen up wird auf 40 ° C aufgrund einer 6-7 ° C Verlust in Temperatur über Schläuche). Schalten Sie die Perfusion Pumpen und setzen Perfusionsrate bis 0,5 ml / min.
   1. Reinigen sowohl der Wassermantel Heizschlangen angebracht Schläuche und 25 Gauge Kanüle durch jeweils mit 50 ml 70% Ethanol, gefolgt von 100 ml des autoklavierten Reinstwasser Spülung.
   2. Deaktivieren Sie die HeizschlangenLuft mit einer Spritze und wasche mit 10 ml Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) ohne Phenolrot durch Drücken. Lassen Sie HBSS in den Heizschlangen und Schläuche.
   3. Bringen Sie eine sterile 10 ml Luer-Lock-Spritze mit Raumtemperatur HBSS ohne Phenol gefüllt rot auf den Schlauch. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen in den Schlauch und Heizschlangen eingefangen werden, wenn die HBSS Spritze angebracht, da diese Luftembolien während der Verdauung die dazu führen könnten sich negativ auf die VSMC Isolation auswirken.
2. Entfernen Sie die 25-Gauge-Kanüle von den Heizschlangen und auf einem anderen sterilen 10-ml-Spritze gefüllt mit eiskaltem HBSS ohne Phenolrot. Halten Sie diese auf Eis bis zum Gebrauch. Wiederholen Sie dies für die anderen Kanüle.
3. Bereiten Enzymaufschlußlösung.
   1. Wiegen Kollagenase Typ 2 nach bestimmten Chargennummer für 75 ml Aufschlußlösung auf eine Endkonzentration von 300 Units / ml zu erreichen.
   2. Auflösen Kollagenase in 75 ml HBSS mit Phenolrot. Als Nächstes fügen Sie 1,5 ml 00,1 mg / ml Sojabohnen - Trypsin - Inhibitor und 75 ul 1 M CaCl ₂ zur Mischung.
4. Bei der Verwendung von sofort die Aufschlußlösung, erwärmen sie auf 37 ° C. Wenn nicht, legen Sie sie bei 4 ° C für bis zu 6 Stunden. Diese Lösung muss täglich frisch hergestellt werden.
5. Bereiten Sie die Stop-Lösung / Plattenmedien.
   1. Je 100 ml hitzeinaktiviertem FBS, 5 ml L-Glutamin, 5 ml der nicht-essentielle Aminosäuren, 5 ml HEPES, und 1 ml primocin zu 500 ml hohen Glucose (4,5 g / l) DMEM. Filtersterilisation wird empfohlen.
   2. Aliquot 6 ml der Stopplösung in jede von zwölf 15 ml konische Röhrchen, nummeriert A1-A6 und B1-B6, und bei 4 ° C. Aliquot 50 ml Stopplösung in einem 50 ml konischen und in 37 ° C-Inkubator.
      Anmerkung: Dieser Schritt kann auch den Tag hergestellt werden, vor der Isolierung, falls erforderlich. Diese Stop-Lösung wird als die Plattierung Medien nach Zellisolierung verwendet werden.
6. Bereiten Sie zwei 1 ml Spritzen mit einer 30 G-Nadel ausgestattetmit 100 & mgr; l Heparin (1000 Einheiten / ml).
7. Schneiden Sie ein 5 cm großes Stück 5-0 chirurgische Seide. Binden Sie eine lose Überhandknoten in der OP-Seide mit einem Ende doppelt so lang ist wie die andere. Setzen Sie auf die 25-Gauge-Kanüle, aber nicht zu fest anziehen. Wiederholen Sie dies für die anderen 25 G Kanüle.
8. Füllen Sie vier 35 mm sterile Petrischalen (# 1-4) mit 2 ml sterilem, eiskaltem, HBSS ohne Phenolrot. Halten Sie sich auf dem Eis.

2. Euthanasie, Herz Isolation und Kanülierung

1. Vor Herz Isolierung zu gewährleisten, dass die Aufschlusslösung und 50 ml konischen Stopplösung warm sind. Entfernen Sie die HBSS Spritze mit aufgesetzter 25 G Kanüle aus dem Eis und in eine Bürettenklemme (oder Ring Stativklemme) an einem Ringständer.
2. Anesthetize Mäuse unter Verwendung von 3% Isofluran. Bestätigen Sie die Maus durch eine Zehe Berührung auf jedem Hinterbein betäubt. Wenn die Beinzuckungen, wird die Maus noch nicht betäubt, so 1 min warten und die Zehen berühren wiederholen.
3. Setzen Sie die Halsvene durch das Fell ein Entfernennd Haut auf der anterioren des Halses mit einer Schere. Als nächstes benutzen Pinzette vorsichtig rund um die Halsvene jedes Fett zu entfernen. Nach dem Entfernen von Fett, injizieren langsam 100 & mgr; l Heparin (1000 Einheiten / ml). Legen Sie einen chirurgischen Schwamm über die Vene starke Blutungen zu vermeiden.
4. Nach 1 min, um offene Brust Herz, Lift Herz mit einer gebogenen Pinzette belichten und auszuschneiden es einer Schere, um sicherzustellen, intakt durch die erste brachiocephalic Zweig die aufsteigende Aorta zu halten. Unmittelbar danach ist Herz in einer 35-mm-Schale (# 1) mit eiskaltem HBSS ohne Phenolrot und spülen.
   Hinweis: Führen Sie die folgenden vier Schritte mit einem Binokular.
5. Positionieren Sie die 25 G Kanüle, die in einem Winkel von 45 ° stehen auf dem Ring angebracht ist, so dass die Spitze knapp unter der Oberfläche eiskaltem HBSS in Schale # 2 befindet und ist deutlich sichtbar durch das Binokular. Übertragen Sie das Herz auf Teller # 2.
6. Mit Dumont Pinzetten, setzen die Aorta durch sanft überschüssige Fettgewebe über stumpfe Dissektion p Entfernenrevent Punktierung oder Einreißen der Aorta. Als nächstes verwenden Zange die Aorta über die 25 G Kanüle zu gleiten.
7. Führen Sie die Kanüle nach unten durch die Aorta, in der Nähe, aber nicht über die Aortenklappe, die die Integrität des Ventils beeinträchtigen wird und deshalb die Retroperfusion. Sobald die Kanüle an Ort und Stelle ist, schieben Sie den vorgebunden Seide über die Aorta, und festziehen. Binden Sie einen zweiten Knoten um die Aorta einen quadratischen Knoten zu bilden, das Herz zu sichern.
8. Sobald die Aorta fest gebunden ist, spülen Sie vorsichtig das restliche Blut aus dem Herz-Kreislauf mit dem eiskalten HBSS in der Spritze mit der Kanüle 25 G angebracht. Achten Sie darauf, zu viel, um nicht drücken, um übermäßige koronarer Druck zu vermeiden. Nur eine sehr langsame und sanfte Spülung erforderlich ist, die bündig abzuschließen. Leckagefreie Aorten-Kanülierung kann auch während dieser sanften bündig zu beachten.
9. Schalten Sie die Perfusionspumpe den Fluss von HBSS zu beginnen. Entfernen Sie die 25 G Kanüle (mit dem Herzen angebracht) von der HBSS Spritze, die Pflege zuhalten Sie die Kanüle Nabe mit HBSS gefüllt, und schließen Sie es an den warmen HBSS gefüllten Heizschlangen. Beginnen Perfusion des Herzens mit der Transfusionspumpe mit einer Rate von 0,5 ml / min für 8 min.
10. Nachdem das erste Herz einer Kanüle versehen ist und auf dem System durchblutet wird, wiederholen Sie die Schritte 2,1-2,8 für das zweite Herz. Diese Isolationen für jedes Herz versetzt sein, damit eine sorgfältige Planung und Timing erforderlich sind.

3. Verdauung

1. Nachdem sie mit HBSS gespült, die Spritze 10 ml HBSS derzeit eine auf der Pumpe mit 10 ml vorgewärmten Aufschlußlösung gefüllt verändern. Perfundieren jedes Herz mit Aufschlußlösung für 12 min bei einer Geschwindigkeit von 0,5 ml / min. Sammeln Sie keine Fraktionen, die aus diesem ersten Aufschluss ergeben, da dies jeden Rest Blut und Endothelzellen enthalten wird.
2. Nach 12 min, ml / min, legen Sie eine 15 ml konischen (Rohr A1 oder B1, für jede Verdauung mit dem ersten oder zweiten Herz entspricht), um die Perfusion Rate mit kaltem Stopp solut gefüllt bis 0,4 ändernIon in einem Eiskübel unterhalb des Herzens, um VSMC angereicherte Perfusat Sammlung zu beginnen.
3. Nach 15 min, die konische für 10 Minuten unmittelbar nach der Entnahme aus beiden Fraktionen bei 89 xg bis Rohr A2 oder B2 und Schleuder konischen Rohr A1 und B1 Sammlung ändern. Wenn die Spritze mit der Aufschlußlösung auf die Pumpe gefüllt weniger als 1 ml Lösung, zu ersetzen mit einer frisch gefüllten 10-ml-Spritze der Aufschlußlösung.
4. Nach der Zentrifugation absaugen Überstand aus jeder Sammelröhrchen, so dass etwa 0,5 ml. Pellet aus A1 mit 2 ml warmem Stop-Lösung (oder Plattierung Medien). In Aufwirbelung von A1 Rohr B1 Rohr und das Röhrchen in 37 ° C-Inkubator mit der Kappe lose.
5. Wiederholen Sie die Schritte 3.3 und 3.4 bis alle Rohre (bis A6 und B6) für eine Gesamtsammelzeit von 90 min verwendet. Bei 80 min der Verdauung, schneiden Sie die Herzspitze öffnen, um alle Zellen auszuspülen, die innerhalb der Kammer gefangen werden können und sammeln diese Zellen in Rohr A6 und B6, welche nach Süctively.
   Hinweis: Gelegentlich wird das Herz fallen die Kanüle vor dem 90 Minuten-Zeitpunkt ab. Wenn dies der Fall ist, rufen Sie das Herz und die Stelle in eine sterile 35 mm Petrischale gefüllt mit 2 ml Aufschlußlösung. Schneiden Sie die Spitze des Herzens und sanft das Herz mit Aufschlußlösung spülen. Als nächstes filtern die 2 ml Aufschlusslösung durch eine sterile 100 & mgr; m Zelle Sieb in einem 50 ml konischen und in den Schlauch A6 oder B6.
6. Nach jeder Drehung der anschließenden Rohre (A2 und B2), die resuspendierten VSMCs zum vorherigen Sammelröhrchen (kombiniert A1 und B1) hinzuzufügen. Auch darauf achten, nicht die Aufschlusslösung in die Pumpe laufen zu lassen und schalten Sie die 10-ml-Spritzen nach Bedarf in der gesamten Verdauung.
7. Nachdem alle Rohre kombiniert werden, Zentrifuge die VSMC reiche Suspension bei 89 × g für 10 min.
8. Aspirieren wie viel Überstand von Sammelröhrchen wie möglich. Resuspendieren verbleibende Pellet in 2 ml Medium und die Platte auf einer 35-mm-Kulturschale Plattieren. Platz Kulturschale in 37 ° C Inkubator für 24 Stunden.

4. Zellkultur

Hinweis: Führen Sie die verbleibenden Schritte in der Biosicherheitsschrank.

1. Nach 24 Stunden absaugen sanft die Plattenmedien. Die Kultur wird normalerweise eine große Menge an Schmutz. Um die Zellen zu waschen, fügen Sie 2 ml warmem, sterilem PBS und sanft das Gericht gegen zwei Fingern tippen, während im Uhrzeigersinn dreht.
2. Nach dem Drehen um 360 °, die PBS absaugen und ein zweites Mal wiederholen. weitere 2 ml steriler, warm PBS absaugen PBS und hinzufügen. Überprüfen Sie die Kulturschale unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, gibt es wenig auf der Platte kein Schmutz ist. Zellkonfluenz kann ebenfalls zu diesem Zeitpunkt bestimmt werden.
3. Wenn Schmutz in der Kulturschale bleibt, wiederholen Sie Schritt 4.2. Wenn die Kulturschale frei von Schmutz ist, die PBS absaugen und 2 ml warmem Plattierung Medien hinzufügen.
4. Nach 24 Stunden wieder waschen Sie die Zellen mit warmem, sterilem PBS jede endgültige Schutt oder toten Zellen aus der Kultur zu entfernen. Saugen Sie das PBS und pschnüren weitere 2 ml warmem Plattenmedien auf den Zellen.
5. Schauen Sie auf den täglich Zellen und ernähren sich alle 48 Stunden mit frisch aufgewärmt Plattierung Medien. An diesem Punkt können die Zellen für Standard-Zellkultur-Assays verwendet werden. VSMCs sollte ca. 80% konfluent 4-5 Tage nach der Plattierung, obwohl bis zu 7 Tage dauern kann, bis das Verfahren perfektioniert. Wenn Splitting auf nachfolgende Passagen, maximal 1 verwenden: 4 35 mm-Schalen (oder einem vergleichbaren Bereich der Kulturschalen).

Ergebnisse

Aufgrund der neuartigen Aspekt unserer koronaren VSMC Isolationstechnik haben wir versucht, um die Reinheit der Zellisolierung zu bestimmen. Maus identifiziert koronaren VSMCs auf der Grundlage ihrer Morphologie und Immunofluoreszenz-Färbung bis zu Passage 2. Aufgrund der Morphologie der Zellen in der Kultur nach der ersten Wäsche, die Isolationsprozedur entfernt effektiv Kardiomyozyten und Endothelzellen. Die VSMCs behalten ihre Morphologie bis Kanal 2 (Figur 1). Es bes...

Diskussion

Der Zweck dieser Studie war es bestehende Zellisolierung Protokolle anzupassen, die Ausbeute an koronaren glatten Gefäß von murinen Herzen zu erhöhen. Die meisten der Pionierarbeit in der Biologie der glatten Gefäßmuskulatur wurde mit kultivierten Rattenaorta glatten Muskelzellen durchgeführt. Diese Studien grundlegende Kenntnisse der molekularen Mechanismen zur Verfügung gestellt , die VSMC Wachstum steuern, Migration und Hypertrophie ^7. Da jedoch das Feld fortschritt, wurde es offensichtlich, daß VSMC Phäno...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Fötales Rinderserum	Life Technologies	16140-071
HEPES 1 M Lösung	Fisher	MT-25-060
Primocin - 20 ml	Invivogen	ant-pm-2
DMEM (hoher Glukosegehalt, Natriumpyruvat, L-Glutamin)	Life Technologies	11995-065
MEM NEAA 10 mM 100x	Life Technologies	11140-050
L-Glut 200 mM - Gibco	Life Technologies	25030-081
Steriles Zellsieb 100 & Mikro; m Nylon Mesh	Fisher	22363549
Nunclon Polystrene Schale mit Deckel, steril, 35 mm	Fisher	12-565-91
Harvard Apparatus schwarz Seide Naht 5-0	Fisher	14-516-124
Kollagenase Typ-2	Worthington Biochemical	LS004176
Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor 25 mg	Sigma	T6522
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), flüssig (klar)	Life Technologies	14175-103
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x), flüssig (phenolrot)	Life Technologies	14170-161
5,0 ml Heizspirale mit Entgasungsblasenfalle	Radnoti	158830
11 plus Pumpe	Harvard Apparatus	70-2208
Umwälzpumpe			jeder Marke funktioniert

für beheiztes Wasser