Sequential Anwendung von Glasplättchen die Drucksteifigkeit der Maus Objektiv zu beurteilen: Stamm und morphometrische Analysen

Zusammenfassung

Altersbedingte Zunahmen der Augenlinsensteifigkeit sind mit Presbyopie verbunden. Dieses Protokoll beschreibt eine einfache, kostengünstige Methode zur Messung der Steifigkeit von Mauslinsen. Mauslinsen werden, wie menschliche Linsen, mit zunehmendem Alter steifer. Diese Methode ist präzise und kann für Objektive von größeren Tieren angepasst werden.

Zusammenfassung

Die Augenlinse ist ein transparentes Organ, das Licht bricht und konzentriert sich auf die Netzhaut ein klares Bild zu bilden. Beim Menschen Vertrag Ziliarmuskeln die Linse zu verformen, zu einer Erhöhung führt in der Linse "optische Leistung auf nahe Objekte scharf, ein Verfahren, wie Unterkunft bekannt. Altersbedingte Veränderungen in der Linsensteifigkeit haben Presbyopie in Verbindung gebracht worden, eine Verminderung der Linse die Fähigkeit aufzunehmen, und durch Erweiterung, die Notwendigkeit für eine Lesebrille. Auch wenn die Maus Linsen aufnehmen oder nicht entwickeln Presbyopie, Mausmodelle können einen unschätzbaren genetisches Werkzeug für das Verständnis Objektiv Pathologien bieten, und die beschleunigte Alterung bei Mäusen beobachtet, ermöglicht die Untersuchung von altersbedingten Veränderungen in der Linse. Dieses Protokoll zeigt, eine einfache, präzise und kostengünstiges Verfahren für Maus Linsensteifigkeit Bestimmung unter Verwendung von Glasdeckgläser sequentiell Druckbelastungen auf die Linse Erhöhung anzuwenden. Repräsentative Daten bestätigen, dass die Maus Linsen steifer mit dem Alter, wiemenschliche Linsen. Dieses Verfahren ist sehr gut reproduzierbar und kann potenziell Testlinsen von größeren Tieren zu mechanisch skaliert werden.

Einleitung

Die Linse ist ein transparentes und avaskuläres Organ in der vorderen Augenkammer, das für die feine Fokussierung des Lichts auf die Netzhaut verantwortlich ist. Eine klare Basalmembran, die als Linsenkapsel bezeichnet wird, umgibt eine Masse länglicher Faserzellen, die von einer vorderen Monoschicht aus Epithelzellen bedeckt^{sind 1,2}. Das lebenslange Wachstum der Linse hängt von der kontinuierlichen Proliferation und Differenzierung der Epithelzellen am Linsenäquator in neue Faserzellen ab, die konzentrisch zu früheren Generationen von Faserzellen hinzugefügt werden². Im Laufe der Zeit verdichten sich die Linsenfaserzellen, was zu einem starren Zentrum in der Mitte der Linse führt, das als Nucleus¹ bezeichnet wird. Akkommodation, definiert als eine dioptrische Änderung der optischen Leistung des Auges, tritt beim Menschen auf, wenn sich die Ziliarmuskeln zusammenziehen, um die Linse zu verformen und eine echte Erhöhung der optischen Leistung zu ermöglichen, um auf nahe Objekte^3-5 zu fokussieren. Beim unangepassten Auge wird die Linse aufgrund der Spannung durch zonuläre Fasern in einem relativ abgeflachten Zustand gehalten. Wenn sich die Ziliarmuskulatur zusammenzieht, wird die Spannung auf die Linse gelöst, was zu einem verringerten äquatorialen Durchmesser der Linse und einer erhöhten axialen Dicke führt. Altersbedingte Veränderungen der Linse verursachen Presbyopie, einen fortschreitenden Verlust der Linsenanpassung, der dazu führt, dass eine Lesebrille benötigt wird.

Mehrere Studien haben Presbyopie mit altersbedingter Zunahme der intrinsischen Steifigkeit der Linse in Verbindung gebracht^6-11. Die Steifigkeit ist definiert als der Widerstand eines elastischen Objekts, sich unter aufgebrachter Last zu verformen. Eine Vielzahl von Verfahren wurde verwendet, um die Steifigkeit menschlicher Linsen zu untersuchen, darunter die Spinkompression^12-14, die Aktuatorkompression¹⁵, die Sondeneindrücke¹⁶, die dynamisch-mechanische Analyse ^6,10 und die blasenbasierte akustische Strahlungskraft¹⁷. Während Mauslinsen keine Presbyopie aufnehmen oder entwickeln, sind Mausmodelle für Linsenpathologien wertvolle Werkzeuge, da Mäuse kostengünstiger sind als größere Tiere, genetisch gut charakterisiert sind und aufgrund des schnellen Alterns beschleunigte altersbedingte Veränderungen erfahren. Eine Handvoll Studien hat die Steifigkeit der Linsensteifigkeit von Mäusen mit Kompressionsmethoden untersucht und Veränderungen der Linsensteifigkeit aufgrund von Alterung oder gezielten genetischen Störungen gezeigt^18-21. Daher sind Mauslinsen gute Modelle, um altersbedingte Veränderungen der Linsensteifigkeit zu untersuchen.

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und kostengünstige, aber dennoch präzise und reproduzierbare Kompressionsmethode zur Bestimmung der Steifigkeit von Mauslinsen, basierend auf dem Auftragen von Glasdeckgläsern auf die Linse in Verbindung mit dem Fotografieren der Linse durch ein Präpariermikroskop und einen Spiegel. Diese Methode liefert robuste Dehnungs- und morphometrische Daten mit einer einfach herzustellenden und zu montierenden Apparatur. Die repräsentativen Ergebnisse bestätigen, dass Mauslinsen mit zunehmendem Alter an Steifigkeit zunehmen.

Protokoll

Alle Tier Verfahren wurden in Übereinstimmung mit Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durch die National Institutes of Health und im Rahmen einer genehmigten Protokoll, das von der Institutional Animal Care und Use Committee am Scripps Research Institute durchgeführt.

1. Objektiv Dissection

1. Euthanize Mäuse gemäß den Empfehlungen in den National Institutes of Health "Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren" und zugelassene Institution Tier Protokolle verwenden.
2. Enucleate das Auge von Mäusen mit einer gebogenen Pinzette. Drücken Sie das Gewebe um das Auge mit der Zange aus der Steckdose, das Auge zu bringen, und dann reiß das Auge aus der Steckdose mit der Zange. Bringen Sie die Augen an die frische 1x phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) in Dissektion Gericht.
3. Schneiden Sie den Sehnerv so nah an der Augapfel wie möglich. Sanft und vorsichtig einsetzen feinen Pinzette gerade in den Augapfel durch das Loch where der Sehnerv tritt aus dem hinteren.
4. machen sorgfältig einen Einschnitt mit einer Schere in den Augapfel vom hinteren zum Rand der Hornhaut. Nagetier Linsen besetzen ~ 30% des Auges. Nehmen Sie diese Einschnitte sorgfältig und nicht einlegen Pinzette oder Schere zu tief in das Auge eine Beschädigung der Linse zu vermeiden.
5. Geschnitten entlang der Verbindung zwischen der Hornhaut und Sklera mindestens um die halbe Augapfel.
6. Drücken Sie vorsichtig auf der Hornhaut, die Linse aus dem Auge durch die Öffnung in den Schritten 1.4 und 1.5 gemacht zu entfernen.
7. Verwenden Sie feine Spitze gerade Pinzette vorsichtig jede große Trümmer zu entfernen, die noch am Objektiv angebracht ist. Eine Sichtprüfung des Objektivs für Schäden vor den Steifigkeitsmessungen fortfahren.

2. Steifigkeitsmessungen

1. Wiegen Sie mindestens 10 Deckgläser aus dem gleichen Feld einer Analysenwaage verwenden. Finden Sie das durchschnittliche Gewicht der Deck. Daher sollten Sie das gleiche Feld von Deckgläsern für alle Experimente. VornässenDie Deckgläser und rechten Winkelspiegel bei Raumtemperatur für mindestens 2 h in 1x PBS vor Experimente beginnen.
2. Füllen Sie die Messkammer (siehe Abbildung 1) mit 65 bis 75 ml 1x PBS. Die Messkammer wurde aus Plexiglas mit einer hauseigenen Maschinenhalle und Einschläge in der Kammer wurden durch eine Bohrmaschine auf die gewünschte Tiefe mit einem geeigneten Bohrer gemacht. Linsen verbleiben in 1x PBS bei Raumtemperatur für die Dauer der mechanischen Prüfung transparent.

Abb . 1: Steifigkeitsmesskammer ein Foto , um die Abmessungen der maßgeschneiderte Steifigkeitsmesskammer mit einer Vielzahl von Einschläge von verschiedenen Tiefen und Formen zeigt. Die runden Einschläge, die 200 & mgr; m oder 300 & mgr; m tief (gelbe Pfeile) werden für die Messungen an der Maus Linsen verwendet werden. Divots sind 2 mm im Durchmesser und ~ 13-. 14 mm vom Rand der Kammer Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

3. Platzieren Sie rechts Winkelspiegel in die Kammer mit einem konstanten Abstand von der Divot, die verwendet werden, wird die Linse zu halten. Stellen Sie sicher, dass der Spiegel nicht während des Experiments nicht bewegt.
4. Transfer seziert Linsen Messkammer sorgfältig mit Greifzange oder einer gebogenen Pinzette.
5. Nehmen Sie eine Draufsicht Bild des unbelasteten Linse direkt von oben. Nehmen Maus Objektiv Fotos bei 30-facher Vergrößerung mit Beleuchtung von Binokular (unten) und eine Faseroptik-Lichtquelle auf der linken und rechten Seite. Stellen Sie die faseroptische Stromversorgung zu 80% der maximalen Lichtintensität. Stellen Sie die Stromversorgung Ausgabe basierend auf Umgebungsbeleuchtung, Benutzereinstellung und Bildqualität nach Bedarf.
6. Nehmen Sie eine Seitenansicht Bild des unbelasteten Linse, die durch die ri zu sehen istght Winkelspiegel. Wenn die Kamera nicht kalibriert ist, nehmen Sie ein Bild von der Spiegelrand im Fokus. Der Spiegelrand ist 5 mm lang, und diese Messung später verwendet werden, können die Pixel / mm und dienen als Maßstab in den Bildern zu bestimmen.
7. Platz Linse in das Divot, und bestätigen, dass die Linse fest sitzt und gerade in der Divot. Nehmen Sie ein Bild von der Linse vor dem Laden. Die Linse sollte in der Divot an der vorderen oder hinteren Pol ruhen.
8. Platz 1 Deckglas vorsichtig auf die Linse. Warten Sie 2 min Kriechen zu ermöglichen, und nehmen Sie eine andere Seitenansicht Bild der geladenen Linse.
9. Weiterhin Zugabe von Deckgläsern, wie in Schritt 2.8 und unter Seitenansicht Bilder nach der Zugabe von jedem Deckglas, wie in Schritt 2,8 bis insgesamt 10 Deckgläser aufgebracht.
10. Entfernen Sie alle Deckgläser. Warten Sie 2 Minuten, und nehmen Sie eine Seitenansicht Bild der Linse (innerhalb und außerhalb des Divot), nachdem Sie alle Deckgläser zu entfernen.

3. Objektiv Nucleus Mess

1. Um bestimine Linsenkerngröße, bewegen Sie die Linse auf eine saubere Petrischale mit 1x PBS gefüllt.
2. Sanft decapsulate die Linse fein gerade Pinzette.
3. Slough die kortikale Faserzellen aus, indem die Linse zwischen behandschuhten Fingern rollen. Der verbleibende Linsenkern wird wie eine harte Marmor fühlen. Verwenden Sie dieses Verfahren, um den Kern auf die Erwachsenen Linsen zu isolieren, um Alter von 1 Monat beginnen. Da der isolierte Kern ein starrer Körper ist, weitere mechanische Prüfung des Linsenkerns ist, kann nicht unter Verwendung dieses beschriebenen Verfahrens durchgeführt werden.
4. Spülen Sie vorsichtig den Linsenkern in 1x PBS in der Petrischale.
5. Setzen Sie den Linsenkern zurück in die Messkammer (nicht in der Divot), und nehmen Sie ein Bild des Linsenkerns durch den rechten Winkelspiegel.

Abbildung 2: a . Durch Deckgläser Druck Maus Objektive (A) Schematische und (B) Fotografie des experimental Setup einen 2 Monate alten Maus-Objektiv in einem 200 & mgr; m tief Divot in der Messkammer gefüllt mit 1x PBS zeigt. Ein rechter Winkelspiegel und eine Digitalkamera auf einem Präpariermikroskop angebracht wurden verwendet, um Bilder der Linse während der Kompression durch Deckgläser zu sammeln. (C) Fotos von sagittalen Ansichten eines 2 Monate alten Wildtyp-Linse komprimiert, indem nacheinander Anzahl von Deck Erhöhung vorgesehen, um die Rohdaten zur Messung von axialen und äquatorialen Durchmesser und Berechnung axialen und äquatorialen Sorten während Deck-basierten Druckprüfung. Eine Reflexion der Linse kann manchmal in den Deckgläsern zu sehen (am deutlichsten sichtbar in der 1 Deckbild). Bei Messungen, ignorieren zu dem Scheitelpunkt der Linse, um die Reflexion und zu messen. (D) Fotos von sagittalen Blick auf die 2-Monate alten Wildtyp-Objektiv Nachverdichtung und der isolierten Linsenkern. Die Nachverdichtung Linse und isolierte Kern außerhalb des Divot sitzen. Maßstabsbalken, 1 mm. Diese Zahl wird geändert von Gokhin, et al. PLoS One, 2012 ^19. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

4. Bildanalyse

1. Messen Sie äquatorialen und axialen Durchmesser der Linsen vor dem Laden und nach jedem Ladeschritt mit ImageJ oder ähnliche Software. Messen der Durchmesser jedes Linsenkern. Der Linsenkern ist nahezu kugelförmige so eine Messung bei jeder Ausrichtung ^19,21 ausreichen.
2. Korrigieren Sie die Linse axialen Durchmesser von verwendet, um die Tiefe des Divot Zugabe. In der Messkammer, verdeckt das Divot 200 um (2 Monate alten Maus-Linsen) oder 300 um (4 Monate alte und 8 Monate alten Maus-Linsen) der axialen Dicke der Linse.
3. Berechnen der axialen und äquatorialen Stämme aus der Linsendurchmesser - Messungen unter Verwendung der Gleichung, ε = (d - d ₀₎ / d ₀ ist , wobei ε - Stamm ist, d der axiale oder eQuatorial Durchmesser bei einer gegebenen Last ist , und d ₀ der entsprechenden axialen oder äquatorialen Durchmesser bei Nullast.
4. Zeichnen Sie die axialen und äquatorialen Sorten als Funktionen der auferlegten Last (in mg).
5. Zeichnen Sie die axial, äquatorialen und Kerndurchmesser. Berechnen und zeichnen Sie das Objektiv Seitenverhältnis durch die axiale Durchmesser durch den äquatorialen Durchmesser geteilt wird.
6. Berechnen und zeichnen Sie das Objektiv Volumen unter Verwendung der Gleichung, Volumen = 4/3 × π × r _E ² × r _A, wobei r _E ist der äquatoriale Radius und r _A die axiale Radius aus dem Bild in Schritt 2.6 genommen , gemessen. Diese Gleichung nimmt die Linse ist eine Oblate Sphäroid (Ellipsoid) ^1,22.
7. Berechnen und zeichnen Sie die Kernvolumen unter Verwendung der Gleichung, Volumen = 4/3 × π × r _N ^3, wobei r _N der Radius des Linsenkerns ist , wie aus dem Bild in Schritt 3.5 genommen gemessen. Diese Gleichung nimmt den Linsenkern isa Kugel ^19,21.
8. Berechnen und Plotten der nukleären Fraktion als das Verhältnis des Kernvolumens zum Objektiv Volumen.

Ergebnisse

Die Steifigkeit und die Abmessungen der 2-, 4- und 8-Monate alten Maus Linsen wurden gemessen. Die Mäuse wurden alle Wildtyp-Tiere auf einem reinen Hintergrund C57BL6 Stamm aus der Zuchtanlage TSRI Tier erhalten, und jede Linse wurde mit 1 bis 10 Deckgläser geladen. Die axialen und äquatorialen Stämme wurden als Funktion der aufgebrachten Last berechnet, indem die axialen und äquatorialen Durchmesser der Linse nach der Zugabe von jedem Deckglas zu messen und dann jede Änderung des Durchm...

Diskussion

Es gibt mehrere wichtige Überlegungen bei der Verwendung dieser Methode Linse Steifigkeit zu messen. Zuerst werden die Deckgläser auf die Linse bei einem leicht schrägen Winkel aufgetragen (8-8,5 °) in Bezug auf den Boden der Kammer (θ). Dies wird eine sehr kleine Komponente der Last anwenden aquatorial anstatt axial. Allerdings ist diese äquatorialen Last als vernachlässigbar , da sin θ ≈ 0,1 ^19. Wenn dieses Verfahren für größere Linsen angepasst ist, müsste der Winkel der Deckgläser auf den Boden der Kammer...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Feine Pinzette gerade Zange	Fine Scientific Tools	11252-40
Mikrodissektionsschere, gerade Schneide	Fine Scientific Tools	15000-00
Gebogene Pinzette	Fine Scientific Tools	11272-40
Greifzange	Hammacher	HSC 702-93	Optionale
Sezierschale	Fisher Scientific	12565154
60 mm Petrischale	Fisher Scientific	0875713A
1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)	Life Technologies	14190
18 x 18 mm Glasdeckgläser	Fisher Scientific	12-542A
Messkammer mit Vertiefungen zur Aufnahme von Linsen			Sonderanfertigung (siehe Abbildung 1)
Rechtwinkliger Spiegel	Edmund Optics	45-591
Lichtquelle	Schott/Fostec	8375
Beleuchtetes Präpariermikroskop	Olympus	SZX-ILLD100	Mit SZ-PT Fototubus
Digitalkamera	Nikon	Coolpix 990