Methodenartikel

Herstellung von 3D-Kollagen-Gel und Mikrokanäle für das Studium der 3D-Interaktionen In Vivo

DOI:

10.3791/53989

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9. Mai 2016

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1Department of Cell and Regenerative Biology, University of Wisconsin-Madison, 2Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison, 4Morgridge Institute for Research, University of Wisconsin-Madison, 5Paul P. Carbone Comprehensive Cancer center, University of Wisconsin-Madison

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Kollagen ist eine Kernkomponente des ECM und liefert wichtige Hinweise für verschiedene zelluläre Prozesse im Bereich von Migration auf die Differenzierung und Proliferation. Vorausgesetzt, hier ist ein Protokoll für die Zellen in 3D-Kollagen-Hydrogele und eine fortgeschrittene Technik zur Erzeugung von randomisierten oder ausgerichteten Kollagenmatrizes mit PDMS Mikro einbetten.

Zusammenfassung

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Historisch gesehen wurden die meisten zellulären Prozesse in nur 2 Dimensionen untersucht. Während diese Studien Aufschluss über die allgemeinen zellulären Signalmechanismen geben, vernachlässigen sie wichtige zelluläre Hinweise, die sie aus den strukturellen und mechanischen Eigenschaften der lokalen Mikroumgebung und der extrazellulären Matrix (EZM) erhalten. Um zu verstehen, wie Zellen innerhalb einer physiologischen EZM interagieren, ist es wichtig, sie im Rahmen von 3-dimensionalen Assays zu untersuchen. Zellmigration, Zelldifferenzierung und Zellproliferation sind nur einige Prozesse, von denen gezeigt wurde, dass sie durch lokale Veränderungen der mechanischen Eigenschaften einer 3-dimensionalen EZM beeinflusst werden. Kollagen I, eine fibrilläre Kernkomponente der EZM, ist mehr als ein einfaches Strukturelement eines Gewebes. Unter normalen Bedingungen steuern mechanische Signale aus dem Kollagennetzwerk die Morphogenese und erhalten die zellulären Strukturen. In erkrankten Mikroumgebungen, wie z. B. der Tumormikroumgebung, wird das Kollagennetzwerk oft dramatisch umgebaut, was eine veränderte Zusammensetzung, eine verbesserte Ablagerung und eine veränderte Faserorganisation zeigt. Bei Brustkrebs ist der Grad der Faserausrichtung wichtig, da eine Zunahme der ausgerichteten Fasern senkrecht zur Tumorgrenze mit einer schlechteren Prognose der Patientinnen korreliert ist1. Ausgerichtete Kollagenmatrizen führen zu einer erhöhten Verbreitung von Tumorzellen durch persistente Migration2,3. Im Folgenden finden Sie ein einfaches Protokoll für die Einbettung von Zellen in ein 3-dimensionales, fibrilläres Kollagen-Hydrogel. Dieses Protokoll lässt sich leicht an viele Plattformen anpassen und kann reproduzierbar sowohl ausgerichtete als auch zufällige Kollagenmatrizen für die Untersuchung der Zellmigration, Zellteilung und anderer zellulärer Prozesse in einer abstimmbaren, 3-dimensionalen, physiologischen Mikroumgebung erzeugen.

Einleitung

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Viele zelluläre Prozesse wurden ausgiebig in 2 Dimensionen untersucht, wodurch ein kollektives Wissen über grundlegende zelluläre Signalmechanismen entsteht. Diese Studien vernachlässigen jedoch wichtige zelluläre Hinweise, die sie aus den strukturellen und mechanischen Eigenschaften der lokalen zellulären Mikroumgebung und der extrazellulären Matrix (EZM) erhalten. Um besser zu verstehen, wie Zellen in einem physiologischen Kontext interagieren, ist es wichtig, sie in 3-dimensionalen (3D) Assays zu untersuchen. Die ECM für diese 3D-Assays kann entweder aus Zellen gewonnen oder aus gereinigten Proteinen rekonstituiert werden. Unabhängig von der Quelle der EZM haben sich 3D-Matrix-Assays als von unschätzbarem Wert erwiesen, um zu verstehen, wie Zellen in der physiologischen Welt navigieren und interagieren. Zum Beispiel zeigen Zellen, die in 3D-Matrizen gezüchtet wurden, unterschiedliche Fortbewegungsmodi, die von der mechanischen Beschaffenheit ihrer umgebenden EZM abhängen, die in2D-Experimenten 4-6 nicht beobachtet werden. Darüber hinaus weisen in 3D kultivierte Zellen auch weniger und weniger ausgeprägte Stressfasern und fokale Adhäsionen auf als ihre Gegenstücke, die auf harten Oberflächen wie Glas oder Kunststoff gezüchtet wurden7.

Die Bedeutung von kontextbezogenen 3D-Assays beschränkt sich jedoch nicht nur auf die Zellmigration. Einige andere zelluläre Signalereignisse können nur mit Hilfe von 3D-Assays untersucht werden. Während der Gewebe- und Zelldifferenzierung liefert die Steifigkeit des extrazellulären Milieus und der EZM Signale, die morphogene Ereignisse beeinflussen können. So tritt die tubulogenese des Brustepithels nur in 3D-Matrizen mit geringer Steifigkeit auf, nicht aber in steifen Matrizen oder auf 2D-Substraten8,9. Wenn sie in steifen 3D-Matrizen kultiviert werden, nehmen dieselben Epithelzellen einen aberranten Phänotyp mit erhöhter Proliferation und Zellmembranvorsprüngen an, die durch veränderte FAK- und ERK-Signale angetrieben werden10. Es ist bekannt, dass viele andere Signalwege und zelluläre Prozesse in ähnlicher Weise von der Steifigkeit der lokalen zellulären Umgebung beeinflusst werden, und diese Signalkaskaden unterstreichen die Bedeutung der Untersuchung von Signalereignissen und des zellulären Phänotyps im Kontext geeigneter lokaler mechanischer Eigenschaften einer 3D-ECM.

Kollagen I ist ein besonders relevantes Protein für in vitro Studien, da es die am häufigsten vorkommende Komponente der EZM ist und für viele der mechanischen Eigenschaften der zellulären Mikroumgebung verantwortlich ist. Während es ursprünglich nur als Strukturprotein angesehen wurde, ist seine Rolle heute bekanntermaßen viel komplexer. Die Zusammensetzung, Architektur, Orientierung, Dichte und Steifigkeit der Kollagenfasern liefern ein konzentriertes Milieu an Signalinformationen5. Während des Fortschreitens bestimmter Krankheiten, wie z. B. chronischer Entzündungen und Tumorgenese, wird das Kollagennetzwerk dramatisch umgebaut2,11. Genauer gesagt bei Brustkrebs begleiten eine erhöhte Kollagenablagerung und Gewebesteifigkeit das Fortschreiten des Tumors und tragen wahrscheinlich dazu bei. Bei diesen frühen Tumoren erscheint das versteifte Kollagennetzwerk angespannt und ausgerichteter, so dass die meisten Fasern den wachsenden Tumor einkapseln2. Mit fortschreitendem Tumor reorganisiert sich das Kollagen weiter und Regionen des fibrillären Netzwerks orientieren sich senkrecht zur Tumorgrenze2,12. Die senkrechte Ausrichtung dient als prognostischer Biomarker, wenn diese Patienten ein schlechteres krankheitsfreies Fortschreiten und ein schlechteres Gesamtüberleben aufweisen1. Eine Erklärung für diese Korrelation ist, dass die schlechten Ergebnisse eine Folge der erhöhten Verbreitung von Tumorzellen durch persistente Zellmigration in ausgerichteten Kollagennetzwerken sind3.

Um zu verstehen, wie Zellen spezifisch auf Ausrichtung und Organisation reagieren, die bei der Tumorprogression beobachtet wird, ist es notwendig, sowohl zufällige als auch ausgerichtete 3D-Kollagenmatrizen für Experimente zu erzeugen. Es gibt drei grundlegende Methoden, um die Ausrichtung innerhalb von fibrillären Netzwerken zu induzieren. Bei der ersten Technik wird ein dehnungsinduzierendes Gerät verwendet, bei dem das Kollagen zwischen zwei Punkten zusammengezogen oder gedehnt wird, um eine Ausrichtung zu erzeugen. Fasern, die parallel zur Kraftachse verlaufen, werden straff gezogen, während Fasern, die senkrecht zur Achse stehen, zusammengedrückt und geknickt werden. Während dehnungsinduzierte Techniken in der Regel eine hervorragende Ausrichtung bieten, erfordert dieser Ansatz sperrige Geräte, die nicht ohne weiteres an viele Plattformen angepasst werden können3,13. Alternativ kann ein zellinduzierter Stamm erzeugt werden, indem lokalisierte Pfropfen von Zellen platziert werden, die sich anschließend zusammenziehen und das Kollagenausrichten 13. Diese Methode hat das Problem, dass sie variabel ist, da sich viele Parameter ändern können. Das zweite Verfahren nutzt magnetische Kügelchen und ein Magnetfeld während der Polymerisation, um die Kollagenausrichtung zu induzieren13,14. Mit dieser Methode können mit einfachen Geräten gute Ergebnisse erzielt werden, aber es erfordert die Verwendung von Antikörpern oder einer anderen Methode, um das Polymer zu magnetisieren. Daher kann es etwas teuer in der Anwendung sein, und die Steifigkeit des Kollagengels wird möglicherweise durch die erhöhten Verbindungen im Netzwerk verändert. Darüber hinaus sind die bei diesem Prozess verwendeten magnetischen Kügelchen oft autofluoreszierend, was für bildgebende Experimente problematisch ist. Schließlich kann die Ausrichtung durch die mikrofluidischen PDMS-Kanäle3,15,16 erzeugt werden. Bei dieser Methode wird die Kollagenausrichtung erreicht, indem polymerisierendes Kollagen durch kleine mikrofluidische Kanäle fließt. Diese mikrofluidischen Kanäle können in einer Vielzahl von Designs hergestellt werden und sind leicht an viele Plattformen anpassbar. Darüber hinaus sind sie sehr wirtschaftlich, da aufgrund ihrer geringen Größe sehr geringe Mengen an Kollagen und anderen Reagenzien verwendet werden.

Hier ist ein einfaches Protokoll für die Einbettung von Zellen in ein 3-dimensionales, fibrilläres Kollagen-Hydrogel. Darüber hinaus ist eine fortschrittlichere Technik, bei der PDMS-Mikrofluidikkanäle verwendet werden, um die Organisation und Ausrichtung der Kollagenmatrix zu steuern, ebenfalls vorgesehen. Dieses Protokoll lässt sich leicht an viele Plattformen anpassen und kann reproduzierbar sowohl ausgerichtete als auch zufällige Kollagenmatrizen für die Untersuchung der Zellmigration, Zellteilung und anderer zellulärer Prozesse in einer 3-dimensionalen, physiologischen Mikroumgebung erzeugen.

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Protokoll

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1. Neutralisation, Verdünnung und Polymerisation von Kollagen-Lösungen für 3D-Untersuchung und zelluläre Kontraktions Assays

  1. Auf dem Eis in sterilen Gewebekultur Kapuze, neutralisieren Kollagen (1: 1) mit sterilem, eiskaltem 100 mM HEPES in 2x PBS, pH 7,4, in einem 15 ml konischen Röhrchen. Mischen Sie gründlich mit Plastikpipette, bis die Lösung homogen ist und Misch Wirbel sind nicht mehr sichtbar. Achten Sie darauf, keine Luftblasen während des Mischprozesses einzuführen. Bewahren Sie kurz auf Eis.
  2. Verdünnte neutralisierte Collagen auf die geeignete Konzentration mit Zellmedium (wie RPMI, DMEM, etc.).
    1. Zur Berechnung der Menge an neutralisierten Kollagen zu bilden gewünschte Kollagen - Konzentration erforderlich ist , verwenden Sie die Gleichung N = (D * V) / (S / 2), wobei N Menge an neutralisierten Kollagen ist erforderlich, D die gewünschte Kollagen - Konzentration ist , V das Endvolumen der Kollagenkonzentration gewünscht ist, und S ter beginnt Lager Kollagen-Konzentration.
    2. Bringen die Menge der neutralisierten Collagen-zu-Volumen durch die Zugabe von einer Zelle und Zellmedien Lösung auf. Gut mischen und auf Eis halten, bis sie bereit zu werfen.
      1. Beispiel: Bei einer 2 mg / ml Gel in einem 1 ml Gelvolumen (typisches Volumen für ein Gel gegossen in 6-Well-Platte oder 50 mm Glasbodenschale), multiplizieren Sie zunächst die gewünschte Konzentration (2 mg / ml) durch das gewünschte Endvolumen (1 ml). Nehmen Sie diese Zahl (2 mg) und teilen sie durch die Hälfte der Stoffkonzentration auf der Flasche aufgeführt (9,49 mg / ml). In diesem Fall werden mit 0,58 ml Medium / Zellmischung 0,42 ml der neutralisierten Collagen verdünnt.
  3. Pipettieren der eiskalten Kollagen / Zelle / Medien in Mischung entweder eine Kultur nicht zu behandelnde Gewebe 6-Well-Platte oder eine 50 mm Glasbodenschale. Verwenden Sie Pipettenspitze gleichmäßig die Lösung verteilt.
    HINWEIS: Es ist wichtig, eine nicht-Gewebekultur-behandelte Platte zu verwenden, um die Bindung oder das Wachstum der Zellen außerhalb des collag zu minimierenen-Gel.
  4. Man lässt etwa 10 bei Raumtemperatur zu polymerisieren - 15 min. Die Gele sollten undurchsichtig bei der Polymerisation drehen.
  5. Nachdem es undurchsichtig geworden ist, bewegen Platte oder einen Teller bis 37 ° C für weitere 45 - 60 min Polymerisation zu beenden.
  6. Nach 45 - 60 min, fügen Sie 2 - 3 ml Medium und Release-Gele von den Seiten des Bohrlochs durch eine p200 Pipettenspitze um Umkreis von gut oder Schale läuft. Swirl Gericht sanft das Gel zu lösen. Das Kollagen-Gel sollte in den Medien zu schweben.

2. Western Blotting, Cell Morphogenese und Gel Gontractility Assay

  1. Um Protein-Spiegel, der Morphologie oder zelluläre Kontraktionsfähigkeit in Bezug Steifigkeit an das ECM, beginnen durch Gießen Collagengele, gemäß 1.1 beurteilen - 1.6, entkernt mit Zellen für einen 7 - 10 Tage-Test. Bestimmen Sie jede empirisch Särate Zelllinie in Abhängigkeit von Wachstumsrate und Konfluenz. 100.000 Zellen / Gel - Für einen 10 Tage-Test kann die Aussaatdichte von 20.000 liegen.
  2. MessenZellkontraktilität, messen Sie den Gel Durchmesser durch ein Lineal oder eine Kamera Intervall alle 24 Stunden oder zu gegebener Zeit verwendet wird.
    Anmerkung: Zusätzlich entsprechende Bilder von dem Mikroskop gesammelt können in dem Gel, wie Acini artige Strukturen, epithelialen Tubuli, zellulärer Vorsprünge und lameliapodia ausgesät für morphologische Merkmale Charakteristik der Zelllinie untersucht werden.
  3. Proteinspiegel, lysieren die Gele in RIPA - Puffer und Verfahren zur Western - Blot - Analyse von Proteinen von Interesse zu bewerten , wie in Wozniak et al. 17 und Gallagher et al. 18.
    1. WICHTIG: Bei Vergleichen der Kontraktilität zwischen Zelllinien, normalisieren Kontraktilität Gesamt - DNA, die aus den Gelen extrahiert werden kann , wie von Lui skizziert, et al 19, oder zu einem unveränderlichen, Housekeeping - Protein (Histone, GAPDH, etc.) durch Western. Blot - Analyse, wie in Wozniak et al. 17 und Gallagher et al. 18. Wenn das Zählen Zellen innerhalb des Gels eine Zählkammer, stellen Sie sicher, Zellzahl auf insgesamt Gelfläche als Auftraggeber Gel zu normalisieren Zellen konzentrieren.
  4. Feed-Gele alle 3 - 4 Tage von 1 ml Medium entfernt und durch 1 ml frisches Medium ersetzt. Stellen Sie sicher, Gele zu füttern, nachdem die Messung als die Zugabe von frischem Medium / Serum genommen wird, wird eine Spitze in der Kontraktilität führen.

3. Erzeugung von PDMS Mikrokanäle für Collagen Faserjustage

Hinweis: Um ausgerichtet Kollagenmatrices, eine Form für PDMS Mikrokanäle (2A) erfordert eine SU-8 - Silizium - Master hergestellt über Softlithographie 15 erzeugen.

  1. Um PDMS Kanäle machen, mischen PDMS gründlich in einem Einwegbecher mit einem Handwerks-Stick. Für einen 6-Zoll-Silikon-Master, mit 2 g Härter 20 g Elastomerbasis mischen.
  2. De-Gas die PDMS-Mischung durch die Einwegbecher in einer Vakuumkammer unter einem Vakuumdruck Platzierung von550 mm Hg. De-Gas mit 1 - 1,5 Std.
  3. Während die PDMS Entgasen, bereiten Sie das Silikon-Master für das Gießen. Bereiten Sie mit einem sauberen Blatt Transparentfolie auf einer Heizplatte, gefolgt von der Silikon-Master platzieren. Stellen Sie sicher, dass die Mikrokanalform nach oben zeigt.
    HINWEIS: Bei PDMS Gießen und Aushärten der Silikon Master wird zwischen zwei Platten aus Transparentfolie sandwichartig angeordnet werden.
  4. Nach 1 bis 1,5 Stunden, entfernen Sie die entgaste PDMS aus der Vakuumkammer, und gießen Sie langsam den Silikon-Master.
    WICHTIG: Vermeiden Sie Luftblasen. Weiter in der Mitte des Master zu gießen, und lassen Sie die Schwerkraft gleichmäßig zu verteilen.
    HINWEIS: Die PDMS Abfall muss nicht den ganzen Weg bis zum Rand des Masters zu verlängern.
  5. Nach PDMS auf das Master gegossen wurde, ein zweites Blatt Transparentfolie auf der Oberseite des Silikon-Master und PDMS anzuwenden. Vorsichtig rollen die zweite Transparenzblatt nach unten auf der Oberseite des PDMS / Silikon-Master-Luftblasen zu vermeiden. Überstürz es nicht. PDMS sollte nun gleichmäßig verteilt over-Master.
  6. Sanft legen Sie eine Gummiplatte auf der Oberseite der Transparenz, durch eine 1/8 "Acrylfolie gefolgt.
  7. In drei 10 lb Gewichte auf dem Acrylglasplatte. Zunächst werden die Gewichte "schweben". Lassen Sie sie zu regeln und zu stabilisieren, bevor Sie fortfahren.
  8. Stellen Sie Heizplatte Temperatur auf 70 ° C und Heilung PDMS für 4 Stunden. Lassen Sie für mindestens 1 zusätzliche Stunde abkühlen, bevor Sie zu stören.
  9. vorsichtig abziehen oberste Blatt Transparentfolie aus dem Wafer, und entfernen Sie die Kanäle mit einer Zange.
  10. Shop in staubfreien Schale bis zum Gebrauch.

4. Prepping PDMS Mikrokanäle für den Einsatz

  1. Platz Kanäle den Kopf auf neue, saubere Transparentfolie. Reinigen Sie alle Ports (Abbildung 2b) mit Kreisbewegung mit einer scharfen Zange. Entfernen Sie alle Fragmente von PDMS.
  2. Saubere Kanäle durch ein Stück Klebeband als Staubtuch verwenden. Das Band auf der Oberfläche der Bank (klebrigen Seite nach oben), und dann Kanal o eingestelltn oben. Drücken Sie auf Kanäle mit runden Ende Zange einen guten Kontakt zu gewährleisten. Entfernen Sie und wiederholen Sie auf beiden Seiten bis zum sichtbaren Verschmutzungen entfernt wird.
  3. Transfer gereinigt, desinfiziert PDMS Kanäle in ein 50 ml konisches mit 70% EtOH. Vortex bei maximaler Geschwindigkeit für 30 Sekunden. Entsorgen Sie EtOH und ersetzen mit frischen 70% EtOH. Shop in 70% EtOH bis zum Gebrauch.
  4. In Gewebekultur Haube und aseptische Techniken, übertragen Sie die PDMS-Kanäle auf eine saubere und sterile Abdeckung aus Glas oder Glasbodenschalen. Setzen Sie den Kanal nach oben und UV-Behandlung bis EtOH verdampft ist.
  5. Nach dem Trocknen, drehen Sie die PDMS so die Kanäle nach unten in Richtung Abdeckglas konfrontiert sind. Drücken Sie die PDMS-Kanal auf dem Glas nach unten, um eine gute Abdichtung zu machen. Fügen Sie einen Patch von sterilen PDMS zu bedecken / Schließen der Mitte - Port (Port B, 2b). Lassen Sie gründlich zu trocknen, bevor Sie fortfahren.
  6. Pre-coat das Innere des Kanals mit 10 & mgr; g / ml Kollagen in sterilem Wasser. Zur Beschichtung, legen Sie ein 100 & mgr; l Tröpfchen auf der Spitze eines channel und mit Vakuum ziehen durch. Nach 1 Stunde bei 37 ° C, Übertragungskanäle mit Kollagen-Beschichtungslösung auf einen Kühlschrank gefüllt. Chill für ca. 15 - 30 min.
  7. Entfernen Sie Kollagen-Beschichtungslösung mit Saugvorrichtung oder pipettieren und Kollagen Vorbereitung beginnen.

5. Collagen Vorbereitung für den Einsatz in Mikrokanälen

  1. Auf dem Eis, neutralisieren Kollagen (1: 1) mit eiskaltem 100 mM HEPES in 2x PBS, pH-Wert 7,4. Gut mischen, bis sie homogen ist (Für weitere Einzelheiten siehe Abschnitt 1.1).
  2. Verdünnen Sie neutralisierten Kollagen zu den entsprechenden Konzentrationen mit Zellmedien (Für weitere Einzelheiten siehe Abschnitt 1.2). Inkubieren für 15 Minuten auf Eis.
  3. Zur gleichen Zeit, montiert Kühlkanäle auf Eis.
    HINWEIS: Das Ziel, alle Komponenten für den Kanal Prozess bei 4 ° C oder unten zu haben. Collagen Nukleation Temperatur und Zeit sind wichtige Parameter zur Polymerisation und kann der Ausgangspunkt für die weitere Optimierung sein, falls erforderlich.
  4. CounT-Zellen mit einem Hämozytometer und resuspendieren an der entsprechenden Einsaatdichte zu diesem Zeitpunkt. Zur Vereinfachung der Berechnungen, resuspendieren zu 1-3.000.000 Zellen / ml. (Für weitere Einzelheiten siehe auch Abschnitt 2.1).
  5. Sobald Zellen gezählt wurden und 15 Minuten vergangen sind, fahren Sie mit Kollagen zu gießen.

6. Pouring Aligned und Random Collagen Mikrokanäle

  1. Kollagen durch die Kanäle, eingestellt und programmiert werden Vakuumdruck mit einem Inline-Vakuumregler vor dem Zeichnen. Vakuumdruck liefert die Kraft zu induzieren und zu steuern, um die Rate der Kollagenstrom, der den Grad der Ausrichtung bestimmt.
    1. Für zufällige oder unaligned Matrizen, einen breiten Kanal (3 mm breit x 200 & mgr; m hoch) mit einem Vakuumdruck von 10 mm Hg oder weniger verwenden.
    2. Für ausgerichteten Matrizen verwenden schmalen Kanal (1 mm breit x 200 & mgr; m hoch) mit einem Vakuumdruck von 60 mm Hg oder höher.
  2. Entfernen Sie montierten Kanal aus Eis und auf sauberen, keimfreien Oberfläche von Laminar-Flow-hOOD.
  3. Arbeiten Sie schnell und laden 120-150 ul neutralisierten Kollagen in Port A (Abbildung 2b).
  4. Zeichne Kollagen durch den Kanal durch einen 25 ml - Pipette mit der Vakuumleitung über den Anschluss c (Abbildung 2b) befestigt platzieren. Zeichnen Sie Kollagen durch in einem einzigen, gleichförmige Bewegung. WICHTIG: Für zufällige oder nicht ausgerichteten Matrizen, Kollagen langsam über den Kanal ziehen (etwa 0,5 bis 1 mm pro Sekunde), und stoppen, sobald das Ende erreicht. Für ausgerichteten Matrizen, zeichnen das Kollagen in schneller, aber darauf achten, Luftblasen zu vermeiden.
  5. überschüssiges Kollagen aus der Hafenregion mit p200 Pipetman oder Absauger vorsichtig entfernen.
  6. Legen Sie sterile PDMS-Patches über beide Anschlüsse A und C. Alle Ports nun abgedeckt werden sollten.
  7. Nach 2 - 3 ul Zellen (5 - - 10 Tausend Zellen) in das Zentrum Port 3 Minuten, Zentrum PDMS-Patch (Port B) und mit 2 entfernen. Lassen Sie teilweise zu polymerisieren (opak drehen) bei Raumtemperatur für eine weitere 10 bis 15 min.
  8. nach 10- 15 min, Transfer bis 37 ° C für weitere 15 - 30 min Polymerisation zu beenden. Entfernen PDMS Abdeckungen und Medien fügen den Kanal komplett und Kulturzellen abzudecken, wie sie benötigt werden. Zellen können durch Entfernen einer ml alten Medien zugeführt werden, und mit einem ml der neuen Medien zu ersetzen.

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Ergebnisse

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Während 3D-Assays können innerhalb der gleichen Steifigkeit von Kollagengel, Variieren der Gelsteifheit erfolgen kann verwendet werden, um zu bestimmen, wie die Zellen auf mechanische Veränderungen in ihrer zellulären Mikroumgebung reagiert. Eine steife Kollagen Hydrogel wird als Gel definiert, wo die eingebetteten Zellen nicht in der Lage sind, um die umgebende Kollagen lokal zusammenzuziehen. Die intrinsische Kontraktilität von verschiedenen Zelltypen ist einzigartig, und so ist es am ...

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Diskussion

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3D-Kollagen-Gele sind eine wertvolle Ergänzung zu unserer Toolbox zu verstehen, wie Zellen auf ihre lokalen Mikroumgebung interpretieren und darauf zu reagieren. Dieses Manuskript hat ein sehr einfaches Protokoll vorgesehen Zellen in einer 3D-Kollagen-Matrix einbetten und reproduzierbar Matrizen erzeugen mit zufälligen oder Kollagenfasern ausgerichtet sind. Beide Protokolle arbeiten, wie anpassungsfähig Plattformen, auf denen verschiedene Kollagen-Isoformen, Vernetzern oder anderen Matrixproteinen möglicherweise zum Zei...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren möchten Zuschuss Zahlen UO1CA143069 anzuerkennen, R01CA142833, R01CA114462, RO1CA179556, T32-AG000213-24 und T32-GM008692-18 diese Arbeit für die Finanzierung. Wir erkennen auch Jeremy Bredfelt und Yuming Liu von Loci für die Entwicklung und Unterstützung bei der CT-FIRE-Analyse.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Hochkonzentriertes Rattenschwanz-KollagenCorning354249
SylGard184 Elastomer-KitCorningElastomer für PDMS-Kanäle
HEPESFisherBP310für HEPES-Neutralisationspuffer
KCl FisherBP366Für HEPES-Neutralisationspuffer
KH2PO4FisherBP362Für HEPES-Neutralisationspuffer
Na2HPO4Fisher S374Für HEPES-Neutralisationspuffer
NaClFisher BP358Für HEPES-Neutralisationspuffer
Levy Verbessertes Neubauer HämazytometerFisher15170-208Zellzählung
6-Well-Nicht-Gewebe-Kulturplatte Corning351146
50 mm GlasbodenschaleMatTekP50g-1.5-30-f
Bel-Art Kunststoff-Vakuum-ExsikkatorBel-ArtF4200-2021Entgasungskammer für PDMS-Transparentfolie
 3Mpp2950Kunststofffolie zum Gießen von PDMS-Kanälen
ThermoScientific CimaRecThermoScientific HP141925Heizplatte zum Aushärten von PDMS-Mikrokanälen
VakuumreglerPrecision MedicalPM3100Vakuumregler für Kollagen-Mikrokanäle
8" x 8" GummiplatteAmazon - Rubber-CalSilikon - 60AGummiplatte zum Gießen von PDMS-Mikrokanälen
8" x 8" x 0,125" AcrylplatteAmazonPlexiglasplattenzum Gießen von PDMS-Mikrokanälen
10 lbGewichte AmazonCAP Barbellzum Gießen von PDMS-Mikrokanälen
15 ml Konische RöhrchenFisher352097
50 ml Konische RöhrchenFisher352098
KunststoffpipettenDot Scientific229202B, 229206B und 667225B2  ml, 5  ml und 25  ml
70% EtOHFisher NC9663244
NC9285739

Referenzen

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  1. Conklin, M. W., et al. Aligned collagen is a prognostic signature for survival in human breast carcinoma. Am J Pathol. 178, 1221-1232 (2011).
  2. Provenzano, P. P., et al. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4, 38(2006).
  3. Riching, K. M., et al. 3D collagen alignment limits protrusions to enhance breast cancer cell persistence. Biophys J. 107, 2546-2558 (2014).
  4. Even-Ram, S., Yamada, K. M. Cell migration in 3D matrix. Curr Opin Cell Biol. 17, 524-532 (2005).
  5. Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. J Cell Biol. 188, 11-19 (2010).
  6. Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration. J Cell Biol. 197, 439-455 (2012).
  7. Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. Cell interactions with three-dimensional matrices. Curr Opin Cell Biol. 14, 633-639 (2002).
  8. Wozniak, M. A., Desai, R., Solski, P. A., Der, C. J., Keely, P. J. ROCK-generated contractility regulates breast epithelial cell differentiation in response to the physical properties of a three-dimensional collagen matrix. J Cell Biol. 163, 583-595 (2003).
  9. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).
  10. Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Keely, P. J. Matrix density-induced mechanoregulation of breast cell phenotype, signaling and gene expression through a FAK-ERK linkage. Oncogene. 28, 4326-4343 (2009).
  11. Tlsty, T. D., Coussens, L. M. Tumor stroma and regulation of cancer development. Annu Rev Pathol. 1, 119-150 (2006).
  12. Provenzano, P. P., et al. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC Med. 6, 11(2008).
  13. Provenzano, P. P., Inman, D. R., Eliceiri, K. W., Trier, S. M., Keely, P. J. Contact guidance mediated three-dimensional cell migration is regulated by Rho/ROCK-dependent matrix reorganization. Biophys J. 95, 5374-5384 (2008).
  14. Guo, C., Kaufman, L. J. Flow and magnetic field induced collagen alignment. Biomaterials. 28, 1105-1114 (2007).
  15. Sung, K. E., et al. Control of 3-dimensional collagen matrix polymerization for reproducible human mammary fibroblast cell culture in microfluidic devices. Biomaterials. 30, 4833-4841 (2009).
  16. Lee, P., Lin, R., Moon, J., Lee, L. P. Microfluidic alignment of collagen fibers for in vitro cell culture. Biomed Microdevices. 8, 35-41 (2006).
  17. Wozniak, M. A., Keely, P. J. Use of three-dimensional collagen gels to study mechanotransduction in T47D breast epithelial cells. Biol Proced Online. 7, 144-161 (2005).
  18. Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. Immunoblotting and immunodetection. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. , Chapter 10, Unit 10 18(2008).
  19. Liu, X., Harada, S. DNA isolation from mammalian samples. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. , Chapter 2, Unit 2 14(2013).
  20. Roeder, B. A., Kokini, K., Sturgis, J. E., Robinson, J. P., Voytik-Harbin, S. L. Tensile mechanical properties of three-dimensional type I collagen extracellular matrices with varied microstructure. J Biomech Eng. 124, 214-222 (2002).
  21. Bredfeldt, J. S., et al. Computational segmentation of collagen fibers from second-harmonic generation images of breast cancer. J Biomed Opt. 19, 16007(2014).
  22. Bischel, L. L., Beebe, D. J., Sung, K. E. Microfluidic model of ductal carcinoma in situ with 3D, organotypic structure. BMC Cancer. 15, 12(2015).

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