Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Untersuchung von gefrierfrakturiertem Pflanzengewebe. Unter hohem Druck gefrorene Blattproben werden gefriergebrochen und doppelschichtbeschichtet, wodurch gut konservierte gefrorene hydratisierte Proben entstehen, die mit dem Kryo-Rasterelektronenmikroskop bei hohen Vergrößerungen mit minimaler Strahlschädigung abgebildet werden.
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Methodenartikel
Die Untersuchung der supramolekulare Organisation Photosynthetic Membranen innerhalb Gefrier gebrochen Blattgewebe von Cryo-Rasterelektronenmikroskopie
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Cryo-Rasterelektronenmikroskopie (SEM) von gefrier gebrochenen Proben ermöglicht Untersuchung biologischer Strukturen mit nahezu nativen Bedingungen. Hier beschreiben wir eine Technik zur Untersuchung der supramolekulare Organisation von photo (thylakoid) Membranen innerhalb Blattproben. Dies wird durch die Hochdruck Einfrieren von Blattgewebe erreicht, gefrier Fracturing, Double-Layer-Beschichtung und schließlich Kryo-SEM-Bildgebung. Die Verwendung der Doppelschicht-Beschichtungsverfahren ermöglicht eine hohe Vergrößerung (> 100.000 ·) Bilder mit minimaler Strahlen Schäden an den tiefgefrorenen Proben sowie minimale Aufladungseffekte zu erwerben. Mit den beschriebenen Verfahren untersuchten wir die Veränderungen in der supramolekularen Verteilung des Photosystems und lichtsammelnden Antenne Proteinkomplexe, die während der Dehydratisierung der Auferstehungspflanze Craterostigma pumilum stattfinden, in situ.
Einleitung
Oxygenic Photosynthese, mit Ursprung in der alten Cyanobakterien, wurde von Algen und Landpflanzen von endosymbiontischen Ereignisse geerbt, die zur Entwicklung des Chloroplasten Organell geführt. In allen heutigen oxygenic phototrophs, photosynthetischen Elektronentransport und die Erzeugung von Protonen-Antriebskraft und Reduktionskraft innerhalb abgeflachten sackartige Bläschen genannt 'thylakoid' Membranen durchgeführt. Diese Membranen beherbergen die Proteinkomplexe, die die lichtgetriebene Reaktionen der Photosynthese durchführen und ein Medium für die Energieübertragung zur Verfügung stellen. Die Thylakoidmembran von Pflanzen und (etwas) Algen sind in ....
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Protokoll
1. Cryo-Fixierung von Blattgewebe durch Hochdruck-Freezing
Hinweis: In diesem Abschnitt wird beschrieben, wie Hochdruck Einfrieren von Blattgewebe durchzuführen für eine Gefrierbruch-Experiment. Für Überlegungen zu Pflanzenproben zu sehen im Zusammenhang mit 29. Dies kann für andere Arten von Geweben oder Proben mit einigen Änderungen angepasst werden.
- Verwendung der Ecke einer Rasierklinge, kratzen die Unterseite des 0,1 mm Hohlraum einer 0,1 / 0,2 mm Aluminiumplättchen (Abbildung 1). Bereiten Sie mindestens ein Dutzend Plättchen (6 Proben). Seien Sie vorsichtig, nicht Messer Markierungen auf dem Um....
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Ergebnisse
Abbildung 1 zeigt Kryo-REM - Aufnahmen von Blutplättchen Hochdruck eingefroren, gefrier gebrochen Craterostigma pumilum Blattstücke enthält. In einigen Proben sind große Regionen von gebrochenen Zellen erhalten (1A). In anderen, bleibt das Blattstück fest an der oberen Scheibe gebunden und zusammen mit ihm (1B) abgeschlagen. Aber auch im zweiten Fall können einige Blattgewebe zum Messer Rillen auf dem Plättchen (1B,
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Diskussion
Die Technik in diesem Papier beschrieben ermöglicht Untersuchung von gefrier frakturiert Membranen im Zusammenhang mit gut erhaltenen Hochdruck eingefroren Pflanzengewebe durch Kryo-Rasterelektronenmikroskopie. Der große Vorteil dieser Verfahren zu verwenden, ist, dass die Probenvorbereitung rein physikalisch ist; keine Stufen Chemikalien oder Dehydrierung sind beteiligt notwendig. Somit ermöglicht es 26,32 biologische Strukturen in einer nahezu nativen Zustand zu studieren. Der Vorteil von Blattgeweben beste.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Wir danken Andres Kaech (Universität Zürich) für seine hilfreiche Ratschläge auf Rasterelektronenmikroskopie Bildgebung. Diese Arbeit wurde von den Vereinigten Staaten und Israel Binationale landwirtschaftliche Forschung und Entwicklung Fonds unterstützt (Förder-Nr. US-4334-10, ZR), der Israel Science Foundation (Grant Nr. 1034/12, ZR) und der Human Frontier Science Program (RGP0005 / 2013 ZR). Die Elektronenmikroskopie-Studien wurden an der Irving und Cherna Moskowitz Center for Nano und Bio-Nano-Imaging am Weizmann Institute of Science durchgeführt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Ethanol abs | Bio-Lab | 052505 | |
| Isopropanol | Bio-Lab | 162605 | |
| 1-Hexadecen | Sigma-Aldrich | H7009 | |
| 0,1/0,2 Thrombozyten | Ingenieurbüro M. Wohlwend GmbH, Schweiz | 241 | Thrombozyten haben einen Durchmesser von 3 mm und eine Dicke von 0,5 mm (Typ A) mit 0,1/0,2 mm tiefen Kavitäten (Durchmesser 2 mm). Ähnliche Blutplättchen können von Leica Microsystems bezogen werden. |
| Hochpräzise Pinzette | Elektronenmikroskopie Sciences | 72706-01 | Dumont (Schweiz) Durostar Style #5 Pinzette; Kann durch andere hochpräzise Pinzetten ersetzt werden. |
| Hochdruck-Gefriermaschine | Bal-Tec | HPM 010 | Alternativen zum Hochdruck-Gefrieren: 1. HPF Compact 02, Wohlwend GmbH; 2. HPM 010, RMC Boeckeler; 3. EM PACT2, Leica Microsystems; 4. EM HPM 100, Leica Microsystems; 5. EM ICE, Leica Microsystems. |
| Gefrierfraktursystem | Leica Microsystems | EM BAF 060 | |
| Kryovorbereitung Ladetisch | Leica Microsystems | 16770228 | |
| Probenhalter für die universelle Gefrierfraktur | Leica Microsystems | 16LZ04746VN | Klemmhalter für Probenträger mit einem Durchmesser von 3 mm |
| Vakuum-Kryotransfer-Shuttle | Leica Microsystems | EM VCT 100 | |
| Rasterelektronenmikroskop | Zeiss | Ultra 055 | |
| Kryo-REM-Tisch | Leica Microsystems | 16770299905 | |
| Bilderfassungssoftware | SmartSEM, Carl Zeiss Microscopy GmbH | ||
| Bildanalysesoftware | Fiji/Image J, National Institute of Health | http://fiji.sc/Fiji |
Referenzen
- Anderson, J. M. Insights into the consequences of grana stacking of thylakoid membranes in vascular plants: a personal perspective. Aust. J. Plant Physiol. 26 (7), 625-639 (1999).
- Branton, D. Fracture Faces of Frozen Membranes. Pro....
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Nachdrucke und Genehmigungen
