Tissue Engineering von Intrinsic Vaskularisation in ein In Vivo Tissue Engineering Chamber

Zusammenfassung

Dies ist eine Richtlinie für die Konstruktion von in vivo vaskularisiertem Gewebe unter Verwendung einer mikrochirurgischen arteriovenösen Schleife oder einer Durchfluss-Pedikel-Konfiguration in einer Tissue-Engineering-Kammer. Die erzeugten vaskularisierten Gewebe können für die Organregeneration und den Ersatz von Gewebedefekten sowie für Arzneimitteltests und Krankheitsmodellierung verwendet werden.

Zusammenfassung

In der rekonstruktiven Chirurgie gibt es einen klinischen Bedarf nach einer Alternative zu den derzeitigen Methoden der autologe Rekonstruktion, die komplex, teuer und Handel ein Defekt für einen anderen. Tissue Engineering hält das Versprechen dieser steigenden Nachfrage zu begegnen. Allerdings scheitern die meisten Tissue-Engineering-Strategien stabile und funktionelle Gewebeersatz zu erzeugen, wegen der schlechten Vaskularisierung. Dieses Dokument konzentriert sich auf ein in vivo Tissue Engineering Kammer Modell intrinsischen Vaskularisierung wo eine perfundiert Arterie und eine Vene entweder als arteriovenöse Schleife oder einer Durchfluss Pedikel Konfiguration innerhalb einer geschützten Hohlkammer gerichtet ist. In dieser Kammer-basierten System tritt angiogenen Sprießen von den arteriovenöse Gefäße und dieses System zieht ischämischen und entzündlichen endogene Zellmigration angetrieben, die den Kammerraum mit Fibro-Gefäßgewebe allmählich füllt. Exogene Zell / Matrix-Implantation bei der Kammerkonstruktion verbessert Zelle surVival und bestimmt die Spezifität der engineered Gewebe, die zu entwickeln. Unsere Studien haben gezeigt, dass diese Kammer Modell erfolgreich verschiedene Gewebe wie Fett, Herzmuskel, Leber und andere erzeugen kann. Allerdings sind Änderungen und Verbesserungen erforderlich Zielgewebe, um sicherzustellen, Bildung konsistent und reproduzierbar ist. Dieser Artikel beschreibt ein standardisiertes Protokoll für die Herstellung von zwei verschiedenen vaskularisierten Gewebetechnik Kammer Modelle in vivo.

Einleitung

Die Herstellung von funktionellen bluteten Gewebe ein Tissue - Engineering - Ansatz ist eine neue Paradigma in der regenerativen Medizin. ^1,2 Viele Ansätze zu konstruieren neue und gesunde Gewebe für den Ersatz von verletztem Gewebe oder defekte Organe entwickelt, ^3-6 experimentell in kleinen Tiermodellen mit vielversprechende klinische Potenzial. ^7,8 jedoch Vaskularisierung bleibt eine der großen Herausforderungen für das Tissue Engineering sein Potenzial zu begrenzen Gewebe klinisch relevanter Größe zu wachsen. ⁹

Aktuelle Ansätze Gewebe folgen entweder eine extrinsische Weg zu vaskularisieren wo neue Schiffe von der Empfängergefäßbett wachsen und dringen überall in das implantierte Gewebe konstruiert ¹⁰ oder eine intrinsische Vaskularisierung Weg , wo das Gefäßsystem wächst und dehnt sich im Einklang mit dem neu entstehenden Gewebes. ¹¹ Der extrinsische Ansatz traditionell beinhaltet Seeding Zellen auf ein Gerüstin vitro und das vollständige Konstrukt in das lebende Tier mit der Erwartung , Implantieren , die Nährstoffe, die zuvor von Kulturmedien zugeführt wird , wird aus dem Kreislauf stammen. ^12,13 Das Konzept vereinfachend als vaskuläre Einwachsen zu langsam und nur sehr dünne Implantate (< 1-2 mm dick) wird lebensfähig bleiben. Bereitstellung von Nährstoffen und Sauerstoff durch eine schnelle und ausreichende Vaskularisierung im Herzen eines jeden erfolgreichen Versuche ist komplexer und größer Tissue-Engineering - Ersatzstoffe wie Knochen, Muskeln, Fett und soliden Organen zu wachsen. ^14,15 Intrinsic Vaskularisierung bietet das Potenzial für größere Konstrukte durch progressive Gewebewachstum, die seinem wachsenden Blutversorgung zu entwickeln. Ein Design ist die in vivo - Implantation in eine Kammer eines Gefäßstiel mit oder ohne einer Zelle seeded Gerüst. ^5,6 dies der Weg zu neuen Verfahren zur Erzeugung von dickeren intrinsisch vaskularisierten Geweben geebnet. ^16,17

vorab vaskularisieren Gewebetransplantate, vor der Implantation in jüngster Zeit wurden Strategien entwickelt. Diese integriert Blutgefäßnetze zielen darauf ab , mit dem Host - Schiffen bei der Implantation zu inosculate so dass für die schnelle Bereitstellung einer vollständigen Blutversorgung das Überleben aller Teile eines transplantierten dicken Gewebetransplantats zu verbessern. ¹⁸

Wir waren die ersten in vivo eine gefäß Tissue Engineering Modell in Kleintiere , die eine subkutan implantierte halbstarre geschlossene Kammer , die einen durchbluteten Gefäßstiel und zellhaltigen Biomaterialien umfasst. Die Kammer schafft eine ischämische Umgebung , die von den implantierten Gefäße angiogenen Sprießen stimuliert. ³ Der Gefäßstiel kann entweder eine rekonstruierte arteriovenöse Schleife oder eine intakte Durchfluss Arterie und Vene sein. ^3-6,19 Diese Gefäßstiel Sprossen eine funktionierende und umfassende arterio -capillary-venöse Netzwerk, das sowohl auf Kunst verbindeteriole und venöse endet mit dem Gefäßstiel. ^3,20 Darüber hinaus ist die umgebende hohle Stützkammer schützt die Entwicklung von Gewebe vor potenziell mechanischen Kräften verformt und verlängert die ischämische Antrieb Vaskularisierung zu verbessern. ^3,21,22 Wenn das Schiff pedicle einfach in implantiert normales Gewebe und nicht innerhalb des geschützten Raum der Kammer, hört angiogenen Sprießen entlang der gleichen Zeitachse wie eine normale Wunde und kein neues Gewebe wird um den Stiel akkumulieren. Forscher haben diese in vivo - Konfiguration verwendet dreidimensionalen Funktions vaskularisierten Gewebekonstrukte mit unterstützenden Vaskulatur zu produzieren und klinisch relevanter Größe. ^4,23 Weiteren die gentechnisch vaskularisierten Gewebekonstrukte mit seiner intakten Gefäßstiel kann zur anschließenden Transplantation an der Verletzungsstelle geerntet . Eine klinisch machbar Szenario die Kammer für den Wiederaufbau s ^24,25 im Rahmen der endgültigen Standort erschaffen würdeuch als die Brust. Somit könnte diese de novo Tissue Engineering Ansatz haben klinische Potenzial eine neue Quelle der funktionellen Zielgewebe für die rekonstruktive Chirurgie bereitzustellen. ^26-28

Das folgende Protokoll wird eine allgemeine Anleitung geben einen in vivo vaskularisierten Gewebetechnik Kammer in der Ratte zu konstruieren, die in verschiedenen Tiermodellen und eingesetzt angepasst werden, um die komplizierten Prozesse der Angiogenese, der Matrixproduktion und zelluläre Migration und Differenzierung zu untersuchen.

Protokoll

Die Protokolle hier beschrieben wurden von der Tierethikkommission von St. Vincent Hospital Melbourne, Australien, genehmigt und wurden unter strenger Einhaltung der Australian National Health und Medical Research Council-Richtlinien durchgeführt.

HINWEIS: zwei Kammer Protokolle werden unten beschrieben. Die zwei verschiedenen Modelle und ihre spezifischen Kammerkonstruktionen sind in Abbildung 1 dargestellt. Kammer (1) aus Polycarbonat (Kammermodell Ratte arteriovenöse Schleife). Es ist zylindrisch mit einem Innendurchmesser 13 mm und die Höhe 4 mm. Ein Fenster an einer Stelle in der Wand erlaubt den ungehinderten Zugang für den Stiel. Im zweiten Modell (für Ratten - Flow-Through - Stiels Kammer - Modell) wird die Kammer von Polyacryl und ist rechteckig (10 x 8 x 4 mm ³ Innenmaße). Es hat zwei 1,5 mm Öffnungen auf gegenüberliegenden Seiten der Femoralarterie und Vene aufzunehmen, wie sie in die Kammer übertreten.

1. Ratte arteriovenöse Schleifenkammer Modell (Ein Chamber pro Tier)

HINWEIS: Vor der Operation beginnen, stellen Sie sicher, dass alle Instrumente ordnungsgemäß sterilisiert wurden. Ebenso sorgen die übrigen Instrumente auf sterilen Tüchern und sind in einem angemessenen Abstand vom Operationsfeld Kontamination während des Verfahrens zu vermeiden.

1. Vorbereitung der Tiere für Chirurgie
   1. Verwenden Ratten mindestens 250 g für ihre Größe der Schiffe, für die Erstellung der arteriovenöse Schleife wiegen.
   2. Betäuben des Tieres mit 4% Isofluran Einatmen. Erhärten ausreichende Tiefe der Anästhesie durch Teilnahmslosigkeit bis Fuß-Pinch beurteilen. Nach der Anästhesie, halten das Tier ausreichend während des gesamten Verfahrens mit 2% Isofluran betäubt.
   3. Legen Sie das Tier in Rückenlage auf einem wärmenden Kissen und steriler Schmiermittel auf die Augen Austrocknung während der Operation zu verhindern.
   4. Mit einem elektrischen Rasierer, rasieren beide Buhnen und entfernen Sie die Haare mit einem Stück feuchten Gaze.
   5. Bereiten Sie die Operationsstellen mit Chlorhexidin/ 70% Ethanol-Lösung und das Tier mit sterilen Tüchern drapiert. Verwalten einer Einzeldosis von Carprofen (5 mg / kg, subkutan) als Analgetikum.
2. Ernte der Oberschenkelvene Graft
   1. Unter Verwendung eines # 15 Klinge, machen Sie eine 4 cm lange Hautschnitt auf der linken Leiste parallel zum Leistenband. Dies legt den Leistenfettpolster.
   2. Schnitt durch das Fettpolster am Umfang mit einer Schere an den epigastrischen Gefäße es an seinem Gefäßstiel Basis zu verlassen.
   3. Mit Mikro Schere, befreien die duftige Bindegewebe Verwachsungen zwischen Bauchdecke und die zugrunde liegenden Femoralgefäße.
   4. Legen Sie einen Aufroller auf der Bauchdecke und ziehen medial. Dies legt das Leistenband und über die gesamte Länge des Oberschenkelgefäße.
   5. Mit Mikropinzette und einer gebogenen Schere sezieren die epigastrische Vene und zu isolieren, es von seiner umgebenden Fett durch leichtes Ziehen und Schneiden. Diese Ader wirkt als Haltegurt, wenn die Schleife zu konstruieren.
   6. Using Mikropinzette und gebogenen Mikro Schere öffnen Sie die perivaskuläre Hülle die Oberschenkelgefäße und Nerven den ganzen Weg von dem Leistenband zu seiner Gabelung distal der epigastric Zweig enthält.
   7. Mit Mikropinzette, die Oberschenkelvene durch seine adventitia abholen und es vorsichtig aus dem umgebenden Gewebe trennen und begleitende Arterie. Tun Sie dies mit Mikropinzette und gebogenen Rund spitz Mikro Schere durch das Gewebe Auseinanderziehen und Schneiden durch sie.
      HINWEIS: Niemals die ganze Dicke der Venenwand greifen, da dies ein Trauma der Intima verursachen könnten es anfällig für Thrombose zu machen.
   8. Ligat Seitenzweige während der Präparation mit 10/0 Nylonnaht oder gerinnen sie mit einem bipolaren Koagulator gefunden.
   9. Mit der Oberschenkelvene völlig frei, abzubinden seinem proximalen und distalen Ende mit 4/0 Seidenfäden. Achten Sie darauf, eine Vene Graft von mindestens 10 mm Länge zu erhalten und umfassen etwa 0,5 cm Länge des epigastric Zweig als ein Halteseil Haltegurt verwendet werdendie Schleife offen in der Kammer zu halten.
   10. Mit Mikropinzette und gerade Mikro Schere, schneiden Sie die Adventitia von den Enden des Transplantats durch leichtes Ziehen und Schneiden. Dies kann auch später durchgeführt werden, bevor mikrochirurgisches Anastomosen.
   11. Spülen Sie das Venentransplantat mit heparinisierter Kochsalzlösung (10 U / ml Heparin) und lassen Sie es in der Lösung zur Ruhe. Schließen Sie die Wunde Dauerlauf 4/0 Seidennaht plus zwei oder drei zusätzlichen einfachen unterbrochenen Stichen.
3. Erstellung von arteriovenöse Schleife und Implantierung von Kammer
   1. Wiederholen Sie die Schritte 1.2.1 in der exakt gleichen Art und Weise zu 1.2.4 auf der Gegen Glied.
   2. Mit Mikropinzette, sezieren und sowohl die epigastrische Arterie und Vene isolieren die umgebende Fettpolster bilden. Tun Sie dies, indem Sie vorsichtig das Gewebe ziehen weg von den Gefäßen
   3. Mit Mikropinzette, wählen Sie die Oberschenkelarterie durch ihre Adventitia und frei, um es aus den umliegenden Geweben. Tun Sie dies mit Mikropinzette und gebogenen runden zackigen micro Schere durch das Gewebe Auseinanderziehen und Schneiden durch sie. Abzubinden oder gerinnen ihre Seitenäste.
   4. Ligieren der Arteria und Vena femoralis distal der Entstehung der epigastrischen Gefäße mit 4/0 Seidennaht.
   5. Legen Sie eine einzelne Klemme proximal an jedem der Arteria und Vena femoralis. Mit einem scharfen gerade Mikro Schere, machen einen sauberen quer geschnitten in jedem Gefäß distal der Entstehung der epigastric Zweige. Legen Sie einen sterilen Plastik Kontrast Hintergrund unter den Gefäßen.
   6. Spülen Sie die Behälter kräftig mit großzügigen Mengen von heparinisierter Kochsalzlösung, bis das gesamte Blut aus dem Lumen entfernt wird.
   7. Bringen Sie das Venentransplantat in das Operationsfeld und entfernen Sie alle redundanten adventitia aus der Schiffsenden gemäß Schritt 1.2.10, wenn nötig.
   8. Führen Sie beide mikrochirurgisch Anastomosen mit 10/0 Nylonfaden. Anastomosieren das proximale Ende des Venentransplantats die Oberschenkelvene und dem distalen Ende der Oberschenkelarterie. Dies ermöglicht es dem Blut zu fließen fROM mit der arteriellen zur venösen Seite ohne Widerstand von den Ventilen in der Vene Graft.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Oberschenkelgefäße und die Vene Graft-Rest in ihrer natürlichen Position ohne Wendungen.
   9. Prüfen Sie auf Lecks an beiden Anastomosen. Lösen Sie kleine Lecks, die aussehen wie nicht pulsierendem Blut aus der Anastomose kommt, durch ein kleines Stück von Fett auf der Oberseite platziert und sanft für 5-10 min zu komprimieren. Größere pulsierende Lecks, die schnell das gesamte Feld überschwemmen zusätzliche Stiche müssen.
   10. Überprüfen Sie die Durchgängigkeit der arteriovenöse Schleife. Sanfte Verschluss der Arteria femoralis sollte es schrumpfen, während das gleiche in die Oberschenkelvene sollte es anschwellen.
   11. Legen Sie die Basis des Tissue Engineering Kammer unter der arteriovenöse Schleife mit dem letzteren ruht in seiner natürlichen Position ohne Drehungen oder Knicke.
   12. Befestigen Sie den Boden der Kammer zu dem Leistenband und das darunter liegende Muskelfaszie mit 6/0 Nylonnähten.
   13. Setzen Sie den Deckel über dieBasis, so dass die Femoralgefäße die Kammer durch eine Kerbe (Fenster in der Seite der Kammer) eingeben. Wenn Sie den Deckel schließen, stellen Sie sicher, dass es fängt die epigastric Zweige, zwischen der Kammer Boden und Deckel, die wirken als Anbindehaltung die arteriovenöse Schleife in Position zu halten.
   14. Schließen Sie die Wunde Dauerlauf 4/0 Seidennaht plus zwei oder drei zusätzlichen einfachen unterbrochenen Stichen.
   15. Lassen Sie das Tier aus der Narkose auf eine wärmende Unterlage zu erholen.
   16. Nicht das Tier unbeaufsichtigt lassen, bis es genügend Bewusstsein zu halten Brustlage wiedergewonnen hat. Ebenso kehren nicht ein Tier, dass eine Operation für das Unternehmen von anderen Tieren unterzogen wurde, bis sie vollständig erholt. 24 Stunden später, zu verwalten eine weitere Einzeldosis von Carprofen (5 mg / kg, subkutan) als Analgetikum.
   17. Behandeln Sie die Wunde mit topischen antibiotischen Salbe für 5 Tage. Wenn die Wunde geöffnet wird, betäuben das Tier, wie in Schritt 1.1.2 bis 1.1.5 und schließen Sie die Wunde wie in 1.3.14. Überwachen Sie die Gesundheit von Tier täglich. Euthanize das Tier eine tödliche Dosis intraperitoneale lethabarb Injektion unter Verwendung von (163 mg / kg in 0,25 ml von 23 G-Nadel), wenn das Tier mehr als eine moderate Anzeichen von inacitivity zeigt, Appetitlosigkeit, Gewichtsverlust und Verlust der Farbe.

2. Durchfluss Pedicle Kammer (zwei Kammern pro Tier)

1. Vorbereitung der Tiere für Chirurgie
   1. Wiederholen Sie die Schritte 1.1.1 bis 1.1.4. Zwei Kammern in beide Leistenbereiche eines einzelnen Ratte implantiert werden.
2. Isolierung von Femoralgefäße und Insertion der Kammer
   1. Wiederholen Sie die Schritte 1.2.1 bis 1.2.8.
   2. Mit beiden Arterie und Vene vollständig befreit Gewebe umgibt, und ihre Äste ligiert, bringen die Kammer in das Operationsfeld.
   3. Platzieren Sie jede der intakten Femoralgefäße auf den entsprechenden Schlitz des Kammerbodens sicherstellen, dass es keine Drehungen oder Knicke.
   4. Schließen Sie die Kammer von attaching des Deckels an der Basis. Schließen Sie die Wunde mit Dauerlauf 4/0 Seidennaht plus zwei oder drei zusätzliche einfache unterbrochene Stiche und lassen Sie das Tier, wie zuvor beschrieben zu erholen.

3. Ernte der Kammern und Gewebeverarbeitung

1. Sobald die Zeitpunkte Experiment (4-6 Wochen nach der Implantation) erreicht sind, betäuben das Tier, wie in Schritt 1.1.2 und 1.1.3 Schritte durch 1.1.5 wiederholen.
2. Öffnen Sie die Wunde einer # 15 Klinge und schneiden durch die Gewebe mit einer Schere, bis die Kammer vollständig ausgesetzt ist.
3. Setzen Sie die Femoralgefäße proximal zu dem Konstrukt und Test für die Gefäßdurchgängigkeit: sanft, das Schiff mit zwei microforceps verschließen, dann melken das Blut in eine distale Richtung und lassen schließlich die proximalen Zange. Wenn das Schiff wieder mit Blut füllt, bestätigt dies die Durchgängigkeit. Ligieren die Oberschenkelgefäße proximal in dem Fall der arteriovenöse Schleife und sowohl proximal und distal in dem Fall the Flow-Through - Konfiguration, und entfernen Sie en bloc die Kammern mit dem haltigen Gewebe.
4. Am Ende des Experiments euthanize das Tier eine tödliche Dosis intraperitoneal lethobarb Injektion unter Verwendung von (163 mg / kg in 0,25 ml von 23 G Nadel).
5. Fix Gewebe in 4% Paraformaldehyd bei Raumtemperatur für 24 Std. Teilen Sie Gewebe in mehrere Querschnitte (1-2 mm dick) und in Paraffinwachs oder optimale Schnitttemperatur Verbindung für Paraffinschnitte (5 & mgr; m) oder Gefrierschnitten (10 & mgr; m) einzubetten sind. ^{3,4,8,17,22, 24}
6. Eine regelmäßige histologischen Färbung wie Hämatoxylin und Eosin die allgemeine Morphologie der Gewebe zu untersuchen. Führen Sie immunhistochemischen Färbung mit spezifischen Antikörper Zelltyp von Interesse zu identifizieren, ^{3,4,8,17,22,24,29} zum Beispiel kardiales Troponin T - Immunfärbung für Kardiomyozyten.

Ergebnisse

Die mikro Schaffung von Tissue-Engineering-Kammern wurde in dem Protokoll, wie oben beschrieben, durchgeführt. Die Gewebe innerhalb der Kammern erzeugt wird, kann in Protokollschritt 3. Verschiedene Gewebetypen erfolgreich unter Verwendung der in - vivo - gefäßKammer entwickelt wurden histologisch als beschreiben untersucht werden (Abbildung 2). Diese schließen Herzgewebe mit neonatalen Cardiomyocyten der Ratte (2A), Muskelgewebe mit Ra...

Diskussion

Technik der Mikrozirkulation wird derzeit im Wesentlichen durch zwei Ansätze untersucht. Die erste umfasst innerhalb des Konstrukts in vitro eine hoch vernetzte vaskuläre Netzwerk entwickeln , so dass , wenn es implantiert, Kapillaren vom Host Gefäßbett mit denen das durch einen Prozess namens inosculation konstruieren transplantierten verbinden, wodurch die Lieferung von Nährstoffen nicht nur an die Peripherie zu gewährleisten , aber auch auf den Kern. ^21,32,33 Dies wird pre-Vaskularisierung genannt...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1 15 Klingen Skalpell	Braun	BB515
1 Zahnzange	Braun	BD527R
1 Nadelhalter	Braun	BM201R
1 Bipolarer Koagulator	Braun	US335
1 Micro Nadelhalter B-15-8.3	S & T	00763
1 Mikrodilatatorzange D-5a.2	S & T	00125
1 Micro Jeweler's Pinzette JF-5	S & T	00108
1 Mikroschere - Gerade SAS-11	S & T	00098
1 Mikroschere - Gebogen SDC-11	S & T	00090
2 Einzelspanner B-3	S & T	00400
2 10/0 Nylon-Naht	S & T	03199
1 6/0 Nylon-Naht	Braun	G2095469
2 4/0 Seidennähte	Braun	C0760145
Xilocain 1%	Behandelt	150733	10 mg/ml
Heparin-Natrium	Behandelt	272301	5.000 I.E./ml
Ringer Lactate	Baxter	JB2323	500 ml
1 kuppelförmiges Tissue Engineering Kammer	nach Maß
1 Durchflusskammer	nach Maß
Lectin I, Griffonia Simplicifolia	Vector Laboratorien	B-1105	1,67 μ g/ml
Troponin T Antikörper	Abcam	Ab8295	4 μ g/ml
Humanspezifischer Ku80-Antikörper	Abcam	Ab80592	0,06 μm g/ml
Desmin Antikörper	Dako	M0760	2,55 μ g/ml
Cell Tracker CM-DiI-Farbstoff	Thermo Fisher Scientific	C-7000	3 mg/106 Zellen
Lethabarber (Natriumpentobarbiton)	Virbac Animal Health	LETHA450	325 mg/ml
Wärmekissen flexibel	Redzone Heizung	RZ/Mittel