Methodenartikel

Stencil Mikrostrukturierung von humanen pluripotenten Stammzellen für die Sondierung räumliche Organisation Differenzierung Fates

DOI:

10.3791/54097

⸱

17. Juni 2016

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, National University of Singapore, 2Singapore Institute of Neurotechnology (SINAPSE), National University of Singapore

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) haben die intrinsische Fähigkeit zu differenzieren und sich selbst zu organisieren in verschiedene Gewebemuster; obwohl dies erfordert die Darstellung der räumlichen Umweltgradienten. Wir präsentieren Schablone Mikro als einfache und robuste Methode biochemische und mechanische Gradienten zu erzeugen, für HPSC Differenzierungsmuster zu steuern.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Humane pluripotente Stammzellen (hPSCs), einschließlich embryonaler Stammzellen und induzierter pluripotenter Stammzellen, haben die intrinsische Fähigkeit, sich in alle drei Keimblätter zu differenzieren. Dies macht sie zu einer attraktiven Zellquelle für die regenerative Medizin und die experimentelle Modellierung normaler und kranker Organogenese. Die Differenzierung von hPSCs in vitro ist jedoch heterogen und räumlich ungeordnet. Technologien zur Zellmikrostrukturierung bieten möglicherweise die Möglichkeit, die Mikroumgebungen von Stammzellen räumlich zu kontrollieren und die daraus resultierenden Differenzierungsschicksale zu organisieren. Bei der Mikrostrukturierung von hPS-Zellen müssen die strengen Anforderungen an das Überleben und die Aufrechterhaltung von hPS-Zellen berücksichtigt werden. Hier beschreiben wir die Schablonen-Mikrostrukturierung als eine Methode, die sehr gut mit hPSCs kompatibel ist. hPSC-Mikromuster werden durch die Geometrien der Durchgangslöcher der Zellschablone spezifiziert, die die Stellen, an denen hPSCs auf das darunter liegende, mit extrazellulärer Matrix beschichtete Substrat zugreifen und sich daran anheften können, physikalisch begrenzen. Aufgrund dieser Funktionsweise besteht im Vergleich zu anderen Zell-Mikrostrukturierungsmethoden eine größere Flexibilität bei der Verwendung von Substraten, die hPSCs angemessen unterstützen können. Wir beleuchten auch kritische Schritte für die erfolgreiche Erzeugung von hPSC-Mikromustern. Als Beispiel zeigen wir, dass die Schablonen-Mikrostrukturierung von hPSCs verwendet werden kann, um die räumliche Polarisation von Zell-Zell- und Zell-Matrix-Adhäsionen zu modulieren, was wiederum die Differenzierungsmuster des Mesoendoderms bestimmt. Diese einfache und robuste Methode zur Mikrostrukturierung von hPS-Zellen erweitert die Aussichten auf die Etablierung experimenteller Modelle zur Untersuchung der Gewebeorganisation und -musterung während der frühen Embryonalentwicklung.

Einleitung

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Humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs), einschließlich embryonaler Stammzellen (hES-Zellen) und induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) werden in der regenerativen Medizin sowie experimentelle Modellierung von normalen und erkrankten Organogenese aufgrund ihrer Differenzierungspotential in Zelllinien aller weit ausgebeutet drei Keimschichten 1,2. Die Differenzierung Schicksale von hPSCs sind sehr empfindlich auf lokale Umweltfaktoren , die 1 autokrine oder parakrine modulieren können Signalisierung sowie Mechanotransduktion Prozesse durch körperliche Signale vermittelt 3-5. Zelle Mikro umfasst eine Reihe von Techniken , die räumlich zu organisieren , um die Geometrie und die Position einer Zellpopulation als Mittel entwickelt wurden 3 die lokale zelluläre Mikroumgebung zu steuern, wie Zell-Zell - Wechselwirkungen 6 und Zell-Matrix - Wechselwirkungen. Im Rahmen der hPSCs wurde Zelle Mikro wichtige Erkenntnisse darüber zu gewinnen, wie beschäftigt Nischen abhängenent autokrine Signalisieren moduliert hESC Pluripotenz-Differenzierung Entscheidungen 7 und Organisation in der frühen embryonalen Differenzierungsmuster 6. 2D- und 3D mikro hPSCs wurden verwendet , um die Koloniegröße von mehrzelligen Mustern zu steuern, die wiederum beeinflusst Differenzierungs Entscheidungen in die drei Keimschichten 8,9. Wir haben vielzelligen HPSC Mikromuster verwendet , um das Ausmaß der Zell-Zell- und Zell-Matrix - Interaktionen innerhalb einer HPSC Kolonie zu modulieren , zu untersuchen , wie Integrin-E-Cadherin - Übersprechens 10 Anlass zu Zellschicksal Heterogenität geben kann. Die Demonstrationen aus den oben genannten Berichten eröffnen neue Wege in Richtung der Anwendung von mehrzelligen Mikro von hPSCs als experimentelle Modelle für Medikamententoxizität Screening auf Entwicklungsstörungen 11, die Wirkung von Wachstumsfaktoren und Hormone während der Gewebe oder Organentwicklung zu studieren, und die Bildung von zu entwirren Gewebemuster.

Eine Vielzahl von Zell micropatterning - Techniken wurden von Falconnet et als prüft entwickelt. al. 12 , aber nur eine Handvoll, wie Mikrokontaktdrucken 7,8,13, Mikrowell - Kultur 14,15, Photostrukturierungs 6 und microstencils 16 wurden mit hPSCs erfolgreich umgesetzt. Die Herausforderung mit Mikro hPSCs liegt in ihrer Verletzlichkeit und einer stringenten Bedingung von spezifischen extrazellulären Matrices (ECM) und die Wachstumsbedingungen für die Zellhaftung und Überleben. Für 2D HPSC Muster ist Mikrokontaktdrucken eine der gebräuchlichsten Methoden HPSC Mikromuster auf Gewebekultur und Glassubstrate 13 zu erzeugen. Das Verfahren kann gemeinsam Muster ECM in HPSC Kultur verwendet werden, einschließlich Laminin und Basalmembran-Matrices wie Matrigel. Allerdings erfordert es in der Regel einen zweistufigen Beschichtungsverfahren unterstützt von Poly-D-Lysine und benötigt spezifische inerten atmosphärischen und Feuchtigkeitsbedingungen stabil ECM Mikromuster zu machen für hPSCs auf 6,13 zu befestigen. Die wichtigste Überlegung jedes Mikro Methode ist, ob die Oberflächenmodifikation Regime HPSC-Klebstoff ECM-Muster in der gewünschten geometrischen Auflösung bei gleichzeitiger Minimierung unspezifischer Zellbindung an die Umgebung erzeugen kann.

Hier berichten wir die Verwendung von Schablonenmikro als einfaches Verfahren HPSC Mikro ohne zusätzliche Oberflächenmodifikationsschritte vor der Erzeugung von Klebstoff ECM Muster zu erzeugen, um hPSCs zu befestigen auf. Die Zell Schablone besteht aus einer dünnen Membran, beispielsweise Polydimethylsiloxan (PDMS) -Folie, mit micron Durchgangslöchern bis Millimetergröße auf ein Substrat Zellkultur abzudichtenden physikalisch ECM Beschichtungen und anschließend beimpft hPSCs enthalten. Als Schablonenmuster durch physikalisches Zurückhalten der Position arbeitet, wo HPSC kann an dem darunterliegenden ECM beschichtete Substrat direkt zuzugreifen und diese befestigen, ist dieses Verfahren kompatibel mit verschiedenen Substraten, die HPSC Kulturen unterstützen kann. Die einzigen requirement ist, dass die Wahl des Schablonenmaterial eine reversible Dichtung mit dem Substrat bilden kann. Diese Substrate umfassen herkömmliche Gewebekultur - Polystyrol (TCPS) 17, Liganden konjugiert Substrate 18 sowie elastomere Substrate mit abstimmbaren Steifigkeit (z. B. PDMS) 19. Dieses Verfahren ermöglicht auch das Beschichten von verschiedenen ECM, wie Vitronectin (oder VTN - Protein), Laminin und Basalmembran Matrices (zB Matrigel und Geltrax) für die richtige Befestigung und die Differenzierung von hPSCs zu ermöglichen. Deshalb können wir für eine bestimmte HPSC Linie optimierte ECM-Substrat-Konfigurationen Transfer zum Schablone für eine optimale Zell-Matrix-Adhäsion, das Überleben und die Differenzierung Mikrostrukturierung. Kürzlich wurde ein ähnliches Verfahren auch hepatische Differenzierung von Mikro hESCs unter Verwendung von Poly (methylmethacrylat) (PMMA) Mikroschablonenanordnungen 16 zu leiten berichtet.

Zell Schablonen können aus verschiedenen Materialien hergestellt werden, einschließlich erfülltals 20,21, Poly (p-xylylen) Polymere 22,23, PMMA und 16 am häufigsten, PDMS 24-28. Silicon und Poly (p-xylylen) Polymere Schablonen erfordern direkte Ätzen der Durchgangslöcher mit Spezialgeräten 20-23, was deren Zugänglichkeit für die biologische Anwender einschränkt. PDMS Schablonen können durch verschiedene Verfahren hergestellt werden , in Abhängigkeit von der Merkmalsgröße benötigt, die typischerweise von 3 & mgr; m bis 2.000 & mgr; m reicht 11,26-29. Wenn kleine Features gewünscht werden, dünne stenciling Blätter können durch Pressformen PDMS pre-Polymer auf einem mikrostrukturierten Silizium Vorlage mit Reliefs der Mikromuster 28 hergestellt werden. Für Funktionen> 1000 & mgr; m, bietet ein CO 2 Laser - Cutter eine einfache und kostengünstige Methode , um direkt die Muster auf einem bereits gegossenen PDMS Blatt während Schablonenherstellung geschnitten. Die Rezyklierbarkeit von PDMS Schablonen macht sie auch kosteneffektiv eine Reihe von Experimenten mit ausreichender Konsistenz durchzuführen.

Hier präsentieren wir die detaillierte Methodik für die Herstellung eines PDMS Schablone mit 1000 um Funktionen durch Laserschneiden und die Erzeugung von hESC Mikro. Diese hESC Mikro wurden verwendet , um das Ausmaß der Integrin und E-Cadherin vermittelte Verwachsungen innerhalb einer zusammenhängenden hESC Kolonie zu modulieren , um zu untersuchen , wie räumliche Polarisierung der Zelladhäsion führte Zellschicksal Heterogenität 10.

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Protokoll

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Hinweis: Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von PDMS Schablone mit 1000 um Muster durch Laserschneiden und Mikrostrukturierung der hESC Linie, H9 die PDMS-Schablone verwenden.

1. Konstruktion und Herstellung von PDMS-Schablone zur Mikro

  1. Gestalten Sie das Schablonieren Blatt mit Durchgangslöchern der gewünschten Geometrie und Größe (zB 1000 um Kreise) und die Schablone Dichtung mit Computer-Aided - Design - Software - 10.
  2. Laser-schneiden Sie die stenciling Blatt und Dichtung auf 120-150 & mgr; m und 2 mm dicke Polydimethylsiloxan (PDMS) Blätter jeweils einen CO 2 -Laser-Schneider 10 verwendet wird .
  3. Bond, die PDMS-Dichtung mit der PDMS-Schablonenblatt unter Verwendung von flüssigem nicht gehärtete PDMS und backen bei 60 ° C für 3-4 Stunden die PDMS-Schablone für Mikrostrukturierung zu erhalten.
  4. Sterilisieren des PDMS Schablone durch Autoklavieren bei 120 ° C für 30 min und Trocknen in einem Ofen vor dem Gebrauch.

2. hESCs HauptWartung

  1. Kultur die hESC Linien in einem Zubringer freien Erhaltungsmedium auf 1 × hESC-qualifizierte Basalmembranmatrix beschichtete Zellkultur - Platten bei 37 ° C und 5% CO 2.
  2. Passage die hESCs, wenn sie etwa 70% konfluent sind durch 3 min Inkubation bei 37 ° C mit Dispase-Behandlung und mechanisch die HES-Kolonien in 100-200 um Klumpen dissoziiert. Platte , die die hESCs Klumpen in einer Dichte von 30 bis 50 Klumpen pro 9,6 cm 2 Wachstumsbereich auf Basalmembranmatrix beschichteten Gewebekultur Polystyrol bei 1: 6 Teilungsverhältnis.

3. Stencil Mikrostrukturierung von humanen embryonalen Stammzellen

  1. Vorbereitung vor Strukturierung der Zelle
    1. Siegel eine PDMS Schablone auf eine 60 mm Petrischale durch den Verzicht 700 & mgr; l 70% Ethanol Analysequalität in Reinstwasser in der Petrischale und legen Sie die Schablone an der Spitze.
    2. Legen Sie die Petrischale innen Biosicherheitsschrank über Nacht zu lassen ter Ethanol trocken.
    3. Check keine Blase unterhalb der Schablone vorhanden ist, um sicherzustellen, dass die Schablone mit der Petrischale eine gute Dichtung bildet. Dies verhindert ein Austreten von ECM-Beschichtungslösung. Verschließen Sie die Petrischale und speichern unter sterilen Bedingungen, bis sie bereit für die Zellaussaat ist.
    4. Bereiten Sie Teilmengen von hESC-qualifizierte Basalmembranmatrix nach dem Analysezertifikat. Stellen Sie sicher, dass jeder Teilmenge ergibt 1 × hESC qualifizierte Basalmembranmatrix Lösung, wenn in 25 ml Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium verdünnt: Nährsalzgemisch F-12 (DMEM / F12) nach Herstellerproduktblatt.
    5. Bereiten Sie die ECM-Beschichtungslösung durch Zugabe eines aliquoten von hESC-qualifizierte Basalmembranmatrix in 16,7 ml DMEM / F12 1,5 × hESC-qualifizierte Basalmembranmatrix Lösung zu machen. Halten Sie alle ECM-Beschichtungslösung auf Eis Gelieren zu verhindern.
    6. Nachtrag hESC Erhaltungsmedium mit 10 & mgr; M ROCK-Inhibitor (Y27632).
  2. ECM - Beschichtung auf dem Substrat schablonierte
    1. Behandeln Sie die Petrischale mit 100 WO 2 Plasma für 90 Sekunden. Um die Sterilität zu gewährleisten, öffnen nur die Petrischale Abdeckung innerhalb der Plasmakammer vor der Plasmabehandlung, und schnell die Petrischale nach Abschluss der Behandlung abdecken zurück. Dies erleichtert die Benetzung der Oberfläche und verhindert die Bildung von Luftblasen in dem Mikrodurchgangslöcher während der Zugabe von ECM Beschichtungslösung.
    2. In 450 & mgr; l von 1,5 × hESC-qualifizierte Basalmembranmatrix Lösung die gesamte Schablone zu decken. Abdichten der Petrischale mit selbstsiegelfähigen Folie, wie beispielsweise Parafilm, zu verhindern, dass die Lösung vor dem Austrocknen, und Inkubation für 5 h bei 37 ° C vor dem Gebrauch.
  3. Seeding hESCs auf die schablonen Substrat
    1. Untersuchen Sie hESC Kolonien in 6-Well - Platte , die die differenzierte Zellbereiche zu identifizieren , zeigt Verlust der typischen hESC Morphologie (zB Verlust von gerundeten, dicht packed epitheliale Morphologie, hohe Kern / Zytoplasma-Verhältnis mit prominenten Nukleolen). Entfernen Sie differenzierte Regionen ein Vakuum Absauger verwenden.
    2. Waschen Sie zweimal mit 2 ml DMEM / F12 pro Vertiefung.
    3. 1 ml von Verdauungsenzymen, wie Accutase, pro Vertiefung von 6-Well-Platte und inkubiere bei 37 ° C für 8 min. Tippen Sie auf die Platte sanft alle Kolonien von Substrat zu lösen.
    4. Spülen jede Vertiefung mit mindestens 4 ml DMEM / F12 pro 1 ml von Verdauungsenzymen und sammeln die Zellsuspension in 15 ml konischen Röhrchen.
    5. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 200 × g für 3 min bei Raumtemperatur.
    6. Absaugen den Überstand zu entfernen und 400 ul hESC Erhaltungsmedium mit ROCK-Inhibitor (Rocki) ergänzt fügen Sie die Zellen erneut zu suspendieren. Pipette die Zellsuspension nach oben und unten 3-mal sanft Klumpen zu brechen in einzelne Zellen.
    7. Mischen Sie die Einzelzellsuspension gut und verdünnen 10 ul Zellproben in 190 ul DMEM / F12 (1:20 Verdünnung). Verwenden Sie einen hemocytometer der Zelldichte in der Lager-Zellsuspension zu bestimmen.
    8. Berechnen Sie die erforderliche Zellansiedlungsdichte für eine gegebene Schablone.
      HINWEIS: Zum Beispiel haben wir experimentell die Zellansiedlungsdichte bestimmt eine konfluente Monoschicht aus einzelnen Zellen zu erhalten , beträgt etwa 4.444 Zellen / mm 2. Somit wird bei einer Dichte von 2 Millionen Zellen eine Zellsuspension zu erfordern / 400 & mgr; l eine Schablone mit einer Fläche von 450 mm 2 und seeding Volumen von 400 ul wird.
    9. Von der Stammzellsuspension auf die gewünschte Aussaatdichte mit hESC Kulturmedium (Schritt 3.3.8 HINWEIS) mit Rocki ergänzt.
    10. Fügen Sie einen bestimmten Volumen der Zellsuspension, die erforderliche Anzahl von Zellen in jeder Schablone enthält, und lassen Sie die Petrischale in der Haube ungestört für 5 Minuten bei Raumtemperatur Zellen absetzen zu lassen.
    11. Übertragen Sie die Petrischale in Inkubator und Inkubation für 1 Stunde für die Zellbindung zu ermöglichen. Achten Sie auf die Petrischale Ebene während der zu haltenTransfer-Prozess, so dass die Zellen als Monoschicht in der Schablone bleiben.
  4. Stencil Entfernung und Passivierung von nicht gemusterten Substrat
    1. Untersuchen Sie die Petrischale unter einem Mikroskop zu überprüfen, ob Zellen richtig auf das darunter liegende Substrat befestigt sind.
    2. Absaugen weg von der Schablone Zellsuspension.
    3. 2 ml / Schale von 0,5% der Zellkultur kompatibel nichtionisches Tensid in DMEM / F12 zur Fläche der Schablone umgibt.
    4. Verwenden Sie ein Paar autoklaviert Zange vorsichtig auf die Schablone abziehen. Swirl das nichtionische Tensid-Lösung um, als die Schablone abgezogen wird, die Zellen zu verhindern, vor dem Austrocknen. Optisch beachten Sie die Mikromuster-Zellen in der Petrischale.
    5. Inkubieren der Mikromuster-Zellen in 0,5% nicht-ionisches Tensid-DMEM / F12-Lösung für 10 min bei 37 ° C.
    6. Absaugen entfernt das nichtionische Tensid-DMEM / F12-Lösung. Waschen Sie 3-mal mit 2 ml / Schale DMEM / F12.
    7. 2 ml / Schale von hESCErhaltungsmedium mit Rocki ergänzt und über Nacht bei 37 ° C inkubiert.
    8. Nach Inkubation über Nacht mit Rocki ergänzt Erhaltungsmedium absaugen hESC, waschen Sie einmal mit DMEM / F12 und mesoendoderm Differenzierung induzieren durch Zugabe von 2 ml / Schale von Differenzierungsmedium, ergänzt mit 100 ng / ml Activin, 25 ng / ml BMP-4 und 10 ng / ml FGF2 .
    9. Bewerten Sie die Mikrophasenkontrast - Bildgebung und die durchschnittlichen Brachyurie (T) Intensitätsprofile für jedes Muster berechnen , wie zuvor 8 beschrieben.

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Ergebnisse

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In diesem Papier beschreiben wir die Herstellung einer Zelle Schablone durch einen Laserschneider 1000 um Merkmale zu erzeugen. Die Schablone wurde aus 2 Teilen: einem dünnen Blech Schablonieren (ungefähr 100-200 & mgr; m dick), enthaltend die Mikrodurchgangslöchern und einem PDMS Dichtung die ECM Beschichtungslösung oder Zellsuspension zu enthalten. Hier, 127 & mgr; m und 2 mm dicken handelsüblichen PDMS Bleche wurden als Schablonieren Folie und Dichtung verwendet wurden. Andere...

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Diskussion

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Die Herstellung von Mikro Schablonen

Stencil Mikrostrukturierung ist eine ideale Methode HPSC Mikro zur Untersuchung Nische vermittelte Differenzierung Strukturierung zu erzeugen. Der entscheidende Vorteil der Schablonenmuster über andere Mikrostrukturierungstechniken, wie Mikrokontaktdrucken und Photostrukturierungs, ist, dass sie nicht die Oberflächenmodifikation erforderlich ist und kann auf herkömmliche TCPS Substraten implementiert werden. Daher optimiert Kultu...

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Danksagungen

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Start up Zuschuss (R-397-000-192-133) und ETPL Gap Fund (R-397-000-198-592) Diese Arbeit wird von NUS unterstützt. GS ist ein NUS Forschungswissenschaftler. Autoren möchte Dr. Jiangwa Xing für ihre technische Unterstützung auf Zelle Mikro danken.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
  2 mm dicke PDMS-PlatteSpecialty Silicone Products Inc., USASSPM823-.005Wird verwendet, um ein Reservoir für die Schablone
120-150 μ zu bilden m dicke PDMS-PlatteSpezialsilikonprodukte Inc., USASSPM823-.040Wird zum Formen von Schablonen verwendet 
60 mm PetrischaleNunc Nunclon Delta150326Substrat für die Mikrostrukturierung
Accutase Accutase, Merck Millipore, SingapurSCR005Enzym zur Zerlegung von H9-Zellen in Einzelzellen
Activin   Forschung & Forschung D Systems, Singapur338-AC-010Wachstumsfaktor für die H9-Differenzierung
BMP4 Forschung & Forschung D Systems, Singapur338-BP-010Wachstumsfaktor für die H9-Differenzierung
Plasmasystem Femto Science, KoreaCUTE-MPFür die Plasmaoxidation von Schablonendispase
StemCell™ Technologies, Singapur7923Enzym zur Schwächung der Zell-ECM-Adhäsion während der Passage
DMEM/F12GIBCO, USA11330032Basalmedium für H9-Zellen
FGF2R& D Systems, Singapur233– FB– 025Wachstumsfaktor für die H9-Differenzierung
H9-ZelllinieWiCell Research Institute, Inc., USAWA09Humane embryonale Stammzellen
hESC-qualifizierte Basalmembran-MatrixMatrigel, BD Biosciences, Singapur354277Extrazelluläre Matrixbeschichtung zur Unterstützung des Wachstums von H9-Zellen
Inverses MikroskopLeica Microsystems, SingapurDMi1Zur Erfassung von Hellfeldern Bilder
LaserschneiderEpilog Helix 24 LasersystemWird zur Erzeugung von Durchgangslöchern in PDMS-Blechen
verwendet mTeSR™ 1 mittel StemCell & Handel; Technologies, Singapur5850Erhaltungsmedium für H9-Zellen
PDMS SYLGARD® 184, Dow Corning Co., USA3097358-1004Wird zum Aufkleben der PDMS-Schablone und des Reserviors
verwendet ROCKi Y27632Calbiochem, Merck Millipore, Singapur688000Pflegt H9-Zellen als Einzelzellen 
STEMdiff&handel; APEL™ mittel StemCell & Handel; Technologies, Singapore5210Differenzierungsmedium für H9-Zellen
Polyethylenterephthalat-FilmSureMark SingaporeSQ-6633Wird zum Formen von Schablonen verwendet;
Zellkulturkompatibles nichtionisches TensidPluronsäure F-127, Sigma, SingapurP2443Passivierendes Reagenz zur Abwehr der Zelladhäsion in nicht mikrostrukturierten Substraten

Referenzen

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