Entwicklung eines unter Schwerelosigkeits Vielzellige Dreidimensionale Organotypischen Modell des menschlichen Darmschleimhaut Grown

Summary

Zellen in einem dreidimensionalen (3-D) -Umgebung wachsenden stellen eine deutliche Verbesserung gegenüber der Zellkultivierung in 2-D - Umgebungen (beispielsweise Kolben oder Geschirr). Hier beschreiben wir die Entwicklung eines vielzelligen 3-D organotypischen Modell der menschlichen Schleimhaut Darm unter Schwerelosigkeit kultiviert, die von rotierenden Wandgefäß (RWV) Bioreaktoren.

Abstract

Da die Zellen in einem dreidimensionalen (3-D) Umwelt haben das Potenzial wachsen viele Lücken der Zellkultivierung zu überbrücken , in 2-D - Umgebungen (z. B. Flaschen oder Geschirr). In der Tat ist es allgemein anerkannt, dass in Flaschen oder Geschirr neigen gezüchtete Zellen zu dedifferenzieren und spezielle Funktionen der Gewebe verliert, aus dem sie abgeleitet wurden. Derzeit gibt es im Wesentlichen zwei Arten von 3-D-Kultursysteme, wo die Zellen in Gerüste geimpft werden die native extrazelluläre Matrix (ECM) nachahmt: Bioreaktoren (a) statische Modelle und (b) Modellen. Der erste Durchbruch war die statischen 3-D-Modelle. 3-D-Modelle Bioreaktoren wie der rotierenden Wandgefäß (RWV) Bioreaktoren sind eine neuere Entwicklung verwendet wird. Das ursprüngliche Konzept der RWV Bioreaktoren wurde am NASA Johnson Space Center in den frühen 1990er Jahren entwickelt und wird angenommen, dass die Grenzen der statischen Modelle wie die Entwicklung von hypoxischen, nekrotischen Kerne zu überwinden. Die RWV Bioreaktoren könnten umgehen thist Problem durch Bereitstellung fluid dynamics, die die effiziente Diffusion von Nährstoffen und Sauerstoff erlauben. Diese Bioreaktoren bestehen aus einem Rotator Basis, und drehen Sie zwei verschiedene Formate der Kulturgefäße zur Unterstützung dient , die durch ihre Belüftungsquellentyp unterscheiden: (1) langsames Drehen Lateral Vessels (STLVs) mit einer koaxialen Oxygenator in der Mitte, oder (2 ) Hohe Seitenverhältnis Vessels (HARVs) mit Sauerstoffversorgung über einen flachen, Silikonkautschuk Gasübertragungsmembran. Diese Gefäße ermöglichen eine effiziente Gastransfer während der Blasenbildung und damit Turbulenzen zu vermeiden. Diese Bedingungen führen zu einer laminaren Strömung und minimale Scherkraft, die Modelle der Schwerkraft (Schwerelosigkeit) reduziert im Inneren des Kulturgefäßes. Hier beschreiben wir die Entwicklung eines vielzelligen 3-D organotypischen Modell des menschlichen Darmschleimhaut besteht aus einer intestinalen Epithelzellen Zelllinie und primären humanen Lymphozyten, Endothelzellen und Fibroblasten gezüchtet unter Schwerelosigkeit durch den RWV Bioreaktor zur Verfügung gestellt. </ P>

Introduction

Der erste Durchbruch beim Aufbau eines 3-D - Modell wurde in den frühen der 1980er Jahre berichtet , als die Wissenschaftler verschiedene Arten des Gerüsts (z. B. Laminin, Kollagen Typ I, Kollagen IV und Fibronektin) und Cocktails von Wachstumsfaktoren zu untersuchen begann zu verbessern Zelle-zu-Zelle und ECM - Wechselwirkungen von "statischen" 3-D - Modelle ^1-7. Seitdem hat das Hauptproblem bei diesen Modellen Einschränkungen waren bei der Übertragung von Nährstoffen und Sauerstoff in dem Medium und Gewebekonstrukten ^8. Im Gegensatz zu den Zellen in der in vivo Umgebung , die von umgebenden Netzen von Blutgefäßen einen stetig....

Protocol

Ethik Aussage: Alle Blutproben wurden von Freiwilligen gesammelt , die in der Protokollnummer HP-00040025-1 teilgenommen. Die University of Maryland Institutional Review Board genehmigt dieses Protokoll und ermächtigt, die Sammlung von Blutproben von gesunden Freiwilligen für die Studien in diesem Manuskript enthalten. Der Zweck dieser Studie an Freiwilligen wurde erklärt, und alle Freiwilligen gab informiert unterzeichnete Zustimmung vor Ende der Blutentnahme.

Hinweis: Siehe Tabelle 1 für mittlere Ergänzung Vorbereitung. Siehe Tabelle 2 für die Herstellung der 3-D - Kulturmedien.

1. Vorbereitung der Ku....

Results

Bisher haben wir einen mehrzelligen 3-D organotypischen Modell des menschlichen Darmschleimhaut bestehend aus einer Darmepithel - Zelllinie und primären humanen Lymphozyten, Endothelzellen und Fibroblasten unter Schwerelosigkeit ²⁴ (1) kultiviert entwickelt. Fibroblasten und Endothelzellen wurden in einer Kollagen - Matrix mit zusätzlichen I gut Basalmembranproteine ^​​45 (dh., Laminin, Kollagen IV, Fibronectin und Heparinsulfat - Proteoglyk.......

Discussion

In diesem Manuskript beschreiben wir die Entwicklung eines biotechnologisch - Modell der menschlichen Schleimhaut Darm von Multiples Zelle besteht Typen , einschließlich primären humanen Lymphozyten, Fibroblasten und Endothelzellen, sowie Darmepithel - Zelllinien ^24. In diesem 3-D - Modell werden die Zellen in einem Kollagen-reiche extrazellulären Matrix unter Schwerelosigkeit ²⁴ kultiviert.

Wie bereits beschrieben, sind die wichtigsten Merkmale dieses Modells: .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Quad-Rotator/unabhängiger rotierender Behälter (RWV) Bioreaktor	Synthecon	RCCs-4DQ	Für bis zu 4 Gefäße. Es sind auch Modelle mit mehr oder weniger Gefäßen erhältlich.
Einweg 50 ml-Gefäß	Synthecon	D-405	Box mit 4 Gefäßen
HCT-8 Epithelzellen	ATCC	CCL-244
CCD-18Co Fibroblasten	ATCC	CRL-1459
Endothelzellen der menschlichen Nabelvene	ATCC	CRL-1730	HUVEC
Fibroblasten-Wachstumsfaktor-basisch	Sigma	F0291	bFGF
Stammzellfaktor	Sigma	S7901	SCF
Hepatozyten-Wachstumsfaktor	Sigma	H1404	HGF
Endothelin 3	Sigma	E9137
Laminin		Sigma L2020	Isoliert aus Maus Engelbreth-Holm-Swarm-Tumor
Vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor	Sigma	V7259	VEGF
Leukämie-Hemmfaktor	Santa Cruz	sc-4377	LIF
Adenin		Sigma A2786
Insulin	Sigma	I-6634
3,3',5-trijod-L-thyronin	Sigma	T-6397	T3
Choleratoxin	Sigma	C-8052
Fibronektin	BD	354008	Isoliert aus humanem Plasma
Apo-Transferrin	Sigma	T-1147
Heparin	Sigma	H3149
Heparansulfat  Proteoglykan	Sigma	H4777	Isoliert aus der Basalmembran der Maus  Engelbreth-Holm-Swarm-Tumor
Kollagen IV	Sigma	C5533	Isoliert aus menschlicher Plazenta
Hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum	Invitrogen	10437-028
D-MEM, Pulver	Invitrogen	12800-017
10% Formalin– PBS	Fisher Scientific	SF100-4
Kollagen vom Rind Typ I	Invitrogen	A1064401
Trypsin-EDTA	Fisher Scientific	MT25-052-CI
Natriumpyruvat	Invitrogen	11360-070
Gentamicin	Invitrogen	15750-060
Penicillin/Streptomincin	Invitrogen	15140-122
L-Glutamin	Invitrogen	25030-081
Hepes	Invitrogen	15630-080
Ham's F-12	Invitrogen	11765-054
Basal Medium Eagle	Invitrogen	21010-046	BME
RPMI-1640	Invitrogen	11875-093
Endothel Basalmedium	Lonza	CC-3156	EBM-2
Nahrungsergänzungsmittel für das Wachstum von Endothelzellen	Millipore	02-102	EKGS