Mehrfarbenfluoreszenzdetektion für Droplet Mikrofluidik Verwendung von Optical Fibers

Summary

Mehrfarbige Fluoreszenzdetektion in der Tröpfchenmikrofluidik beinhaltet typischerweise sperrige und komplexe Epifluoreszenzmikroskop-basierte Detektionssysteme. Hier beschreiben wir ein kompaktes und modulares mehrfarbiges Detektionsschema, das ein Array von optischen Fasern verwendet, um mehrfarbige Daten, die von einem einzigen Photodetektor gesammelt wurden, zeitlich zu kodieren.

Abstract

Fluoreszenz-Assays sind aufgrund ihrer hellen Signale und ihrer schnellen Zeitreaktion die gebräuchlichsten Messwerte, die in der Tröpfchen-Mikrofluidik verwendet werden. Anwendungen wie Multiplex-Assays, Enzymevolution und Molekularbiologie Verbesserte Zellsortierung erfordern den Nachweis von zwei oder mehr Fluoreszenzfarben. Standardmäßige Mehrfarben-Detektionssysteme, die Freiraumlaser an Epifluoreszenzmikroskope koppeln, sind sperrig, teuer und schwer zu warten. In diesem Artikel beschreiben wir ein Schema zur Durchführung einer Mehrfarbendetektion durch Anregung diskreter Bereiche eines mikrofluidischen Kanals mit Lasern, die an optische Fasern gekoppelt sind. Das emittierte Licht wird von einer optischen Faser gesammelt, die mit einem einzelnen Photodetektor gekoppelt ist. Da die Anregung an unterschiedlichen räumlichen Orten stattfindet, kann die Identität des emittierten Lichts als zeitliche Verschiebung kodiert werden, wodurch kompliziertere Lichtfilterschemata überflüssig werden. Das System wurde zum Nachweis von Tröpfchenpopulationen mit vier einzigartigen Farbstoffkombinationen und zum Nachweis von sub-nanomolaren Fluorescein-Konzentrationen eingesetzt.

Introduction

Tröpfchen Mikrofluidik eine Plattform für einen hohen Durchsatz biology von ¹ in einem Trägeröl suspendiert Experimente in einer Vielzahl von wässrigen Tröpfchen Kompartimentierung. Droplets sind für Anwendungen als Einzelzellanalyse ^2, digitale Polymerase - Kettenreaktion (PCR) ^3, wie variiert verwendet worden und Enzym Evolution ^4. Fluoreszierende Assays sind die Standard-Erfassungsmodus für Tröpfchen Mikrofluidik, als ihre helle Signale und schnelle Zeitverhalten kompatibel sind mit Sub-Nanoliter Tropfenvolumen bei Kilohertz Raten zu erfassen. Viele Anwendungen erfordern Fluoreszenzdetektion, um gleichzeitig mindestens zwei Farben. Zum Beispiel unserem Labor führt häufig Tröpfchensortierexperimente-PCR aktiviert , die ein Detektionskanal für das Ergebnis eines Assays zu verwenden, und verwendet eine Sekundärhintergrundfarbstoff Assay negative Tröpfchen zählbaren ⁵ zu machen.

Typische Nachweisstationen für Tröpfchen Mikrofluidik sind based auf Epifluoreszenz- Mikroskope und erfordern Licht Manipulationen Systeme kompliziert Anregungslicht von freien Raum Laser in Mikroskop eingeführt werden, die Probe fokussiert werden. Nach Fluoreszenz von einem Tröpfchen abgegeben wird, wird das emittierte fluoreszierte Licht gefiltert, so daß jeder Detektionskanal eine Photovervielfacherröhre (PMT) auf einem Wellenlängenband zentriert verwendet. Epifluoreszenzmikroskop basierte optische Detektionssysteme bieten eine Zutrittsschranke aufgrund ihrer Kosten, die Komplexität und die erforderliche Wartung. Optische Fasern liefern die Mittel eine vereinfachte und robuste Detektionsschema zu konstruieren, da Fasern manuell in mikrofluidischen Vorrichtungen eingesetzt werden, wodurch die Notwendigkeit für spiegelbasierte Lichtführung zu entfernen und so dass Lichtwege unter Verwendung von Lichtwellenleiterverbindern angeschlossen zu werden.

In diesem Dokument beschreiben wir die Montage und Validierung eines kompakten und modularen Schema Mehrfarbenfluoreszenzdetektion durchzuführen, indem eine Anordnung von optischen Fasern eine Verwendungda einzelne Photodetektor ^6. Lichtleitfasern sind mit individuellen Lasern und eingesetzt sind senkrecht zu einer L-förmigen Strömungskanal in regelmäßigen räumlichen Offsets. Ein Fluoreszenzsammelfaser wird an die Anregungsbereiche parallel orientiert und an einem einzigen PMT verbunden. Weil ein Tröpfchen zu unterschiedlichen Zeiten den Laserstrahlen durchläuft, durch den PMT aufgezeichneten Daten zeigt einen zeitlichen Versatz, dass der Benutzer zwischen der emittierten Fluoreszenz zu unterscheiden erlaubt, nachdem die Tröpfchen durch jede einzelne Laserstrahl angeregt wird. Diese zeitliche Verschiebung eliminiert die Notwendigkeit emittierte Licht zu trennen PMTs zu trennen, um eine Reihe von dichroitische Spiegel und Bandpassfilter verwendet wird. Um die Wirksamkeit des Detektors zu validieren, zu quantifizieren wir Fluoreszenz in Tröpfchenpopulationen Farbstoffe unterschiedlicher Farbe und Konzentration einkapselt. Die Empfindlichkeit des Systems wird für einfarbige Fluorescein Detektion untersucht und zeigt die Fähigkeit Tröpfchen mit Konzentrationen zu detektieren bis zu 0,1 nm, eine 200x Empfindlichkeit improvement im Vergleich zu bisherigen Vorgehensweisen auf Faserbasis ⁷ in der Literatur berichtet.

Protocol

1. SU8 Meister Fabrication

1. Entwerfen Sie die mikrofluidischen Strukturen für drei Schichtherstellungs Design-Software verwenden und die Entwürfe von einem Lieferanten auf der Leiterplatte Folie gedruckt mit 10 & mgr; m Auflösung. Die Details der Gerätedesign sind in einem angeschlossenen Referenz ⁶ und die Kanalgeometrien sind in Abbildung 1 gezeigt , gegeben. Die Schichten sollten Ausrichtungsmarken sind auf Merkmale ⁸ von jeder Herstellungsschicht helfen collocate.
2. Legen Sie eine vorgereinigte 3 Zoll Durchmesser Silizium-Wafer auf einem Spin-Coater und schalten Sie das Vakuum an die Spannfutter zu befestigen. Anwenden 1 ml SU8-3050 in der Mitte des Wafers und Spin für 20 sec bei 500 UpM, dann 30 Sekunden bei 1.750 Umdrehungen pro Minute, mit einer Schichtdicke von 80 & mgr; m bereitstellt.
3. Entfernen Sie den Wafer und backen auf eine 135 ° C Heizplatte für 30 min. Lassen Sie den Wafer auf RT abkühlen, bevor Sie mit dem nächsten Schritt weitergehen.
4. Setzen Sie die beschichtete Wafer auf der ^1. Schicht Maske unter einem kollimierten 190 mW, 365 nm für 3 min LED. Nach der Belichtung Stellen Sie den Wafer auf eine 135 ° C Heizplatte für 1 min, dann auf RT abkühlen, bevor mit dem nächsten Schritt fortfahren.
5. Platzieren Sie den Wafer auf dem Spin-Coater und schalten Sie das Vakuum an die Spannfutter zu befestigen. Anwenden 1 ml SU8-3050 in der Mitte des Wafers und Spin für 20 sec bei 500 UpM, dann 30 sec bei 5000 rpm, was zu einer Schicht, die eine zusätzliche Dicke von 40 um liefert.
6. Entfernen Sie den Wafer und backen auf eine 135 ° C Heizplatte für 30 min, dann auf RT abkühlen, bevor zum nächsten Schritt übergehen.
7. Richten Sie die ^2. Schicht Maske auf die Geometrie in 1.3 strukturiert und setzen den beschichteten Wafer zu einem kollimierten 190 mW, 365 nm für 3 min LED. Nach der Belichtung setzen auf einer Heizplatte 135 ° C für 4 min 30 sec, dann auf RT abkühlen, bevor mit dem nächsten Schritt fortfahren.
8. Platzieren Sie den Wafer auf dem Spin-Coater und schalten Sie das Vakuum an die Spannfutter zu befestigen. Anwenden 1 ml SU8-3050 in der Mitte des Wafers und Spin für 20 sec bei 500 UpM, dann 30sec bei 1000 rpm, was zu einer Schicht, die eine zusätzliche Dicke von 100 um bereitstellt.
9. Entfernen Sie den Wafer und backen auf eine 135 ° C Heizplatte für 30 min, dann auf RT abkühlen, bevor zum nächsten Schritt übergehen.
10. Richten Sie die ^3. Schicht Maske auf die Geometrie in 1.3 strukturiert und setzen den beschichteten Wafer zu einem kollimierten 190 mW, 365 nm für 3 min LED. Nach der Belichtung setzen auf einer Heizplatte 135 ° C für 9 min, dann auf RT abkühlen, bevor mit dem nächsten Schritt fortfahren.
11. Entwickeln der Masken durch in ein gerührtes Bad aus Propylenglykolmonomethylether-acetat während 30 min eingetaucht wird. Waschen Sie die Wafer in Isopropanol und backen auf eine 135 ° C Heizplatte für 1 min. Platzieren Sie den entwickelten Master in einer 100 mm Petrischale für Polydimethylsiloxan (PDMS) Formen.

2. PDMS Gerätefertigung

1. Bereiten Sie 10: 1 PDMS von 50 g Silikonbasis kombiniert mit 5 g Mittel in einem Plastikbecher zu heilen. Mischen Sie den Inhalt mit einem Drehwerkzeug mit einem Rührstab ausgestattet. Degals Gemisch in einem Exsikkator für 30 Minuten, oder bis alle Luftblasen entfernt werden.
2. Gießen Sie die PDMS mit einer Dicke von 3 mm über dem Master zu geben und zurück in den Exsikkator zur weiteren Entgasung. Sobald alle Blasen entfernt werden, backen das Gerät bei 80 ° C für 80 min.
3. Schneiden Sie das Gerät aus der Form mit einem Skalpell und auf eine saubere Oberfläche mit der strukturierten Seite nach oben und Punsch die fluidische und -auslässe mit einer 0,75 mm Biopsie Stempel verwenden. Das Gerät ist so geschnitten werden, dass die 120 & mgr; m und 220 & mgr; m groß Geometrien von der Seite der Vorrichtung zugänglich sind.
4. Plasma behandeln Sie das Gerät, mit Feature - Seite nach oben, zusammen mit einer vorgereinigte 2 Zoll von 3 Zoll Glasträger bei 1 mbar O ₂ Plasma für 20 Sekunden in einem 300 W Plasma - Reiniger. Bond, die PDMS-Gerät von der strukturierten Seite der PDMS Vorrichtung auf die plasmabehandelte Seite der Glasobjektträger platziert. Stellen Sie das Gerät in einem 80 ° C Ofen und backen Sie die zusammengebauten Vorrichtung für 40 min.
5. Machen Sie die Kanälehydrophob durch eine Spritze unter Verwendung der Vorrichtung mit einer fluorierten Oberflächenbehandlungsfluid zu spülen. Unmittelbar backen das Gerät bei 80 ° C für 10 min, das Lösungsmittel zu verdampfen.

3. Herstellung von optischen Komponenten

1. Bereiten Sie die Laseranregung Faser, die durch die Isolierung von der letzten 5 mm von einer 105 & mgr; m-Kern, 125 um Mantel zu entfernen, NA = 0,22 optischen Faser.
2. Bereiten Sie die ^2. Farbe Laseranregung Faser um 3,1 für eine ^2. identische Faser zu wiederholen.
3. Bereiten Sie die Faser zum Sammeln des Fluoreszenzsignals von 3,1 für einen 200 & mgr; m-Kern, 225 & mgr; m Mantel wiederholen, NA = 0,39 optische Faser.
4. Überprüfen Sie die Spitzen aller Fasern - wenn die Spitzen in einer flachen Oberfläche nicht zu Ende, wieder spalten die Enden mit einem Faserschreiber.
5. Bringen Sie einen Laser-Faserkoppler mit einem 50 mW, 405 nm Laser und befestigen Sie eine der 105 & mgr; m Kernfasern an den Laser. Richten Sie das abisolierte Ende am Sensor der LaserleistungMeter, und die Feinjustierung des Lasers Koppler verwenden, um die Laserleistung zu maximieren.
6. Wiederholen 3.5 für eine 50 mW, 473 nm-Laser.
7. Montieren Sie einen 446/510/581/703 nm Quad-Bandpassfilter auf der PMT Linse Röhren mit Laserlicht zu blockieren und emittiert Fluoreszenz übertragen. Bringen Sie Faserkoppler, so dass Licht den Filter durchläuft, bevor die PMT zu schlagen.
8. Bringen Sie die Faser von 3,3 auf der montierten Einheit in 3.7.

4. Offline-Mischemulsion-Generation

1. Besorgen Sie sich einen Strömungs Fokus Mikrofluidik dropmaker Gerät mit einem 60 & mgr; m × 60 & mgr; m Öffnung.
2. Füllen Sie eine 1 - ml - Spritze mit HFE 7500 Ölen mit 2% ionisches Fluortensid ^9.
3. Füllen einer Reihe von 1 ml Spritzen mit den folgenden Kombinationen von Fluorescein (FITC) und Dextran-konjugiertes blaue Farbstoffe (CB) in PBS: 1 nM FITC / 10 nM CB, 10 nM FITC / 10 nM CB, 1 nM FITC / 100 nM CB und 10 nM FITC / 100 nM CB.
4. Montieren Sie die dropmaker Gerät auf der Bühne eines invertierten Microsbewältigen und die wässrigen und Öl Spritzen auf Spritzenpumpen. Paar die Spritzen an die Geräte PE-2 Schläuche verwenden.
5. Laufspritzenpumpen bei 500 & mgr; l / h für die Öl- und 250 & mgr; l / h für die wässrigen Lösungen, erstellen einer Mischung aus 80 & mgr; m-Tröpfchen, die Lösungen von 4,3 enthält. Für jede Art von wässrigen Probe, mit einem frischen dropmaker Gerät eine Kreuzkontamination zu vermeiden. Sammeln Sie ~ 200 & mgr; l Emulsion aus jeder Farbstoffkombination in eine leere Spritze.
6. Nachdem die vier Tröpfchen Typen haben in einer einzigen Sammlung Spritze, mischen die Emulsion durch mehrmaliges Drehen der Spritze gesammelt.
7. Wiederholen Sie die Schritte 4,2-4,6 mit wässrigen Lösungen, die 0,1, 1, 10 und 100 nM FITC in PBS.

5. Optical Fiber Insertion

1. Platzieren Sie den mikrofluidischen Chip hergestellt in Schritt 2 auf der Stufe eines inversen Mikroskops gekoppelt mit einer digitalen Kamera in der Lage von <100 & mgr; s Verschlusszeiten.
2. Arbeiten sorgfältig von der Seite, insert die Faser mit dem 473-nm-Laser in die am weitesten vorgelagerten 120 & mgr; m Kanal gekoppelt, dabei nicht bis zur Hauptströmungskanal zu durchstechen.
3. Legen Sie die Faser mit dem 405-nm-Laser in die am weitesten stromabwärts 120 & mgr; m hohen Seitenkanal und bietet Faserabstand von 300 & mgr; m.
4. Legen Sie die PMT-gekoppelten Faser in den 220 & mgr; m groß Kanal senkrecht zu den beiden Laseranregungsfasern.

6. Fluoreszenzdetektion von gemischten Emulsionen

1. Halterung eine 5 ml Spritze mit HFE 7500 mit 2% ionisches Fluortensid mit dem Spacer Öleinlaß der Detektionseinrichtung mit PE-2 Schlauch gefüllt.
2. Montieren Sie die Spritze mit dem gemischten FITC / CB-Emulsion auf einem vertikal ausgerichteten Spritzenpumpe und koppeln an das Gerät des Tröpfchens reinjection Einlass mit PE-2 Schläuche enthalten. Schließen Sie eine Länge von PE-2 Schlauch aus dem Gerät Ausgang in einen Abfallbehälter.
3. Prime das Gerät von jeder der Pumpen bei 1000 & mgr; l / h, bis beide LaufÖl und Tröpfchen werden zu sehen regelmäßig in dem Gerät und fließt stromabwärts kombiniert werden.
4. Stellen Sie die Durchflussraten, so dass das Abstands Öl läuft bei 6.000 & mgr; l / h und die Tröpfchen bei 100 & mgr; l / h und bietet erhebliche Abstand zwischen den Tröpfchen durch den Detektionsbereich reisen.
5. Schalten Sie den Laser, das Datenerfassungsprogramm zu starten, und stellen Sie die PMT-Verstärkung um Signale zu liefern, die mehr sind als das Grundrauschen Boden 100x. Stellen Sie die Laserleistung so, dass alle der Dublett Peaks auf einem einzelnen, linear skaliert Timetrace deutlich sichtbar sind.
6. Erwerben Sie 60 Sekunden der PMT-Spannung Timetrace bei mindestens 20 kHz. Importieren Sie die Daten in Rechenprogramm wie Matlab und messen die Höhen der Spitzen der aufgenommenen Dubletten das benutzerdefinierte Berechnungsprogramm Skript.
   Hinweis: Dies wird als zusätzliche Information zur Verfügung gestellt.
7. Wiederholen Sie die Schritte 6,2-6,7 die FITC-nur gemischte Emulsion in 4.7 erstellt wurden, mit der 405-nm-Laser ausgeschaltet.

Results

Herstellung eines PDMS - Gerät , das für das Einsetzen von optischen Fasern ermöglicht , erfordert ein mehrstufiges photolithographischen Verfahren zu schaffen Kanäle unterschiedlicher Höhe (Abbildung 1). Zuerst wird eine 80 um hohe Schicht aus SU-8 wird auf einen Siliziumwafer versponnen und strukturiert, um eine Maske mit dem Fluidhandhabungs Geometrie zu schaffen. Als nächstes wird eine weitere 40 & mgr; m Schicht aus SU-8 auf den Wafer gesponnen und strukturiert,...

Discussion

LWL-Erkennung erfordert die Ausrichtung der optischen Fasern in Bezug auf Fluidkanäle. Da unser Gerät Führungskanäle hergestellt mit mehrschichtigen Photolithographie verwendet, die Platzierung von Masken in Bezug zueinander ist von großer Bedeutung. Wenn die Faserleitkanäle zu nahe an der Fluidkanal sind, gibt es ein Potential für eine Fluidleckage; wenn die Führungskanäle zu weit entfernt oder falsch ausgerichtet angeordnet sind, kann das Fluoreszenzsignal von der Detektionsfaser gesammelt werden deutlich vermindert. ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fotomasken	CadArt Servcies
3" Siliziumwafer, P-Typ, reine Testqualität	University Wafers	447
SU-8 3035	Microchem	Y311074
SU-8 2050	Microchem	Y111072
Sylgard 184 Silikonelastomer Kit	Krayden	4019862
1 ml Spritzen	BD
10 ml Spritzen	BD	309604
27 Gaugue Nadeln	BD	305109
PE 2 Polyethylen-Schlauch	Scientific Commodities, Inc.	B31695-PE/2
Novec 7500	Fisher Scientific	98-0212-2928-5	Allgemein bekannt als HFE 7500
Ionic Krytox Anleitung zur Synthese von Tensiden			in Ref #10
Dextran-konjugierter Kaskadenblau-Farbstoff	Life Technologies	D-1976
Fluorescein-Natriumsalz	Sigma	28803
Quad-Bandpassfilter	Semrock	FF01-446/510/581/703-25
PMT	Thorlabs	PMM02
Glasfaseranschluss	Thorlabs	PAFA-X-4-A
Objektivrohr	Thorlabs	SM1L05
Patchkabel mit 200 μ M Kern / 225 μ m Ummantelung von Glasfaser mit einem abisolierten Ende und einem FC/PC-Stecker	Thorlabs	Custom
Patchkabel mit 105 μ M-Kern / 125 μ m Ummantelung von Glasfasern mit einem abisolierten Ende und einem FC/PC-Stecker	Thorlabs	Custom
125 μ m Abisolierwerkzeug	Thorlabs	T08S13
225 μ m Faserabisolierwerkzeug	Thorlabs	T10S13
Laser Faseradapter	OptoEngine	FC/PC Adapter
405 nm CW Laser bei 50  mW	OptoEngine	MDL-III-405	Verteiler für CNI Laser
473 nm CW Laser bei 50  mW	OptoEngine	MLL-FN-473-50