Methodenartikel

Abgabe von therapeutischen siRNA an das ZNS mit kationischen und anionische Liposome

DOI:

10.3791/54106

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23. Juli 2016

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1Department of Microbiology, Immunology, and Pathology, College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, Colorado State University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Das Ziel dieses Protokolls ist es, kationische/anionische Liposomen mit einem Neuro-Targeting-Peptid als ZNS-Verabreichungssystem zu verwenden, damit siRNA die BHS passieren kann. Die Optimierung eines Verabreichungssystems für Behandlungen wie siRNA würde mehr Behandlungsoptionen für Prionen und andere neurodegenerative Erkrankungen ermöglichen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prionenkrankheiten resultieren aus der Fehlfaltung des normalen, zellulären Prionenproteins (PrPC) zu einem abnormalen Protease-resistentenIsomer namens PrP Res. Das Auftreten von Prionenkrankheiten in Wildtierpopulationen und ihre zunehmende Bedrohung für die menschliche Gesundheit haben zu verstärkten Bemühungen geführt, eine Behandlung für diese Krankheiten zu finden. Jüngste Studien haben zahlreiche Anti-Prionen-Verbindungen gefunden, die entweder das infektiöse PrP-Res-Isomer hemmen oder das normale zelluläre Prionenprotein herunterregulieren können. Die meisten dieser Verbindungen überwinden jedoch nicht die Blut-Hirn-Schranke, um die PrP-Res-Bildung im Hirngewebe wirksam zu hemmen, zielen nicht spezifisch auf neuronales PrPC ab und sind oft zu giftig, um sie bei Tieren oder Menschen zu verwenden.

Wir untersuchten, ob siRNA, die intravaskulär verabreicht wird und auf neuronales PrPC abzielt, eine sicherere und wirksamere Anti-Prionen-Verbindung ist. In diesem Bericht wird ein Protokoll zur Herstellung von zwei liposomalen siRNA-Verabreichungsvehikeln sowie zur Verpackung und Abgabe von PrP-siRNA an neuronale Zellen beschrieben. Die beiden liposomalen Verabreichungsvehikel sind 1) eine komplexierte siRNA-Liposomenformulierung unter Verwendung von kationischen Liposomen (LSPCs) und 2) eine verkapselte siRNA-Liposomenformulierung unter Verwendung von kationischen oder anionischen Liposomen (PALETS). Für die LSPCs wird negativ geladene siRNA elektrostatisch an das kationische Liposom gebunden. Dem Komplex wird ein positiv geladenes Peptid (RVG-9r [Tollwutvirus-Glykoprotein]) zugesetzt, das spezifisch auf die Liposomen-siRNA-Peptid-Komplexe (LSPCs) über die Blut-Hirn-Schranke (BHS) bis hin zu den Acetylcholin-exprimierenden Neuronen im Zentralnervensystem (ZNS) abzielt. Für die PALETS (peptide addressed liposome encapsulated therapeutic siRNA) wurden die kationischen und anionischen Lipide durch die PrP siRNA rehydriert. Dieses Verfahren führt zu einer Verkapselung der siRNA innerhalb der kationischen oder anionischen Liposomen. Auch hier wurde das RVG-9r-Neuropeptid an die Liposomen gebunden, um die siRNA/Liposomen-Komplexe an das ZNS zu leiten. Unter Verwendung dieser Formulierungen haben wir erfolgreich PrP-siRNA an AchR-exprimierende Neuronen abgegeben und diePrP-C-Expression von Neuronen im ZNS verringert.

Einleitung

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Prionen sind schwere neurodegenerative Erkrankungen, die das ZNS beeinflussen. Prionenkrankheiten ergeben sich aus der Fehlfaltung des normalen zellulären Prionproteins PrP C, durch einen infektiösen Isomer genannt PrP Res. Diese Krankheiten betreffen eine Vielzahl von Arten , einschließlich der bovinen spongiformen Enzephalopathie bei Rindern, Scrapie bei Schafen, Chronic Wasting Disease bei Hirschartigen, und der Creutzfeldt-Jakob - Krankheit beim Menschen 1-3. Prionen verursachen Neurodegeneration, die mit synaptischen Verlust beginnt, und zu Vakuolisation fortschreitet, Gliose, Neuronenverlust und Plaque-Ablagerungen. Schließlich, was zum Tod des Tieres / Einzel - 4. Seit Jahrzehnten haben Forscher untersuchten Verbindungen gemeint, zu verlangsamen oder das Fortschreiten der Prionenerkrankung stoppen. Allerdings haben die Forscher nicht entweder eine erfolgreiche Therapie oder eine wirksame systemische Abgabe Fahrzeug gefunden.

Endogenes PrP C Expression für die Entwicklung von Prionenkrankheiten notwendigen 5 . Daher Verringern oder Eliminieren PrP C - Expression in einer Verzögerung oder Linderung von Krankheiten führen kann. Mehrere Gruppen erstellt transgene Mäuse mit reduzierten Mengen an PrP C oder injiziert lentivectors shRNA direkt in murine Hirngewebe exprimiert die Rolle von PrP C - Expressionsniveaus in Prion - Krankheit zu untersuchen. Diese Forscher Verringerung der Menge an neuronaler PrP C gefunden führte die progressive neuropathology von Prion - Erkrankungen in Anhalten und verlängert die Lebensdauer der Tiere 6-9. Wir haben in der Clearance von PrP Res in Maus - Neuroblastomzellen 10 , dass PrP C siRNA Behandlungsergebnisse berichtet. Diese Studien legen nahe , dass die Verwendung von Therapien PrP C Expressionsniveaus, wie small interfering RNA (siRNA), die spaltet mRNA, ausreichend verzögert das Fortschreiten der Prion - Krankheiten können zu verringern. Allerdings sind die meisten Therapien für Prionenerkrankungen untersucht wurden in einer Weise geliefert, die nicht praktikabel wärein einer klinischen Umgebung. Daher muss ein siRNA-Therapie eine systemische Verabreichungssystem, das an das ZNS intravenös und gezielte geliefert wird.

Die Ermittler haben die Verwendung von Liposomen als Abgabevehikel für die Gentherapie Produkte untersucht. Kationische und anionische Lipide zur Bildung von Liposomen verwendet beides. Kationische Lipide sind weiter verbreitet als anionische Lipide verwendet, weil die Ladungsdifferenz zwischen dem kationischen Lipid und DNA / RNA für eine effiziente Verpackung ermöglicht. Ein weiterer Vorteil von kationischen Lipiden ist , dass sie die Zellmembran leichter als andere Lipide 11-14 kreuzen. Jedoch kationische Lipide sind immunogener als anionische Lipide 13,14. Daher haben begonnen Forscher unter Verwendung von kationischen zu verschieben Lipiden in Liposomen anionische. Die Gentherapie Produkte effizient in anionische Liposomen verpackt werden , um die positiv geladenen Peptid Protaminsulfat verwendet, die DNA kondensiert / RNA - Moleküle 15-19. Da anionische lipids sind weniger immunogen als kationische Lipide sie Zirkulationszeiten zugenommen haben kann, und kann in Tiermodellen 13,14 toleriert werden. Liposome werden auf spezifische Gewebe gezielt Peptide unter Verwendung von Targeting, die an die Liposomen gebunden sind. Die RVG-9R Neuropeptid, das an nikotinische Acetylcholin - Rezeptoren bindet, wurde verwendet, siRNA und Liposomen an das ZNS 17-20 abzuzielen.

Dieser Bericht beschreibt ein Protokoll drei siRNA Fahrzeuge zu produzieren und zu verpacken und die siRNA zu neuronalen Zellen (Abbildung 1) zu liefern. Liposom-siRNA-Peptid-Komplexe (LSPCs) bestehen aus Liposomen mit siRNA und die RVG-9R Peptid elektrostatisch an der äußeren Oberfläche des Liposoms Targeting. Peptid gerichtet Liposomen therapeutische siRNA (PALETS) eingekapselt sind, bestehend aus siRNA und Protamin im Liposom verkapselt, mit RVG-9R zu Lipid PEG-Gruppen kovalent gebunden sind. die folgenden Methoden verwenden LSPCs und PALET zu erzeugenS, PrP C siRNA verringert PrP C Ausdruck zu 90% in neuronalen Zellen auf, die enorme Versprechen hält das Auftreten von Prion - Krankheit Pathologie zu heilen oder erheblich verzögern.

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Protokoll

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Alle Mäuse wurden in Labortier Ressourcen gezüchtet und gepflegt, von der Association akkreditiert für Evaluierung und Akkreditierung von Lab Animal Care International, in Übereinstimmung mit den Protokollen von der Institutional Animal Care und Use Committee an der Colorado State University genehmigt.

1. Herstellung von LSPCs

  1. Verwenden Sie ein 1: 1 DOTAP (1,2-Dioleoyl-3-Trimethylammonium-Propan): Cholesterin-Verhältnis für LSPCs. Für ein 4 nmol Liposom-Zubereitung, Mischung 2 nmol DOTAP und 2 nmol von Cholesterin in 10 ml eines 1: 1 Chloroform: Methanol-Lösung in einem Kolben.
  2. Verdunsten 9 ml Chloroform: Methanol - Lösung unter Verwendung von N 2 -Gas in einer Abzugshaube. Dampft die letzten 1 ml Lösungsmittel in einem Abzug über Nacht ohne Gas. Beobachten eines dünnen Lipidfilm auf dem Boden des Kolbens.
  3. Wärme 10 ml einer 10% Saccharose-Lösung auf 55 ° C.
  4. Gießen Sie die erhitzte 10% Saccharose - Lösung auf die dünne Lipidfilm langsam, dh 1 ml / min, während gently Schwenken des Kolbens. Aufrechterhaltung der 10% Sucrose und Kolben mit Lipiden bei 55 ° C so, dass die Lipidmoleküle in dem Gel-Flüssigkeits-Phase verbleiben. Rehydrierung Ergebnisse in multilamellare Vesikel (MLV) Bildung.
  5. Erlauben Lipide für mindestens eine Stunde bei 55 ° C rehydriert, bevor die Liposomen Größen.
  6. Montieren eines Extruders den Anweisungen des Herstellers mit 1,0 & mgr; m-Filter oder verwenden 1,0 um Spritzenfilter für die Dimensionierung.
  7. 1 ml der erwärmten Liposomensuspension auf eine der Spritzen auf den Extruder, und passieren die Suspension zwischen den zwei Spritzen 11 mal. Stellen Sie sicher, dass die Suspension in die entgegengesetzte Spritze ist als die Ausgangs Spritze nach den 11 verläuft.
  8. Größe die Liposomen wieder durch 0,45 um dann 0,2 um Filter große unilamellare Vesikel (LUV) zu erzeugen. Halten Sie die Liposomensuspension zur einfacheren Dimensionierung erwärmt.
  9. Inkubiere 20 ul des 4 nmol Liposom-Suspension (200 & mgr; M) mit 200 & mgr; l einer 20 & mgr; M (4nmol gesamt) Lager siRNA-Lösung für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
  10. Inkubiere 80 ul einer 500 uM (40 nmol Gesamt) stock RVG-9R-Lösung mit der siRNA / Liposom-Lösung für 10 min bei RT. LSPCs sollte so bald wie möglich verwendet werden, sondern kann bis zu mehreren Stunden nach der Herstellung verwendet werden. Store LSPCs bei 4 ° C für mehrere Stunden nach der Zubereitung.

2. Herstellung von PALETS

  1. Verwenden, um eine 55: 40: 5 Molverhältnis von entweder DSPE (1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin): Cholesterin: DSPE-PEG oder DOTAP: Cholesterin: DSPE-PEG für PALETS. Für ein 4 nmol Liposom-Zubereitung, Mischung 2,2 nmol entweder DSPE oder DOTAP, 1,6 nMol von Cholesterin und 0,2 nmol von DSPE-PEG in 10 ml eines 2: 1 Chloroform: Methanol-Lösung in einem Kolben.
  2. Bereiten Sie Liposomensuspension genau wie in Schritt 1.1 und 1.2 oben beschrieben. Rehydrieren DSPE-Liposomen in 10 ml 1x PBS erhitzt auf 75ºC, Zugabe von 1 ml / min. Erlauben Lipiden bei 75 ° C rehydriert zuminmindestens 1 Stunde vor dem Kalibrieren.
  3. Größe der Liposomensuspension genau wie in Schritt 1.6-1.8 beschrieben.
  4. Pipettieren 20 ul jeder der 4 nmol (200 uM) Liposomensuspensionen in einzelne Aliquots nach DOTAP und DSPE Liposomen Größe gewesen, und für 30 min lyophilisieren ein Benchtop - Gefriertrockner (Abbildung 2).
  5. Inkubieren 200 ul einer 20 uM (4 nmol Gesamt) stock siRNA-Lösung mit 1,4 ul einer 26,6 & mgr; M Lösung von Protaminsulfat für 10 min bei RT für siRNA, die in DSPE PALETS Liposomen verkapselt werden soll.
  6. Rehydratisieren die DOTAP PALETS Liposomen mit 200 ul einer 4 nmol Stammlösung von siRNA oder DSPE PALETS Liposomen mit 201,4 & mgr; l der siRNA / Protamin Lösung rehydratisiert. Inkubieren Liposom / siRNA-Lösung für 10 min bei RT.
  7. Werden 10 ul einer 60 mM 1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimidhydrochlorid (EDC) Lösung der Liposomen / siRNA Lösung sowohl DOTAP und DSPE PALETS.
  8. Werden 10 ul einer 150 mM N-Hydroxysulfosuccinimid (sulfo-NHS) Lösung der Liposomen / siRNA Lösung sowohl DOTAP und DSPE PALETS.
  9. Inkubieren des EDC und sulfo-NHS mit der siRNA / Liposomen-Suspension für 2 h bei RT.
  10. Inkubiere 80 ul einer 500 uM (40 nmol Gesamt) stock RVG-9R-Lösung mit der siRNA / Liposom-Vernetzungslösung für 10 min bei RT.
    HINWEIS: Die EDC / Sulfo-NHS die RVG-9R zu kovalent an die PEG-Lipide ermöglicht. Verwenden Sie PALETS innerhalb von mehreren Stunden nach der Vorbereitung. Store PALETS bei 4 ° C für mehrere Stunden nach der Zubereitung.
  11. Um siRNA Verkapselungswirksamkeit von PALETS bestimmen:
    1. Messen der Konzentration von siRNA vor und nach der Zugabe von Protamin und Liposomen unter Verwendung eines Spektrophotometers bei 260 nm eingestellt.
    2. Filtern Sie die nicht eingekapselten siRNA aus dem Liposom / verkapselt siRNA Suspension mit 50 kDa Zentrifugalfilter. Zentrifuge bei 1000 × g für 20 min.
    3. Messen der Konzentration vonunverkapselte siRNA im Filtrat und der Konzentration an verkapseltem siRNA im Retentat eines Spektrophotometers bei 260 nm verwendet wird.

3. Injizierender Mäuse mit LSPCs oder PALETS

  1. Expose Mäuse für 5-10 min einer Wärmelampe Gefäß aufzuweiten.
  2. Anesthetize Maus mit einem 2-3% Isofluran / Sauerstoff fließen 5-10 min vor der Injektion und während der Injektion. Bestätigen anesthetization wenn Tier ist nicht mehr ambulanter und Respiration verlangsamt haben durch eine Zehe Prise zu tun. Platzieren Sie die Maus auf dem Rücken oder der Seite, um die Schwanzvene zugreifen. Verwenden Sie vet Salbe auf die Augen der Maus Austrocknen zu verhindern, während sie unter Narkose.
  3. Wischen / Spray den Schwanz mit 70% EtOH und injizieren 300 ul LSPCs oder PALETS auf die Schwanzvene der Maus eine 26 G Insulin-Spritze. Beginnen Sie distal in die Schwanzvene Injektion und proximal zu bewegen, wenn die Vene oder Brüche zusammenbricht.
  4. Bewegen Sie die Maus in einem sauberen Käfig, bis sie Brustlage beibehält. Stellen Sie keine moverwenden, um mit anderen Käfiggenossen, bis sie vollständig erholt hat. Die Mäuse sollten in 5 bis 15 min zu erholen. Sie können auf einem Heizkissen oder unter einer Heizlampe angeordnet werden Körpertemperatur zu halten, wenn Erholung länger braucht. Die Mäuse sollten genau überwacht werden, um Schutz vor Überhitzung.
  5. Überwachen Sie die Tier mehrere Stunden nach der Injektion, um sicherzustellen, Anästhesie nachlässt, und es gibt keine negativen Auswirkungen der Behandlung. Lassen Sie die LSPCs oder PALETS für mindestens 24 Stunden zirkulieren zu lassen.

4. Analyse der Proteinexpression über Durchflusszytometrie

  1. Euthanize Mäuse mit einer 20% CO 2 Durchflussrate für 15 min.
  2. Präparieren aus einem halben Hemisphäre des Gehirns durch Schneiden der Haut und Schädel der Maus mit einer Schere entfernt. Peel weg halben Hemisphäre des Gehirns aus dem Schädel entfernt Zangen oder das Ende einer Schere.
  3. Press halben Hemisphäre des Gehirns von jeder Maus durch ein 40 & mgr; m mesh Zellsieb 2,5 ml FACS Puffer (1x; PBS, 1% fötalem Rinderserum, 10 mM EDTA) in einer Petrischale mit dem Kolben einer Spritze.
  4. Spülen Sie die Zelle Sieb und Petrischale mit einem zusätzlichen 2,5 ml FACS-Puffer. Legen Sie die Einzelzellsuspension in einem 15 ml konischen Röhrchen auf Eis.
  5. Jeweils 100 ul der 5 ml Einzelzellsuspension in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugiere für 5 Minuten bei 350 x g. Überstand verwerfen und resuspendieren Zellpellet in 1 ml FACS-Puffer. Spin bei 350 xg für 5 min. Wiederholen Sie mit weiteren 1 ml FACS-Puffer. Halten Sie die Zellsuspension auf Eis.
  6. Inkubieren der Zellen in 100 ul 1: 100-Verdünnung einer 0,5 mg / ml Ratten-anti-Maus-Fc-Block in FACS-Puffer für 30-60 min auf Eis. Pelletieren, und die Zellen wie in Schritt 4.5 waschen. Halten Sie die Zellsuspension auf Eis.
  7. Inkubieren der Zellen in 100 ul einer 20 ug / ml Fluoreszenz - Antikörper gegen Maus - PrP C in 7% Mausserum in FACS - Puffer auf Eis für 30-60 min. Pelletieren, und die Zellen wie in Schritt 4.5 waschen. Halten Sie die Zellsuspensionauf Eis.
  8. Pellet und die Zellen in 1 ml RBC - Lyse - Puffer (1x PBS, 155 mM NH 4 Cl, 12 mM NaHCO 3, 0,1 mM EDTA) für 1 min resuspendieren. Pellet wie in Schritt 4.5 und die Zellen in 1 ml FACS-Puffer resuspendieren. Halten Sie die Zellsuspension auf Eis.
  9. Analysieren PrP C - Ausdruck ein Durchflusszytometer unter Verwendung von wie zuvor 10 beschrieben. Tor lebende Zellen aus Gesamtzellpopulation. Tor PrP C + Zellen von lebenden Zellpopulation MFI (mittlere Fluoreszenzintensität) zu bestimmen.

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Ergebnisse

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Um die Effizienz der siRNA Die Verkapselung in anionischer PALETS erhöhen, wurde die siRNA mit Protamin gemischt. Um die beste Protamin Konzentration für die siRNA bestimmen, wurde die siRNA mit verschiedenen Konzentrationen von Protamin gemischt, von 1: 1 bis 2: 1 (3A). Es gab eine 60-65% siRNA Verkapselungseffizienz in anionischen Liposomen ohne Verwendung von Protamin. Proben mit Protamin: siRNA Molverhältnissen von 1: 1 bis 1,5: 1 (133-266 nM) hatten 80-90% siRNA Ver...

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Diskussion

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Dieser Bericht beschreibt ein Protokoll, das zwei Systeme zur gezielten Verabreichung zu schaffen, die effizient siRNA zum ZNS transportiert. Frühere Verfahren zur enthalten siRNA zum ZNS Liefern Injizieren siRNA / shRNA Vektoren direkt in das Gehirn, intravenöse Injektion von gezielten siRNA oder intravenöse Injektion von nicht-zielgerichteten Liposomen-siRNA-Komplexe. Injektion von siRNA / shRNA Vektoren in das ZNS verursacht eine Abnahme der Zielprotein-Expressionsniveaus. Jedoch die siRNA / shRNA diffundiert nicht f...

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

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Wir möchten uns bei den folgenden Finanzierungsquellen bedanken: dem CSU Infectious Disease Translational Research Training Program (ID:TRTP) und dem NIH Research Grant Program (R01 NS075214-01A1). Wir danken dem Labor Telling für die Verwendung ihres monoklonalen Antikörpers PRC5. Wir möchten uns auch beim Dow-Labor für die DOTAP-Liposomen bedanken und dafür, dass sie ihr Know-how bei der Herstellung von Liposomen mit uns geteilt haben.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
DOTAP LipidAvanti Lipids890890
CholesterinAvanti Lipide700000
DSPEAvanti Lipide850715
DSPE-PEGAvanti Lipide880125
ChloroformFisher ScientificAC268320010
MethanolEMD Millipore113351
N2 GasAirGas
SaccharoseFisher ScientificS5-500
ExtruderAvanti Lipide610023
1,0, 0,4 und 0,2 μ m FilterAvanti Lipids610010, 610007, 610006
PBSLife Technologies70011-044
ProtaminsulfatFisher ScientificICN10275205
EDCThermo Scientific22980Aliquotiert für den Einmalgebrauch
Sulfo-NHSThermo Scientific24510Aliquotiert für den Einmalgebrauch
40 μ m ZellsiebFisher Scientific08-771-1
Ratte Anti-Maus CD16/CD32 Fc-BlockBD Pharmigen553141
Anti-PrP Antikörper (PRC5)Proprietär - PRC

Referenzen

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siRNA Applikationliposomale FormulierungBlut Hirn Schrankekationische LiposomenRVG 9r PeptidPrP siRNAneuronales TargetingDurchflusszytometrieSchwanzveneninjektion

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