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Methodenartikel

Ein Enzym- und Serumfreie Neural Stem Cell Culture Modell für EMT Investigation Geeignet für Drug Discovery

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DOI:

10.3791/54018

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23. August 2016

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1Dept. of Biomedicine, Pharmacenter, University of Basel, 2Molecular Signalling and Gene Therapy, Narayana Nethralaya Foundation, Narayana Health City, 3Brain Ischemia and Regeneration, Department of Biomedicine, University Hospital Basel, 4Department of Neurosurgery, Klinikum Idar-Oberstein, 5Department of Neurosurgery and Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University, 6Department of Neurology, Laboratory of Molecular Neuro Oncology, University Hospital of Zurich

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Der Übergang von Epithel zu Mesenchym (EMT) ermöglicht es Krebserkrankungen, invasiv zu werden. Zur Untersuchung der EMT wird ein auf neuralen Stammzellen (NSC) basierendes In-vitro-Modell beschrieben, das frei von Serum und Enzymen ist. Dieses standardisierte System ermöglicht die quantitative und qualitative Bewertung der Zellmigration, der Gen- und Proteinexpression. Das Modell eignet sich für die Wirkstoffforschung.

Zusammenfassung

Epithelial zu mesenchymale Transition (EMT) beschreibt den Prozess der Epithel Transdifferenzierung zu Mesenchym. EMT ist ein fundamentaler Prozess während der embryonalen Entwicklung, die auch tritt häufig bei Glioblastom, der häufigsten bösartigen Hirntumor. EMT wurde auch in mehreren Karzinomen außerhalb des Gehirns einschließlich Brustkrebs, Lungenkrebs, Dickdarmkrebs, Magenkrebs beobachtet. EMT ist zentral zur Malignität verknüpft durch die Förderung von Migration, Invasion und Metastasenbildung. Die Mechanismen der EMT Induktions sind nicht vollständig verstanden. Hier beschreiben wir ein in vitro - System für standardisierte Isolation kortikaler neurale Stammzellen (NSC) und anschließender EMT-Induktion. Dieses System bietet die Flexibilität, entweder einzelne Zellen oder Explantation Kultur zu verwenden. In diesem System werden Ratten- oder Maus sind embryonalen Vorderhirns NSC kultiviert in einem definierten Medium ohne Serum und Enzyme. Die NSCs ausgedrückt Olig2 und Sox10, zwei Transkriptionsfaktoren in oligodendroc beobachtetyte Vorläuferzellen (OPC). Mit diesem System Wechselwirkungen zwischen FGF, BMP- und TGF- & bgr;-Signalgebung beteiligt ZEB1, Zeb2 und Twist2 wurden beobachtet , wo TGF & beta; Aktivierung signifikant die Zellmigration verbessert, was auf eine synergistische BMP- / TGFß-Interaktion. Die Ergebnisse weisen auf ein Netzwerk von FGF, BMP- und TGF- & bgr;-Signalgebung in EMT Einleitung und Aufrechterhaltung beteiligt. Dieses Modellsystem ist relevant EMT in vitro zu untersuchen. Es ist kostengünstig und weist eine hohe Reproduzierbarkeit auf. Es ermöglicht auch den Vergleich von verschiedenen Verbindungen bezüglich ihrer Migrationsantworten (quantitative Entfernungsmessung) und Hochdurchsatz-Screening von Verbindungen EMT (qualitative Messung) zu hemmen oder zu verstärken. Das Modell ist daher gut geeignet, Arzneimittel-Bibliotheken für Substanzen zu testen EMT zu beeinflussen.

Einleitung

Während mehrere Stadien der embryonalen Entwicklung, verlieren Epithelzellen ihre starke Haftung zueinander (zB tight junctions) und erwerben einen Migrations Phänotyp in einem Prozess namens epitheliale zu mesenchymale Transition (EMT) 1. EMT ist für die Bildung von zusätzlichen Zelltypen, wie beispielsweise die mesenchymalen Neuralleistenzellen erforderlich, eine Population , die 2 aus dem Neuroepithel segregiert. EMT ist nicht nur wesentlich während Embryonalstadien , sondern auch in späteren Phasen des Erwachsenenlebens erforderlich physiologischen Prozesse im adulten Organismus zu halten, wie der Wundheilung 3 und des zentralen Nervensystems (ZNS) Regeneration in Läsionen 4 demyelinisierenden.

Epithelialen Tumoren sind bekannt für Migration, Invasion und Metastasierung von EMT als Initiations Schritt zu reaktivieren, was letztlich zu Krebs Progression führt 1,3. EMT in der Tat ist zentral zu starke Migration 1,3 verknüpft. Die zellulären Schritte conditioning, initiiert, unterziehen und EMT Aufrechterhaltung nicht vollständig verstanden werden und müssen weitere Untersuchungen.

Hier ist ein in - vitro - EMT Modellsystem auf Basis von NSCs, mit definierten Wachstumsfaktoren und Medien (kein Serum und keine Enzymeinsatz) wird vorgestellt. Dieses Modellsystem ist von Bedeutung für die Wissenschaftler auf EMT arbeiten. Die Schnecke, Zeb und Twist Proteinfamilien wurden für EMT sowohl in der Entwicklung und Krankheit 1 als kritisch gezeigt. Die Schnecke, Zeb und Twist Familien sind auch in dem vorgestellten System beteiligt. Das System basiert auf einem bestimmten Bereich des Vorderhirns, die normalerweise nicht EMT Bereitstellen während EMT Induktions für die Untersuchung der anfänglichen Ereignisse einen besonderen Vorteil erfährt.

Das Modellsystem könnte möglicherweise EMT in Epithelien angewendet werden außerhalb des ZNS zu studieren, da Schlüssel EMT-Induktoren wie die Schnecke, Zeb und Twist-Proteine, werden auch während der EMT in Gewebesystemen außerhalb des ZNS gefunden. Dieses Modell system ermöglicht die standardisierte Isolierung von NSCs aus der Entwicklung Cortex Stammzelleigenschaften im Allgemeinen und EMT insbesondere zu studieren. Mit diesem System isolierten wir NSCs, induzierte EMT und studierte die spätere Migration unter der Wirkung von FGF2 und BMP-4. Wir beobachteten, dass FGF und BMP-Signalgebung wirkt mit TGFß Signalzellmigration zu fördern, damit die Modellsystem zu validieren.

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Protokoll

Alle Tier Verfahren folgte dem "Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren" (NIH Veröffentlichung, 8. Auflage, 2011) und wurden von der Animal Welfare Committee von Basel (Schweizer Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Tieren) zugelassen. Durch diese Leitlinien wird das Tier Protokoll des "niedrigsten Tierschweregrad" betrachtet.

1. Vorbereitung der Expansion Medium

Hinweis: Arbeiten unter aseptischen Bedingungen als Standard für die Gewebekultur.

  1. Nehmen Sie zwei 15-ml-Röhrchen und 5 ml L-Glutamin-freien DMEM / F12 (1: 1) aus einem 500 ml Medium Flasche in jede der zwei 15-ml-Röhrchen. Zum ersten 15-ml-Röhrchen, fügen Sie 50 mg menschliches apo-Transferrin, 50 ul Putrescin 1 M Stamm (0,1 mM Endkonzentration) und 30 ul Natrium Selen 500 uM Lager (Endkonzentration 30 nM).
    1. Man filtriert durch ein 0,2 & mgr; m-Spritzenfilter in die ursprüngliche DMEM / F12-Flasche.
  2. Zu der zweiten 15-ml-Röhrchen, fügen 12,5 mg Insulin. Hinzufügen6 - 9 Tropfen 1 M NaOH. Vortex Insulin vollständig aufzulösen. Man filtriert durch ein 0,2 & mgr; m-Spritzenfilter in die ursprüngliche DMEM / F12-Flasche.
    Hinweis: NaOH giftig und ätzend. Schutzhandschuhe, Mantel, und eine Schutzbrille.
  3. 5 ml Penicillin (10000 Einheiten / ml) / Streptomycin (10.000 & mgr; g / ml) / Amphotericin B (25 & mgr; g / ml) zu dem DMEM / F12-Medium Flasche.
  4. 5 ml 200 mM L-Glutamin Lager frisch aufgetauten oder Oligopeptide enthält Glutamin (200 mM L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptid) an die DMEM / F12-Medium Flasche.
  5. Gut schütteln. Bereiten Sie 50 ml Aliquots.
    Hinweis: Erweiterungsmedium kann für mindestens 2 Wochen bei 4 ° C gelagert werden. Aliquotiert Röhren zeigen weniger pH-Änderungen im Vergleich zum Medium in 500 ml Flaschen aufbewahrt.

2. Herstellung von Passagierung Medium

  1. Zu 1 L Ca 2+ - und Mg 2+ -freien HBSS Medien, fügen 990,85 mg Glucose (5 mM Endkonzentration) und 840,10 mg NaHCO 3 (10 mM Endkonzentration). Der pH-Wert auf 7,3 mit HCl (1 M Lager). Filter sterilisieren mit 0,2 um Filter und 50-ml-Aliquoten machen.
    Anmerkung: Die Passage Medium kann mindestens 4 Wochen lang bei 4 ° C gelagert werden.

3. Herstellung von Wachstumsfaktoren

  1. Bereiten sterile 1x PBS mit 1% BSA (PBS-BSA) allein oder mit Chlorwasserstoffsäure (HCl) bei 4 mM (PBS-BSA-HCl).
    Achtung: HCl ist ätzend und giftig und erfordert besondere Sicherheitsmaßnahmen (Mäntel, Brille, Handschuhe, Haube).
  2. Man löst 10 & mgr; g / ml rekombinantem humanen Fibroblast Growth Factor 2 (rhFGF2) in PBS-BSA (10 ng / ml Endkonzentration), 10 & mgr; g / ml rekombinantem humanem Bone Morphogenetic Protein 4 (rhBMP4) in PBS-BSA (10 ng / ml final Konzentration) und 20 & mgr; g / ml rekombinantem humanem Transforming Growth Factor & beta; 1 (rhTGFβ1) in PBS-BSA-HCl (40 ng / ml Endkonzentration).
    1. Nicht sterilisieren filtern. Bereiten Sie Aliquots.
      Anmerkung: Die Wachstumsfaktor-Aliquots können gespeichert werden bei-20 ° C für mindestens 2 Jahre.

4. Beschichtung von Zellkulturschalen

  1. Man löst 1,875 mg Poly-L-Ornithin (PLO) in 500 ml destilliertem H 2 O eine 250x PLO Lager vorzubereiten. Filter sterilisieren eine 0,2 & mgr; m Spritzenfilter mit und stellen jeweils 2 ml.
    Anmerkung: Diese Aliquoten können für mindestens 2 Jahre bei -20 ° C gelagert werden.
  2. Man löst 1 mg Rinder Fibronektin in 1 ml steril-destilliertem H 2 O 1,000x Fibronektin Lager vorzubereiten. Nicht mit dem Vortex, da dies die klebrige Protein gerinnen kann. Schütteln Sie vorsichtig von Hand für 10 min.
    1. Inkubieren für 1 h bei Raumtemperatur unter gelegentlichem Schütteln inkubiert. Überprüfen Sie für die vollständige Auflösung. Wärmen der Lösung auf weniger als 37 ° C zur vollständigen Auflösung von Fibronektin. Nicht filtern sterilisieren.
      Anmerkung: Die Lösung kann für bis zu 6 Monate bei 4 ° C gelagert werden.
  3. Verwenden Sie Plasma-vorbehandelte Kunststoff Zellkulturschalen (100 mm oder andere Größen je nach Bedarf fürdas Experiment). Zur Beurteilung der Migration verwenden 35-mm-Schalen mit 500 & mgr; m Raster. Inkubieren Geschirr über Nacht mit 2 ml 1x PLO für 12 h bei 37 ° C in einem 5% CO 2 Gewebekultur - Inkubator. Wasche zweimal mit 2 ml 1x PBS.
  4. 2 ml 1x Fibronectin (1 ug / ml Endkonzentration) und inkubiere Geschirr für mindestens 12 Stunden bei 37 ° C in einem 5% CO 2 -Inkubator. Entfernen Sie Fibronektin kurz vor dem Ausplattieren der Zellen.
    Hinweis: Fibronectin-beschichteten Schalen bei 37 ° C für mindestens 2 Wochen gelagert werden.

5. Standardisierte Dissection und Vorbereitung der Cortical Subventrikularzone (SVZ)

  1. Erhalten Ratte embryonalen Tag 14,5 (E14,5, Sprague-Dawley) und Maus E13.5 (C57BL / 6) Embryonen durch timed-Paarung. Mate-Tiere von 18:00 bis 08:00 Uhr am nächsten Morgen. Mittags nach dem Tag der Paarung wird E0.5 betrachtet.
  2. Anesthetize die trächtigen Tieres mit 5% Isofluran und 0,8 l / min Sauerstoffstrom. Überprüfen Sie Antwort von paw Kompression mit scharfen dissection Pinzette. Enthaupten das Tier. Vermeiden Sie CO 2 Ersticken als CO 2 Stamm wirkt sich die Erholung der Zellen.
  3. Abrufen Embryonen, die durch Kaiserschnitt.
    1. Platzieren Tier in Rückenlage und desinfizieren Fell mit 70% Ethanol. Verwenden Sie chirurgische Pinzette und Schere, um V-förmige Hautschnitt von ca. 8 cm im Unterbauch über dem Uterus zu machen. Inzision nur Haut mit Fell, während Muskelwände intakt zu halten.
    2. Verwenden Sie frische Pinzette und Schere, um die Muskeln einzuschneiden und die Bauchmuskelwand das Peritoneum zu betreten.
    3. Identifizieren Sie die Gebärmutter im unteren hinteren Peritoneum. Entfernen Sie die Gebärmutter durch scharfe Trennung von den umliegenden Geweben.
    4. Waschen Sie die Gebärmutter mit Embryonen mit sterilem 1x PBS und in eiskaltem 1x PBS.
    5. Verwenden Sie fein kippte Schere , um die Uteruswand zu öffnen Embryo zu lösen durch Embryo unter einem Präpariermikroskop (3 - facher Vergrößerung, Abbildung 1B). Verwenden Sie eine Zange, die embryonale Rümpfe zu entfernen ( Abbildung 1B). Halten Embryonen in Expansionsmedium auf Eis.
    6. Stellen Sie sicher , die richtige Entwicklungsphase durch den Atlas der Entwicklung Ratte Nervensystem 5. Die richtige embryo Größe wird in 1B gezeigt.
    7. Prüfen Sie weitere korrekte Alter durch die Anwesenheit von Beginn stelligen Bildung in der Ratte forelimb (FL) , wie in 1A dargestellt.
      Hinweis: Die Hinterbein (HL) noch nicht Ziffer Trennung zeigen (Abbildung 1B).
  4. Für Dissektion, Transfer Embryonen zu unbeschichteten Petrischalen mit eiskaltem 1x PBS gefüllt. Führen Sie Dissektion unter einem Stereomikroskop Dissektion (3- bis 20-facher Vergrößerung) mit autoklaviert feinen Pinzette.
    Anmerkung: Die Petrischalen Befestigung von Gewebe an der Geschirroberfläche verhindern, wie mit einem Plasma-beschichteten Zellkulturschalen passieren kann. Geschärfte Wolframdraht Nadeln oder ähnliches sind auch hilfreich für bestimmte Schritte der Dissektion.
  5. Entfernen Sie die Kopfhaut und Schädel an der inte Ausgangsrsection der Entwicklung Telenzephalon (TEL) und Zwischenhirns (DI) (1B) , indem Sie gleichzeitig nach vorn und hinten mit zwei Zangen , um Ziehen Zugang zu den Entwicklungs Neuralrohr (1C) zu gewinnen.
  6. Identifizieren Sie die Mittelhirns-hindbrain-Grenze (MHB, schwarzer Pfeil Kopf in 1B-D), Trennen des Mittelhirns (MES) von Rhombencephalon. Schneiden Sie die rhombencephalon nur bei oder unterhalb der MHB (1D, dreieckigen Pfeil).
    Hinweis: Die zusätzlichen subkutanen Raum an der MHB erleichtert Hautentfernung, ohne das Neuralrohr zu schädigen.
  7. Sever die Verbindung zwischen dem Telenzephalon / Dienzephalon an der Schädelbasis mit Gesichtsskelett (Abbildung 1E). Dies führt zu einem Block Telencephalon, Mesencephalon und Diencephalon (TEL-DI-MES) (1F-H) enthält.
  8. Übertragen Sie die TEL-DI-MES-Block in Expansionsmedium auf Eis. Halten Sie es completely in Expansionsmedium in einem unbeschichteten Petrischale abgedeckt. Halten Sie den Block an der Hirns mit einer Pinzette berührt die Telenzephalon zu vermeiden, dass die kortikale SVZ mit NSCs enthält.
  9. Wiederholen Sie die Schritte 5,5-5,8 mit allen Embryonen (1F-H).
  10. Übertragen einer TEL-DI-MES blockieren in frischem eiskaltem 1x PBS. Geschnitten entlang der gepunkteten Linie in der Vorderhirns (1F-H), das Mesencephalon von der Diencephalon trennen, wie in 1I gezeigt.
  11. Trennen Sie die DI aus dem TEL durch in 1F entlang der gestrichelten Linien schneiden. Siehe isoliert Telenzephalon in Abbildung 1J.
  12. Teilen Sie die zwei telencephalic Hemisphären, entlang der gepunkteten Linie in Figur 1J Schneiden. Dies führt zu zwei getrennten Halbkugeln , wie in Fig 1K veranschaulicht.
    Hinweis: Die linke Hemisphäre ist in Figur 1L vergrößert.
  13. Identifizieren Sie die mediale Bandelionic Eminenzen (MGE, 2A; *) und seitlichen ganglionären Eminenzen (LGE, 2A; +) sichtbar durch die Zukunft Foramen interventriculare.
    1. Mit einer Pinzette oder Nadel, sezieren entlang einer geraden Linie an der Kreuzung zwischen der MGE und LGE und der vorderen Kortex (ant-CTX, 2B). Schneiden Sie eine gerade Linie durch Kortex, Hippokampus (Hüfte) und Plexus (CP). Dies trennt den vorderen Kortex einschließlich des Riechkolbens (ob) von den ganglionic Erhabenheiten (GE, 2B, C).
  14. Schneiden Sie eine zweite gerade Linie an der Kreuzung der Schwanzganglienhügel (CGE, 2C, D) und dem posterioren Cortex (2C), wiederum durch Kortex Schneiden, Hippocampus und Plexus.
  15. Flatten Telenzephalon aus. Entfernen Sie vollständig den hinteren Pol und der Riechkolben (2D). Identifizierendie kortikale Saum des Hippocampus und des Plexus (2C) enthält, wie zuvor 6,7 definiert.
    Hinweis: Der Hippocampus eine dünnere Neuroepithel als die Kortikalis aufweist. Der CP enthält rote Gefäße.
    1. Trenne die kortikale hem aus der Rinde, die Größe des Kortex identisch mit der Größe der ganglionic Eminenzen (2D) zu verlassen. Dies führt zu einem Block von der Kortex (das Zielgewebe) und der ganglionic Eminenzen (GE, 2D).
  16. Klappen Sie den Cortex-GE-Block mit dem ventrikulären (inneren) Seite mit der Geschirroberfläche.
    Anmerkung: Die Außenfläche der Halbkugel den Experimentator (2E) gegenüber . Auf der Außenfläche sind die Blutgefäß enthaltenden Meningen (Figur 2E).
    1. Pin der GE mit der Geschirroberfläche mit der linken Hand und ziehen Sie die Meningen mit einer Pinzette in der rechten Seite (dominant) Hand aus (2F ).
      Hinweis: Dies ist die technisch anspruchsvollste Schritt, da die Hirnhaut stark an der Rinde haften. Die Trennung von Meningen aus der Rinde wird erleichtert durch eine völlig geraden Linie (nicht gezackt) in Schritten 5.13.1 und 5.14 Schneiden.
  17. Wiederholen Sie die Schritte 5,12-5,16 für die andere Hemisphäre und alle Embryonen. Schneiden Sie die Rinde entlang der LGE in einem Abstand von der Hälfte der Hauptdurchmesser des LGE (2G, 2H). Die seziert Kortex erstreckt sich über eine Fläche von 1,2 mm x 2,4 mm (Abbildung 2H) und beinhaltet die SVZ / Keimschicht mit den NSCs.

6. Herstellung von Explantation Kulturen

  1. Schneiden Sie die Rinde in Explantaten von weniger als 400 & mgr; m Durchmesser (Abbildung 2i). Verwenden Sie ein 400 & mgr; m Raster (Supplementary Abbildung 1) unterhalb der Dissektion Petrischale positioniert Referenz (Abbildung 2H und 2I). Übertragen Sie alle Explantate in eine frische Petrischale mit Eis-cold Expansionsmedium.
  2. Entfernen Sie die Fibronektin aus einer Gewebekulturschale (Schritt 4.4). Trocknen lassen. 1 ml kaltem Expansionsmedium zu der Mitte des 35 mm - Schale mit Rastermaß von 10 mm x 10 mm (Figur 3). Das Medium einen kugelförmigen Tropfen (3) zu bilden.
  3. Legen Sie bis 8 Explantate in die Mitte des Tropfens auf. Die Explantate sollte idealerweise mit mindestens 3 mm Abstand zueinander für die Migration Analyse (siehe Abschnitt 8) auf dem Gitter befinden.
  4. Inkubieren der Schale für ca. 1 h in einem Zellkulturbrutschrank (37 ° C, 21% O 2, 5% CO 2) für die Befestigung der Explantate. Lassen Sie die Explantate absetzen und an den Fibronektin-beschichteten Oberfläche befestigen. Nicht das Gericht schütteln, da können die Explantate lösen und der optimalen Rastermitte ausrücken.
  5. Nach 1 Stunde Inkubation (37 ° C, 21% O 2, 5% CO 2), Füllen der Schale bis zu einem Gesamtvolumen von 2 ml Expansionsmedium bis plus Wachstums fAkteure oder Substanzen von Interesse zu testen und zu brüten.
    Hinweis: Weder enzymatischen Verdau, noch Serum oder Zentrifugation für Explantatherstellung notwendig sind. Dies ist optimal für Zellintegrität.

7. Herstellung von NSC Single Cell Culture

  1. Warm up, Expansion und Passagierung Medium bei 37 ° C.
  2. Übertragen Sie die seziert Kortex Stücke (aus Schritt 5.17) in einen 15-ml-Röhrchen mit kaltem Expansionsmedium (Rohr A). Zentrifugieren Sie die Rinde Stücke für 5 min bei 1200 x g. Den Überstand aspirieren. In 200 ul vorgewärmtes Expansionsmedium der Hirnrinde Stücke wieder zu suspendieren.
  3. In 700 ul vorgewärmtes Passagierbarkeit Medium auf die 15-ml-Röhrchen mit einer P1,000 Spitze (Rohr A). resuspendieren vorsichtig das Pellet. Setzen Sie die Spitze am Ende des 15-ml-Tube. Sanft und langsam die Gewebestücke durch Absaugen dreimal mit der P1,000 Spitze distanzieren.
    Anmerkung: Die Passage mittlere Zelltrennung fördert und benötigt die Verwendung von Enzymen zu vermeiden.
  4. Lassen Sie die Röhrchen für 30 bis 60 Sekunden für eine größere (schwerer) undissoziiertem Stücke zu sitzen am Boden absetzen. Einzelne dissoziierten Zellen werden im Überstand verbleiben. Übertragen etwa 700 & mgr; l des Überstands in ein frisches 15-ml-Tube (Röhre B).
  5. Wiederholen Sie die Schritte 7.3 und 7.4, die größeren Stücke zu distanzieren.
  6. Wiederholen Sie die Schritte 7.3 und 7.4 ein zweites Mal die größeren Stücke zu distanzieren. Übertragen Sie alle Überstand auf die frische 15-ml-Tube (Röhre B).
  7. Hinzufügen Expansionsmedium auf ein Gesamtvolumen von 5 ml. Zählen von Zellen mit einer Zählkammer. Beurteilen Sie tote Zellen durch Trypan-Blau-Färbung.
    Hinweis: Kleine NSCs die Schritte tolerieren 7,2 bis 7,6 besser als größere Zellen. Etwa 4 x 10 6 Zellen mit 10% toten Zellen von 10 Embryonen erwarten.
  8. Zur Erweiterung von NSC, plättchen 1,5 x 10 6 Zellen pro 10 cm Fibronektin beschichteten Gewebekulturschale in einem Volumen von 8 ml Expansionsmedium. Für Standard-Erweiterung, fügen 8 ul 1,000x rhFGF2 Lager. In 8 ul rhFGF2 mich jeden Tag und änderndia jeden zweiten Tag.
    Hinweis: Die Rinde in diesem Entwicklungsstadium enthält eine Mehrheit von NSCs und nur eine Minderheit von differenzierten Zellen. Die differenzierten Minderheiten Zellen reagieren nicht auf die rhFGF2-Behandlung und sterben während der Expansionskultur.
  9. Passage erweitert NSC bei 60% Konfluenz.
    1. Um Passage NSCs, Expansionsmedium zu entfernen. Waschen Sie die Zellen schnell dreimal mit 5 ml Passagierbarkeit Medium. Warten Sie 2 bis 4 min. Ohne Ca 2+ und Mg 2+ die Zellen langsam von der Oberfläche abzulösen, Aufrundung. Stellen Sie sicher, Ablösung von Zellen unter dem Phasenkontrastmikroskop. Warten Sie noch ein paar Minuten, wenn nötig, bis die visuelle Ablösung von der Oberfläche beobachtet wird.
      Hinweis: Einzelne Zellen vollständig lösen, aber die meisten Zellen noch mit der Geschirroberfläche anhaften. Die Dauer für die Ablösung benötigt wird, ist abhängig von der Dauer der Fibronectin-Beschichtung. Eine kurze Fibronectinbeschichtung (12 h oder weniger) führt zu einer schnelleren Zellablösung. Für längere Experimente (>; 1 Woche) Fibronectin Beschichtung von mehr als 24 Stunden empfohlen.
  10. Verwenden Sie eine 10 ml Pipette vorsichtig auf die Zellen von der Oberfläche lösen. Sammeln Sie die 5 ml Passagierbarkeit Medium mit Zellen und überträgt es auf ein frisches 15-ml-Tube. Wiederholen Sie mit weiteren 5 ml Passagierbarkeit Medium.
  11. Dissoziieren die Zellen in den 15-ml-Röhrchen durch Auf- und Abpipettieren dreimal, die 10 ml-Pipette am Boden des Röhrchens setzt. Drehen Sie das Röhrchen für 15 min bei 1200 × g bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Überstand und das Pellet in 2 ml Expansionsmedium. Zählen von Zellen mit einer Zählkammer. Verwenden Sie Trypanblau toten Zellen zu beurteilen.
    Anmerkung: Nach der Expansion auf 60% Konfluenz erwarten 4 - 5 x 10 6 Zellen mit einer toten Zellzahl bei etwa 10%.
  12. Tafel 8 x 10 5 Zellen pro 10 cm Schale für weitere Passagen.

8. Bewertung der Migration

  1. Zur Bewertung der Migration, isolieren Explantaten gemäß Abschnitt 5. Seed die Explantate in35-mm-Raster Gerichte. Eine Stunde nach der Plattierung, fügen FGF2 (rhFGF2). Die Schalen werden in einem 37 ° C Inkubator für 2 Tage.
    Hinweis: Für eine optimale Explantation Befestigung, um das Geschirr zu bewegen.
  2. Entfernen Sie Medium von 1000 ul Spitze. 2 ml Expansionsmedium von 1000 ul Spitze am inneren Kreis beginnen (Abbildung 3). Dies reduziert die Oberflächenspannung auf Explantate.
  3. Hinzufügen, Wachstumsfaktoren einzeln oder in Kombination, wie für das Experiment erforderlich ist. Verwenden Sie FGF2 / BMP-4 / TGFβ1 als Positivkontrolle. Anmerkung: In diesem Experiment wurden 2 ul FGF2 pro 35 mm - Schale, 2 & mgr; l BMP4 und 4 ul TGFβ1 wurden allein und in Kombination (Figur 5) gegeben.
    1. Fügen Sie zusätzliche Faktoren und / oder testbare Substanzen. Halten Sie Gerichte wieder unangetastet für 2 Tage bei 37 ° C.
  4. Machen Sie Fotos von Explantaten auf einem inversen Mikroskop.
    Hinweis: Living Explantate bessere Phasenkontrastbilder als fixierte Zellen ergeben. Beide können verwendet werden.
  5. Für die MigrationBeurteilung, verwenden Sie eine Grafik - Software , die Pixel - Messungen (zB Fidschi 8) ermöglicht.
  6. Messen Sie die Schale Raster von 500 & mgr; m Abstand in Pixeln und es als interne Referenz verwendet werden.
  7. Definieren Sie die Mitte der Explantation als Migrationsstartpunkt. Den Abstand zwischen dem Zentrum des Explantats und der äußersten Gruppe von 10 Zellen.
    Anmerkung: Alle Zellen, die aus dem Explantat zentrifugal weg migrieren. Sie bilden sich spontan ein Blatt am Umfang unter den Bedingungen getestet (Abbildung 5).

9. Invasion Bewertung

  1. Bereiten Sie Fibronektin-beschichteten Gewebekultur 24-Well-Platten gemäß Protokoll Abschnitt 4.
  2. Legen Sie 300 ul warmen Expansionsmedium in die obere und der Zellinvasion Kammern. Inkubieren der Kammern für 30 min bei 37 ° C und 5% CO 2.
  3. Entfernen Sie das Expansionsmedium von oben gut und legen Sie die Boyden-Kammer in die beschichtete 24-Well-Platte.
  4. In 500 ul warmen Expansionsmedium mit 0,5 ul rhFGF2 und 0,5 ul rhBMP4 auf den Boden gut.
  5. Passage NSCs und zählen sind, wie in Abschnitt 7 Passages 1 bis 4 beschrieben geeignet.
  6. Platte 5 x 10 5 Zellen in einem Volumen von 300 & mgr; l warme Expansionsmedium mit 0,3 ul rhFGF2 und 0,3 ul rhBMP4 in der oberen Mulde der Boyden - Kammer.
  7. Kultur die ausgesäten NSCs für 24 Stunden.
  8. Fügen zusätzliche Faktoren und / oder prüfbare Substanzen in die Kammer und Kultur der Zellen für weitere 48 hr.
    Hinweis: Wenn die Zellen invasiv sind, sie von oben gut durch die Basalmembran Schicht auf den Boden gut passieren. Invasiver Zellen werden dem Boden der Boyden Kammer anhaften.
  9. Folgen Sie dem Protokoll vom Hersteller zur Verfügung gestellt. Verwenden Sie Wattestäbchen (bei der Invasion Assay-Kit enthalten) durch die Reinigung zweimal die nicht-invasive Zellen in der Spitze gut zu entfernen.
  10. Entfernen Sie das Medium aus den Vertiefungen und fügen 500 ul Expansionsmedium miteine Plasmamembran-Färbung für Zellen und mit dem Kernfarbstoff DAPI in die Vertiefungen leben.
  11. Inkubieren für 10 min bei 37 ° C und 5% CO 2.
    Anmerkung: Die Farbstoffe werden integriert in die Membran und der Kern der invasive Zellen, die jeweils für eine optimale Visualisierung 8. Option: Auslassen Plasmamembran Farbstoff, wenn mehrfarbige Immunzytochemie geplant.
  12. Entfernen Sie das Medium mit den Farbstoffen und waschen zweimal mit Expansionsmedium. Visualisieren und invasive Zellen mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop zählen wie zuvor 8 gezeigt.
    Hinweis: Einige invasive Zellen vom Boden der Kammer abgelöst haben kann, und haben auf die Bohrlochoberfläche fallen gelassen unten, wo sie an der beschichteten Oberfläche haften. Für eine vollständige Analyse sind die Zellen an der Oberfläche gut.
  13. Entfernen Sie das Medium und befestigen Sie die Zellen in eiskaltem frisch 4% PFA für 10 min. Waschen 3x mit 1x PBS. Führen Sie Immunzytochemie auf invasive Zellen, wie zuvor 8-10 beschrieben.

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Ergebnisse

Dieses EMT Modellsystem auf die genormte Isolierung von NSC basierend sowohl als einzelne Zellen oder als Explantate aus einer bestimmten Region des Entwicklungs Neuralrohr, die zentrale cortex (1 und 2). Für die quantitative Beurteilung wurden Explantate direkt im Zentrum eines 500 & mgr; m Raster Kulturschale (Abbildung 3) ausgesät. Explantate von der zentralen Kortex wurden zunächst für zwei Tage ausgesetzt FGF2, durch zusätzliche...

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Diskussion

In dieser Studie wurde ein standardisiertes System für die EMT - Analyse unter Verwendung von NSCs beschrieben wird (im Ergänzungs Abbildung 3 zusammengefasst). Die Standardisierung gewährleistet Reproduzierbarkeit (Tabelle 1 und 2). Die NSCs werden von der Entwicklung Cortex abgeleitet, ein Gewebe, das normalerweise nicht EMT unterziehen. Dies ist von Vorteil für die Analyse der frühen Schritte in EMT. Erste Schritte in EMT nicht ausreichend in Tumorzellen untersucht werden, die geneti...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Die Studie wurde von der Universität Basel Science Foundation und der Schweizerischen National Science Foundation unterstützt durch einen Zuschuss zu MHS und AG (SNF IZLIZ3_157230) unterstützt. Wir danken: Dr. Tania Rinaldi Burkat für Infrastruktur großzügig bereitstellt; alle Mitglieder der Gruppe Bettler für Diskussionen und Kommentare. Wir danken Gerhard Dorne (Leica Microsystems, Schweiz) für professionelle und kompetente Installation des Full-HD-MC170 Videokamera (Leica Microsystems, Schweiz).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
BMP4, rhBMP4RnD-Systeme 314-BP-01M
Pankreasinsulin für RinderSigma I1882
Boyden-Kammer, CytoSelect ZellinvasionsassayCell BiolabsCBA-11024-Well-Plattensystem
Zellkulturschale mit GitterIbidi 500 mm Schale, 35 mm80156
CellMask OrangeLife TechnologiesC10045Plasmamembranfarbstoff, Verwendung im Verhältnis 1:1.000.
DAPILifeTechnologiesD1306Bestand bei 5 mg/ml. Anwendung bei 1:10.000. Krebserregend. Angemessener Schutz (Handschuhe, Mantel, Schutzbrille) erforderlich.
DMEM/F12 1:1 mittelgroße FlascheGibco Invitrogen21331-020
FGF2, rhFGF2RnD Systems233-FB-01M
Fibronektin, bovineSigma F4759
Glutamax Ergänzung Gibco Invitrogen 35050-061
Grafiksoftware mit PixelmessfunktionFijifiji.sc/FijiVersion 2.0.0-rc-30/1.49s
HBSS mediaSigma H9394
Humanes Apo-TransferrinSigmaT1147Mögliche Lungenreizung. Vermeiden Sie das Einatmen. Verwenden Sie einen angemessenen Schutz.
L-GlutaminGibco Invitrogen 25030-024
Nestin, Maus-Anti-Nestin-AntikörperGenetexGTX26142Verwendung bei 1:100, 4 % PFA-Fixierung, Triton X100 bei 0,1 %
Olig2, Kaninchen-Anti-Olig2-AntikörperBereitgestellt von Hirohide TakebayashPersönlicher LagerbestandVerwendung bei 1:2.000, 4 % PFA-Bindung, Triton X100 bei 0,1 %
Penicillin/Streptomycin/FungizoneGibco Invitrogen 15240-062
Podoplanin, Maus-Anti-Podoplanin-AntikörperAcrisDM3614PAnwendung bei 1:250, 4% PFA-Fixierung, vermeiden Sie Triton X100
Poly-L-OrnithinSigma P3655
PutrescineSigma P5780Haut- und Augenreizend. Angemessener Schutz erforderlich.
NatriumselenitSigma S5261
Sox10, Kaninchen-Anti-Sox10-AntikörperMillipore ChemiconAB5774Verwendung bei 1:200, 4% PFA-Fixierung, Triton X100 bei 0,1%
TGFb1, rhTGFb1RnD Systems240-B-010
Unbeschichtete PetrischalenFalcon Corning351029

Referenzen

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