In vitro - Kolonie - Assays Selbsterneuerung und Differenzierung von Vorläuferzellen , isoliert aus adulten murinen Bauchspeicheldrüse sind entwickelt zu detektieren. In diesen Assays geben Bauchspeicheldrüsen Progenitoren Anlass zu Zellkolonien in 3-dimensionalen Raum in Methylcellulose-enthaltende halbfeste Medium. Protokolle für die sind einzelne Zellen und Charakterisierung von einzelnen Kolonien Handhabung beschrieben.
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Methodenartikel
In - vitro - Assays für Colony Tri-potente Progenitorzellen Charakterisieren von den Adult Murine Pancreas Isoliert
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Stamm- und Vorläuferzellen aus der Bauchspeicheldrüse erwachsener könnte eine potentielle Quelle von therapeutischen beta-ähnlichen Zellen werden zur Behandlung von Patienten mit Typ 1 Diabetes. Es ist jedoch noch nicht bekannt, ob Stamm- und Vorläuferzellen im erwachsenen Bauchspeicheldrüse existieren. Forschungsstrategien mit cre-lox abstammungs Tracing in erwachsenen Mäusen haben Ergebnisse erzielt, dass entweder unterstützen oder die Idee zu widerlegen, dass Beta-Zellen aus den Kanälen erzeugt werden kann, der vermuteten Stelle, an der erwachsenen Pankreas-Vorläufern vorhanden sein können. Diese in - vivo - cre-lox abstammungs Tracing - Verfahren kann jedoch nicht beantworten die Fragen der Selbsterneuerung und Multilinien - Differenzierung zwei Kriterien notwendig , um eine Stammzelle zu definieren. Zunächst diese technische Lücke Adressierung erarbeiteten wir 3-dimensionale Kolonie-Assays für Pankreas-Vorläufern. Bald nach unserer ersten Veröffentlichung, andere Labors entwickelt unabhängig eine ähnliche, aber nicht identische Verfahren die organoiden Test genannt. Im Vergleich zum organoiden Assay unser Verfahren verwendetMethylcellulose, die viskose Lösungen bildet, der die Aufnahme von extrazellulären Matrixproteinen in niedrigen Konzentrationen ermöglichen. Die Methylcellulose enthaltenden Assays erlauben einfachere Erkennung und Analyse von Vorläuferzellen auf der Ebene einzelner Zellen, die entscheidend sind, wenn Vorläufern eine kleine Subpopulation bilden, wie es der Fall für viele erwachsene Orgel Stammzellen ist. Zusammen zeigen Ergebnisse von mehreren Laboratorien in vitro Selbsterneuerung und multi-lineage Differenzierung von Pankreas - Vorläuferähnlichen Zellen von Mäusen. Die aktuellen Protokolle beschreiben zwei Methylcellulose-basierte Kolonie-Assays Maus Pankreas-Vorläufern zu charakterisieren; einer enthält eine kommerzielle Herstellung von murine extrazellulären Matrixproteinen und die andere eine künstliche extrazelluläre Matrixprotein als Laminin Hydrogel bekannt. Die Techniken , die hier gezeigt werden , sind 1) die Dissoziation des Pankreas und Sortieren von CD133 + Sox9 / EGFP + duktalen Zellen von erwachsenen Mäusen, 2) Einzelzell Manipulation der sorted Zellen, 3) analysiert einzelne Kolonie mikrofluidischen qRT-PCR und ganze-mount Immunfärbung verwendet und 4) Dissoziation von primären Kolonien in Einzelzellsuspensionen und Wiederbeschichtung in sekundäre Kolonie-Assays Selbsterneuerung oder Differenzierung zu beurteilen.
Einleitung
Das Pankreas besteht aus drei Hauptzelllinien; acinar Zellen sezernieren Verdauungsenzyme, Kanäle Krankheitserreger abzuwehren und zu transportieren Verdauungsenzyme im Darm und endokrinen Zellen sezernieren Hormone, einschließlich Insulin und Glucagon, das Glukose-Homöostase aufrechtzuerhalten absondern Mucin. Während der embryonalen Entwicklung der Bauchspeicheldrüse, sind die frühen duktalen Zellen die Quelle der tri-potent Vorläuferzellen fähig ist , die zu den drei Linien in den Bauchspeicheldrüsen von erwachsenen Tieren 1,2. Da adulten Stammzellen und Vorläuferzellen, wie Knochenmark - Stammzellen werden bereits erfolgreich verwendet , um verschieden....
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Protokoll
Ethische Erklärung: Wir halten uns an den allgemein anerkannten ethischen Standards in Durchführung von Forschung, die Qualität und die Integrität der Ergebnisse zu gewährleisten. Tierversuche wird nach Protokollen, die von der Institutional Animal Care und Use Committee bei City of Hope genehmigt durchgeführt.
1. Bereiten Sie Einzelzellsuspension von Adult Murine Bauchspeicheldrüsen
HINWEIS: In Vorveröffentlichungen 7,11, CD-1 oder B6 Hintergrund Mäuse wurden verwendet; beide Hintergründe ergaben ähnliche Ergebnisse. Eine transgene Mauslinie (bezeichnet Sox9 / EGFP) mit verbesserter grün fluoreszierendes Protein durch Sox9 angetrieben loci <....
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Ergebnisse
Adult Pankreas - Vorläuferzellen durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (Abbildung 1) angereichert werden. Die Sox9 / EGFP transgenen Mauslinie hier verwendet wurde zum ersten Mal als Ergebnis des Projekts GENSAT Gehirn - Atlas 19 erzeugt, und die EGFP Reporter unter der Kontrolle eines bakteriellen künstlichen Chromosom enthält ~ 75 kb stromaufwärts und ~ 150 kb Downstream - Sequenzen von Sox9 20 . In diesen Mäusen markiert EGFP Pankreasgänge e.......
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Diskussion
Die Pankreas - Kolonie - Assays und einzelne Kolonie Analysen der Methylhaltigen hämatopoetischen Kolonie - Assays beschrieben hier wurden inspiriert , die bei der Entschlüsselung der Biologie der hämatopoetischen Vorläuferzellen in den vergangenen Jahrzehnten 23 Hauptrollen gespielt haben. In diesen Assays (Abbildung 5), dissoziiert sind Pankreaszellen ausplattiert in Methylcellulose-enthaltende halbfeste Medien mit geeigneten Wachstumsfaktoren und ECM - Proteinen, die die Bildung von Ring, .......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Wir danken Lucy Brown und Alexander Spalla aus der Analytical Cytometry Core beim City of Hope für die Unterstützung bei der Sortierung. Diese Arbeit wird teilweise durch National Institutes of Health (NIH) gewährt R01DK081587 und R01DK099734 zu HTK und U01DK089533 ADR, und von der National Science Foundation NSF Zuschuss-DMR-1206121 und California Institute for Regenerative Medicine Zuschuss RB5-07398 DAT Unterstützt unterstützt vom Joseph J. Jacobs-Institut für Molekulare Technik für Medizin an der Caltech zu DAT, und diejenigen, die aus Oxnard Foundation und Ella Fitzgerald Foundation HTK sind auch dankbar anerkannt.
Finanzieru....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Murine ECM-Proteine (Matrigel) | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 354230 | Bestand bei -20 ° C |
| Laminin-Hydrogel | zur Verfügung gestellt von David Tirrell (Pasadena, CA, USA) | Bestand bei -20 ° C | |
| Methylcellulose | Shinetsu Chemical (Tokio, Japan) | 1.500 Centipoise (dynamische Viskositätseinheit entspricht 15 g/cm/sec) (hohe Viskosität) | |
| Dulbecco's Phosphat-Buffered Saline | Mediatech (Manassas, VA, USA) | 21-031-CV | |
| Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15070-063 | |
| 50 ml Flakon Konisches Fläschchen | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 352070 | |
| 100 mm x 20 mm Suspensionskulturschale | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 430591 | |
| Rinderserumalbumin | Sigma (St. Louis, MO, USA) | A8412 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15070-063 | |
| DNase1 | Calbiochem (Darmstadt, Deutschland) | 260913 | |
| Kollagenase B | Roche (CH-4070, Basel, Schweiz, Schweiz) | 11088831001 | Bestand bei -20 ° C |
| Anti-Maus CD16/32 | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 101310 | niedriges Endotoxin, azidfreies |
| PE-Cy7 Ratte IgG2a & Kappa; | Isotyp-Kontroll-Biolegende (San Diego, CA, USA) | 400522 | |
| Ratten-IgG1 & Kappa; Isotypkontrolle | eBioscience (San Diego, CA, USA) | 13-4301-82 | |
| Anti-CD133-Biotin | eBioscience (San Diego, CA, USA) | 13-1331-82 | |
| Anti-CD71-PE-Cy7 | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 113812 | |
| Streptavidin-Allophycocyanin | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 405207 | |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindol | Invitrogen ( Waltham, Massachusetts; USA) | 3571 | Lagerbestand bei -20 ° C |
| Anti-Mucin 1 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | HM-1630-P1 | |
| Dylight 649 Ziege anti-armenischer Hamster | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 127-495-160 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nährstoffmischung F-12 | Mediatech (Manassas, VA, USA) | 10-092-CV | |
| Fetal Rinderserum | Tissure Culture Biologicals (Long Beach, CA, USA) | 101 | Bestand bei -20 ° gehalten; C |
| Tris Ethylendiamintetraessigsäure | TEKnova (Hollister, CA, USA) | T0221 | |
| Rneasy Micro Kit | Qiagen (Venlo, Niederlande) | 74004 | |
| QuantiTec Reverse Transkription Kit | Qiagen (Venlo, Niederlande) | 205310 | |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | Ambion/Invitrogen (Grand Island, NY, USA) | 11753-100 | |
| Paraformaldehyd | Santa Cruz Bio (Santa Cruz, CA, USA) | SC-281692 | |
| Ziegenserum | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 005-000-121 | Bestand gehalten bei -20 ° C |
| Eselsserum | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 0017-000-121 | Bestand bei -20 ° gehalten; C |
| Triton X-100 | Sigma (St. Louis, MO, USA) | T9284 | |
| Trypsin | Sigma (St. Louis, MO, USA) | T-4799 | |
| Ethylendiamintetraessigsäure | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | 15575-020 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies (Waltham, MA, USA) | 25200-056 | |
| Sterilwasser Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15230-147 | ||
| Pasteurpipette | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | 13-678-8B | |
| 40 μ m Filtergewebe | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 08-771-1 | |
| 70 μ m Filtergewebe | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 08-771-2 | |
| TC Plate 96 Well Suspension | Sarstedt | 83.3924 (zuvor 83.1835) | |
| 1 cc Spritze | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 309659 | |
| 10 cc Spritze | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 301604 | |
| 48.48 Dyanmic Array Chip | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | BMK-M-48.48 | |
| Fluidigm GE 48.48 Dynamisches Array Probe & Reagenzienkit für die Assay-Beladung | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | 85000800 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems (Grand Island, NY, USA) | 4304437 | |
| Polyethylenglykol-Sorbitan-Monolaurat | Sigma (St. Louis, MO, USA) | P7949 | |
| Glasbodenschale | MatTek (Ashland, MA, USA) | P35G-1.5-14-C | 35 mm Petrischale mit Glasboden |
| Mundstück/Gummischlauch | Renova Life Inc. (College Park, MD, USA) | MP-SET | |
| Nicotinamide | Sigma (St. Louis, MO, USA) | N0636 | Lagerbestand gehalten bei -20 ° C |
| Vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor | R& D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 293-VE | Bestand bei -80 ° C |
| Activin B | R& D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 659-AB | Bestand bei -80 ° C |
| Extendin 4 | Sigma (St. Louis, MO, USA) | E7144 | Lagerbestand bei -20 ° C |
| Rspondin-1 | R& D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 3474-RS | Bestand bei -80 ° C |
| Falcon 5 ml Polystyrol-Röhrchen mit rundem Boden | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 352054 | |
| PrecisionGlide Nadel 18 G x1 1/2 | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 305196 | |
| PrecisionGlide Nadel 16 G x 1 1/2 | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 305198 | |
| Costar Ultra-Low Attachment Surface 24 Well flache Bodenplatte | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 3473 | |
| Costar 96 Black Well Plate | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 3603 | Flacher, klarer Boden mit Deckel. Mikrotiterplatten aus schwarzem Polystyrol mit TC-Behandlung |
| Zeiss LSM510 META NLO Axiovert 200M Inverses Mikroskop | Carl Zeiss AG (Oberkochen, Deutschland) | ||
| Biomark HD | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | ||
| Aria Special Order Research Product Cell | Sorter Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | ||
| PBS/BSA | 1x PBS 0,1% (wt/vol) BSA PenStrep (49 Einheiten/ml Penicillin, 49 μ g/ml Streptomycin) | ||
| PBS/BSA/Dnase1 | 1x PBS 0,1% (wt/vol) BSA PenStrep (49 Einheiten/ml Penicillin, 49 μ g/ml Streptomycin) Dnase 1 (2.400 Einheiten/ml pro Bauchspeicheldrüse) |
Referenzen
- Gu, G., Brown, J. R., Melton, D. A. Direct lineage tracing reveals the ontogeny of pancreatic cell fates during mouse embryogenesis. Mech Dev. 120, 35-43 (2003).
- Kopp, J. L., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
