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Isolierung von murinen embryonalen Hemogenic Endothelial Cells

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DOI:

10.3791/54150

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17. Juni 2016

 ,  ,  , 
1Departments of Medicine, Genetics and Biomedical Engineering, Yale Cardiovascular Research Center, Vascular Biology and Therapeutics Program, Yale Stem Cell Center, Yale University School of Medicine, 2Department of Pediatrics, Section of Neonatal-Perinatal Medicine, Yale University School of Medicine, 3Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPC) leiten sich von spezialisierten (hemogenic) Endothelzellen während der Entwicklung, noch wenig über das Verfahren bekannt, von denen einige Endothelzellen angeben zu werden Blut bilden. Wir zeigen eine Durchflusszytometrie basierende Methode ermöglicht die gleichzeitige Isolierung von hemogenic Endothelzellen und HSPC aus murinen embryonalen Geweben.

Zusammenfassung

Die Spezifikation von hemogenic Endothelzellen aus embryonalen vaskuläre Endothel tritt bei kurzen Entwicklungszeiten innerhalb verschiedene Gewebe und ist notwendig für die Entstehung der endgültigen HSPC aus dem murinen zusätzliche embryonale Dottersack, der Plazenta, Nabelschnur Gefäße und den embryonalen Aorta-Gonaden-Mesonephros ( AGM) Region. Die transiente Natur und die geringe Größe dieser Zellpopulation macht seine reproduzierbare Isolierung für eine sorgfältige Quantifizierung und experimentelle Anwendungen technisch schwierig. Wir haben eine fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) -basierte Protokoll für die simultane Isolierung von hemogenic Endothelzellen und HSPC etabliert während ihrer Spitzengenerationszeiten in den Dottersack und AGM. Wir zeigen, Methoden für die Präparation von Dottersack und AGM-Gewebe von Maus-Embryonen, und wir präsentieren optimierte Gewebe Verdauung und Antikörperkonjugation Bedingungen für maximale Überleben der Zelle vor der Identifizierung und den Abruf über FACS. Repräsentative FACS anaLyse Plots gezeigt, dass die hemogenic Endothelzellen und HSPC Phänotypen identifizieren und beschreiben eine Methyl basierender Test zur Bewertung ihrer Blutbildungspotential auf einer klonalen Ebene.

Einleitung

Ein Funktionskreislauf-System erfordert die parallele Entwicklung von Blutgefäßen und Blutzellen. Zu den frühesten Stadien der Blut Entwicklung (primitive Hämatopoese), der Ursprung von Erythroblasten bleibt 1 kräftig diskutiert. Im Gegensatz dazu in späteren Stadien der Blutzellentwicklung (definitive Hämatopoese) ist es immer deutlicher, dass HSPC Multi-Linie von spezialisierten vaskulären endothelialen Zellen entstehen, die den Blutbildungspotential (hemogenic Endothelzellen) im Dottersack, der Plazenta zu erwerben, und AGM 2-5, sowie in der Dotter und Nabelschnurgefäßen, die embryonale Endokard 6 und Kopf Gefäß 7. Die Spezifikation von hemogenic Endothelzellen innerhalb dieser unterschiedlichen Geweben tritt in bestimmten Phasen der Entwicklung; zum Beispiel im Dottersack bei ~ E8.25 und in der Hauptversammlung bei ~ E10 8-12. Doch selbst in diesen spezifischen Entwicklungs Fenster, die Bevölkerung von hemogenic endothelial Zellen stellt einen kleinen Bruchteil aller Endothelzellen (1 - 3% des Dottersackes und AGM Endothelzellen) 11,12. Der Prozess der hemogenic endothelial cell "Spezifikation" für murine kritisch, sowie menschliche, Hämatopoese. Hämatopoetische Zellen sind gezeigt worden , aus dem Endothel der Dottersack Gefäßen und der Aorta in menschlichen Embryonen 13 zu knospen, und mehrere Labors haben gezeigt , dass Blutzellen aus humanen pluripotenten Stammzellen eine endotheliale Zellzwischen 14-16 erfordert. Somit definieren den Phänotyp murine hemogenic Endothelzellen und die molekularen Ereignisse zu verstehen , die in diesem Tiermodell für ihre Entwicklung führen sollte zur Erzeugung von hemogenic Endothelzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen Verfolgung in vitro Technologien erleichtern. Im Gegenzug HSPC die mögliche Entwicklung eines Ansatzes für eine groß angelegte Erzeugung von differenzierten Blutzelltypen aus Multi-Linie - selbst derived von menschlichen pluripotenten Stammzellen über einen physiologisch relevanten hemogenic Zwischen Endothelzellen - für hämatologische unglaubliche therapeutische Potenzial hätte, onkologischen und der regenerativen Medizin. Auf dem Weg zu diesem Ziel haben wir den Phänotyp hemogenic Endothelzellen definiert, auf einer klonalen Ebene im murinen Dottersack 11 und 12 AGM, zwei großen Standorten der endgültigen HSPC Produktion während der Embryonalentwicklung. Wie HSPC innerhalb erwachsenen Knochenmark 17, embryonale hemogenic Endothelzellen und HSPC zeigen Hoechst Farbstoff Ausströmen Eigenschaften und deshalb in den "Side Population" erscheinen (SP) von Zellen auf einem FACS Plot 5,11,12 (wie in Abbildung 3 dargestellt). Darüber hinaus haben wir auch gezeigt , dass hemogenic Endothelzellen Marker sowohl Endothelzellen exprimieren und Stammzellen (Flk1 und ckit, respectively), aber die hämatopoetischen Linienmarker nicht ausdrücken, CD45 5,11,12. Somit kann hemogenic Endothelzellen ident seinified und durch FACS wie Flk1 + / ckit + / CD45- SP - Zellen isoliert, und wir haben , dass diese Zellen in der Flk1- / ckit + / CD45 + SP Fraktion des Dottersackes und AGM Zellen 5,11,12 enthalten verursachen HSPC gezeigt. Hemogenic Endothelzellen und HSPC können identifiziert und von Dottersack oder AGM Gewebe entweder aus frisch getöteten Embryonen oder von Embryonen kultiviert für bis zu 48 Stunden in ex vivo Embryokultur geerntet , isoliert werden (wie in 1 dargestellt). Ex - vivo - Kultur erlaubt eine selektive Vorbehandlung von einzelnen Embryonen mit pharmakologischen Mitteln, und ermöglicht auch eine transiente Expression von gewünschten Transgene (dh durch lentivirale Transduktion). FACS Identifizierung hemogenic Endothelzellen und HSPC durch das hierin beschriebene Verfahren kann in genetisch manipulierten Mausmodellen als quantitatives Maß für definitive hämatopoetischen Entwicklung verwendet werden; die Zellen können auch für die nachfolgende experimentelle Anwendungen, einschließlich Blut-fo abgerufen werden,rming Assays, Expressionsanalyse und Transplantation.

Tierthemen: Verwendungen und ethische Überlegungen

Eine wachsende Zahl von Literatur hat den wichtigen Beitrag der hemogenic Endothelzellen HSPC Bildung während der endgültigen Hämatopoese Stadium der Embryonalentwicklung etabliert. Dennoch bleiben die physiologischen Bedingungen und Signale , die Spezifikation einer Subpopulation von Endothelzellen zu einem hemogenic Schicksal fördern schlecht verstanden, und daher noch nicht in einer in vitro Umgebung nachgeahmt werden. Tatsächlich sind die in diesem Dokument beschriebenen Techniken sind derzeit im Einsatz durch unser Labor und andere Gruppen das Feld des Verständnisses von hematovascular Entwicklung zu verbessern, so dass ein Konzept für die ex vivo hemogenic Endothelzellen Spezifikation und HSPC Produktion eines Tages entwickelt werden. Bis zu diesem Zeitpunkt bleibt jedoch das Feld abhängig von primären Gewebe von Wildtyp (und Gentisch modifiziert) Maus-Embryonen für die weitere Untersuchung angegeben hemogenic Endothelzellen und HSPC zu erhalten. (- 12 Somiten Paaren 10) yolk sac oder E10.5 (35-40 Somiten Paare) AGM 11,12 Hemogenic Endothelzellen und HSPC zuverlässig entweder aus E8.5 identifiziert und isoliert werden. Aufgrund der relativen Mangel an hemogenic Endothelzellen ( in der Regel repräsentieren 1-3% der gesamten Endothelzellen 11,12 in diesen Geweben) die gemeinsame Nutzung von Geweben aus mehreren (~ 8 - 10) littermates in einer einzigen Probe wird , um dringend empfohlen genügend Zellen für die nachfolgende Experimente erhalten. Die Überprüfung der hemogenic Endothelzellen und HSPC wurden erfolgreich identifiziert und isoliert von der Kultur der abgerufenen Zellen unter Bedingungen erreicht werden, die hämatopoetische Differenzierung induzieren. Unter diesen Bedingungen wird hemogenic Endothelzellen und HSPC zeigen hämatopoetische Differenzierung multi-lineage, wodurch das Auftreten von Kolonien enthaltenden erythroid Vorläufern (BFU-E), Granulozyten und Makrophagen-Vorläufern (CFU-GM) und Granulozyten, Erythrozyten, Makrophagen, Megakaryozyten-Vorläufer Kolonien (CFU-GEMM).

Protokoll

Ethik - Statement: Das Protokoll unten beschrieben wurde von überprüft, und in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Yale University Institutional Animal Care und Use Committee.

1. Voll Embryo Ex V ivo Kultur für Yolk Sac Studies (Optional)

  1. Euthanize pregnant Dämme an E7.0 - E7.5 und Uterushörner unter sterilen Bedingungen zu entfernen, wie detaillierter unten beschrieben (Schritte 2,4-2,7).
  2. Separate ganzen Embryos (mit yolk sac intakten 12) von umgebenden Decidua und in 50 ml - Polystyrolröhrchen in 50 ml ganzen Rattenserum suspendieren.
  3. Gas embryo Flaschen für 3 min mit 5% CO 2 unmittelbar , wie zuvor beschrieben 12,18. Wiederholen Sie diesen Schritt bei 24 Stunden, wenn Embryonen Kultivierung für 24 bis 48 Stunden.
  4. Inkubiere in rollend 37 ° C-Kultur für bis zu 48 Stunden.
    Anmerkung: Die Embryos können ex vivo mit pharmakologischen Mitteln behandelt werden (dh Notch - Inhibitor DAP.T 12) oder löslicher Proteine ​​(dh Fibronektin 19) durch Vorinkubation von Embryonen für bis zu 2 Stunden in Kulturmedium solche Faktoren enthält, oder durch Zugabe dieser Faktoren zur Walzkulturmedium für die gesamte Länge der ex vivo - Kultur Periode. Die Genexpression kann in Embryonen , die durch Vorinkubation von Embryonen mit optimal titriert Lentiviren für 2 Stunden 12 manipuliert werden. Dottersack Gefäß- und hämatopoetischen Entwicklung können in Echtzeit unter Verwendung von transgenen Reportermäuse und optische Bildgebungsverfahren überwacht werden.

2. Dissection von Yolk Sac (YS) oder Aorta-Gonaden-Mesonephros (AGM) von Maus-Embryonen

  1. Sterilisieren Labortisch durch Aufsprühen und Abwischen alle Oberflächen mit 70% Ethanol Kontamination in den folgenden Zellkulturen zu reduzieren. Legen Sie ein saugfähiges underpad auf dem Labortisch Oberfläche.
  2. Sterilisieren chirurgischer Instrumente mit 70% Ethanol. Empfohlene chirurgische Instrumente sind zwei # 5 gerade Kraftps, und ein 8,5 cm gerade Schere.
  3. Wenn mit Embryonen aus ex vivo Kultur arbeiten, entfernen Sie vorsichtig ganze Embryonen aus 50 ml Falcon - Röhrchen und gehen sofort 2,8 Schritt. Andernfalls überspringen Sie diesen Schritt und fahren 2.4 zu Schritt.
  4. Euthanize schwanger Damm in geeigneten embryonalen Alter (E8.5, wenn die Ernte YS; E10,5 wenn Ernte AGM).
    Hinweis: Die beschriebene Technik verwendet einen Dual-Methode Euthanasie Ansatz - tödliche Dosis eines volatilen Anästhetikums durch mechanische Zervikaldislokation gefolgt - Tier Schmerzen und Leiden zu minimieren und sicherzustellen, minimal-invasive und humane Beendigung von Tier Themen. Diese kombinierte Technik für kleine Nager Euthanasie wird von der American Veterinary Medical Association empfohlen, wenn sie von einem geschulten und kompetenten Prüfer (AVMA Richtlinien für die Euthanasie von Tieren: Ausgabe 2013) durchgeführt.
    1. Anesthetize Maus eine tödliche Dosis von Isofluran (> 5% in O 2) unter Verwendung von 3 - 5 min. (cautiON: Isofluran ist ein giftiges Inhalat; Verwenden Sie unter einer Abzugshaube Chemikalie mit geeigneten Atemschutzausrüstung anlegen.)
    2. Nach Exposition von Mäusen zu Isofluran, überprüfen Sie mindestens drei Zeichen des Anästhetikums Niveau - Verlust des Stellreflexes, Verlust der Zehe Prise Reflex, und eine Verringerung der Atemfrequenz - zu Themen sicherzustellen, haben eine tiefe Narkose Ebene vor dem Fortfahren mit mechanischen Euthanasie erreicht.
    3. Zervikal Damm verrenken, um schnell den Tod herbeiführen.
  5. Platzieren Sie eingeschläfert Damm liegt auf dem Rücken underpad und Spray großzügig Unterbauch mit 70% Ethanol.
  6. Machen Sie einen vertikalen Schnitt entlang der Mittellinie der unteren Bauchwand. Nehmen Sie zusätzliche ~ 1 Zoll horizontale Einschnitte erstrecken rechts und von der Mitte des vertikalen Schnitt links, und sezieren die Bauchdecke weg ganz nach rechts und links zu belichten Gebärmutterhörner die jeweils mehrere trächtige Embryonen.
  7. Mit einer Pinzette, halten Sie eine der beiden Uterushörnerund eine Schere aus der Mesometrium zu trennen. Platzieren seziert Uterus auf Eis in steriler Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) in einem 60 mm Polystyrol-Gewebekulturplatte. Wiederholen Sie dies für andere Uterushorn.
  8. Unter einem Standardmikroskop Licht Sezieren, verwenden Pinzette Muskelschicht der Gebärmutter-sac wegzuziehen, um die zugrunde liegende Fruchtblase und Decidua offenbaren. Isolieren YS (2A) , indem Sie vorsichtig den Sack aus dem eingeschlossenen Embryo zu entfernen. Entfernen YS Gewebe aus Embryo richtige an der embryonalen Ursprungs von Dottergefäße.
  9. Um die AGM isolieren, entfernen Sie den YS und den Embryo transect unter dem Niveau des Herzens und der vorderen Gliedmaßen und entsorgen Sie den Brustkorb und Kopfbereich. unter dem Niveau der hinteren Gliedmaßen und zu entfernen und entsorgen Sie den Schwanz Gewebe Als nächstes nur den Embryo transect. Entfernen Sie die hinteren Gliedmaßen und überschüssiges ventralen Gewebe aus dem verbleibenden Abschnitt, der an der Hauptversammlung (2B) enthält.
  10. Pool YS oder AGM-Gewebe von mehreren Embryonen und speichernauf Eis in HBSS + (HBSS, ergänzt mit 10% (v / v) fötalem Rinderserum und 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 0,3 mg / ml L-Glutamin) in ein sauberes 1,5-ml-Röhrchen.

3. Die Verdauung von Primärgewebe in eine Einzelzellsuspension

  1. Zentrifugenröhrchen geerntet YS oder AGM Gewebe für 5 min bei 2000 × g bei 4 ° C enthält.
  2. Überstand entfernen und resuspendieren Gewebe in 1 ml von entweder 0,05% (für YS) oder 0,2% (für AGM) Kollagenase Typ II in HBSS + verdünnt. Inkubieren für 30 min in einem Wasserbad bei 37 ° C, Umdrehen des Röhrchens alle 5 min zu mischen.
  3. Vorsichtig mechanisch Gewebe trennen von Probe 10 mal durch eine P1000 Pipette vorbei. Wenn Schwierigkeiten beim Ansaugen von teilweise verdaute Gewebe, Pipettenspitze Bohrung kann durch Abschneiden ~ 5 mm der Spitze mit einer Schere erweitert werden.
  4. Zentrifuge Probe für 5 min bei 2000 × g bei 4 ° C. Überstand entfernen und resuspendieren in 1 ml eiskaltem HBSS +.
  5. Pass Probe durch eine 70 &# 956; m Zelle Sieb.
  6. Zählen von Zellen unter Verwendung einer manuellen oder automatisierten Hämozytometer.
  7. Zentrifuge Probe für 5 min bei 2000 × g bei 4 ° C. Resuspendieren Probe in DMEM + (4,5 g / L Glucose Dulbeccos Modified Eagle Medium, ergänzt mit 10% (v / v) fötalem Rinderserum und 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin und 0,3 mg / ml L-Glutamin) Pre- auf 37 ° C erwärmt , so dass Zellen bei einer Endkonzentration von 1 x 10 6 Zellen / ml liegen.

4. Behandlung der Zellen mit Nucleinsäurefarbstoff und Labeling mit fluoreszenz Konjugierte Antikörper

  1. Aliquotieren mindestens 100 & mgr; l der Probe (1 x 10 5 Zellen) in frisches 1,5 - ml - Röhrchen für die Antikörper - Inkubation.
  2. Fügen Sie den folgenden Beispiel und notwendige Kontrollröhrchen: Unstained; ckit-APC nur; CD45-FITC nur; CD31-PE nur; Flk1-PECy7 nur; Hoechst 33342 nur; Hoechst 33342 nur + Verapamil; Die Probe (alle Farben erhält, wird nicht erhalten Verapamil). Verwenden Sie ein Minimum von 1 x 10 5 Zellen in 100 & mgr; l für die Kontrollröhrchen.
    Hinweis: Ein größeres Volumen von Zellen in das Probenröhrchen in der gleichen Konzentration zugegeben werden kann Ausbeute sortiert Hemogenic EC und HSPC zu maximieren.
  3. Hinzufügen Verapamil in 95% Ethanol (für Grundprinzip siehe Diskussion) , verdünnt auf der "Hoechst 33342 nur + Verapamil" Steuerrohr bis zu einer Endkonzentration von 50 & mgr; M. Inkubieren alle Röhrchen für 5 min bei 37 ° C. (ACHTUNG: Verapamil ist ein potenter Calcium-Kanal - Blockierungsmittel und ist extrem giftig Griff mit Handschuhen.).
  4. In Hoechst 33342 zum "Hoechst 33342 nur" Kontrolle, zu der Hoechst 33342 + Verapamil nur die Kontrolle, und auf die "Probe" Rohr zu einer Endkonzentration von 5 ug / ml. Inkubieren Sie alle Röhrchen für 1 Stunde bei 37 ° C, vor Licht geschützt. Vorsichtig mischen durch alle 15 Minuten umgekehrt wird. (ACHTUNG: Hoechst 33342 ist ein giftiges Kern Farbstoff und sollte mit Handschuhen angefasst werden).
  5. Zentrifuge alle samples für 5 min bei 2000 × g bei 4 ° C. Überstand entfernen und resuspendieren Zellpellets in einer Konzentration von 1 x 10 5 Zellen / ml in kaltem HBSS +.
  6. Fügen fluoreszenz konjugierte Antikörper an geeignete Antikörper-only Kontrollröhrchen und in die "Sample" Rohr bis zu einer Endkonzentration von 2 & mgr; g / ml. Inkubieren auf Eis für 30 min, vor Licht geschützt.
  7. Zentrifuge alle Röhrchen für 5 min bei 2000 × g bei 4 ° C. Überstand entfernen und resuspendieren Zellpellet in 500 ul eiskaltem HBSS. Dehnungsproben durch Netzfilterdeckel von 5 ml mit rundem Boden Polystyrol FACS-Röhrchen und auf Eis lagern, vor Licht geschützt, für die sofortige FACS.

5. Identifizierung und Isolierung von Hemogenic Endothelial Cells und HSPC durch FACS

Hinweis: Dieses Protokoll wurde optimiert, eine BD FACSAria 5-Lasersystem ausgestattet mit einer 100-MW-355-nm-UV-Laser, ein 200-MW-405 nm Violett-Laser, ein 200 MW 488 nm Blau-Laser, ein 200-MW-532 nm Grün-Laser und ein 150 mw 637 nm RotLaser. 2000 Ereignisse pro Sekunde erfasst werden Zellstress zu minimieren - Zellen wurden in sterilem PBS als Hüllflüssigkeit und unter aseptischen Bedingungen, und durch ein 100 & mgr; m-Düse mit Durchflussrate zu einem Probendruck von 1, so dass ein Maximum von 1,500 eingestellt sortiert.

  1. Unter diesen oben beschriebenen Einstellungen verwenden "Ungefärbte" und einfarbige Kontrollröhrchen FACS Zellsortierer Laserintensitäten zu optimieren und die spektrale Mehrfarbkompensationssteuerung auszuführen Anweisungen nach Hersteller. Verwenden Sie nach vorn und Seitenstreu lebenden Zellen durchführen und Dubletten Diskriminierung von insgesamt Ereignisse (siehe Herstellerangaben für weitere Details).
    Hinweis: Dieses Protokoll führt in der Regel ~ 70-80% lebenden Zellen. Wenn Probleme mit geringer Lebensfähigkeit der Zellen auftreten, stellen Sie sicher, dass Gewebe zunächst schnell in eiskaltes Medien seziert werden, und dass alle Schritte mit Ausnahme der Angabe sonst werden auf Eis durchgeführt, mit vorsichtiges Pipettieren Scher- und Zelltod zu minimieren(Siehe Diskussion um Details über die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten).
  2. Verwenden Sie eine Differential linear angelegte Grundstück von Hoechst Rot gegen Hoechst blaue Fluoreszenz Side Population (SP) Ereignisse (3A) zu identifizieren. Verwendung "Hoechst 33342 nur + Verapamil" control als negative Kontrolle, um zu überprüfen, dass Gates richtig für die Probe gezogen werden. SP erscheint als eine Schulter auf der linken Seite der nicht-SP-Zellen und wird in der Verapamil-behandelten Kontroll verringert werden. Die nicht-SP Bevölkerung verwendet werden zur Identifizierung nicht-hemogenic EC (3B).
  3. Erstellen Sie zusätzliche Differential Fluoreszenz Plots (log-Skala Achsen) und Tochter Toren der SP zeichnen zu hemogenic Endothelzellen (3C-E) zu identifizieren.
    Anmerkung: Hemogenic Endothelzellen sind profiliert als Flk1 + / ckit + / CD45- SP - Zellen (Figur 3D) und HSPC sind Flk1- / ckit + / CD45 + SP - Zellen (Abbildung 3E). Hemogenic endothelialen cells können mit nicht hemogenic Endothelzellen parallel analysiert werden, die in diesem Ansatz als CD31 + / CD45- nicht-SP - Zellen (3B) identifiziert werden.
  4. Abrufen hemogenic Endothelzelle oder HSPC Fraktion auf Methylcellulose-Platten für hämatopoetischen Kultur enthält (siehe unten) oder in andere Puffer für die nachfolgende Verarbeitung und Analyse.

6. hämatopoetische Differenzierung in Kultur

  1. 0,5 ml (135 & mgr; l / cm 2) Methylcellulose basierenden hämatopoetischen Kulturmedien , um die gewünschte Anzahl von Vertiefungen einer 24-Well - Gewebekulturplatte bei Raumtemperatur. 0,5 ml steriles Wasser in die nicht verwendeten Wells Verdunstung zu minimieren. Bereiten Sie frisch und halten bei Raumtemperatur bis zur Verwendung.
  2. Art 1 - 10 Zellen zur klonalen Analyse oder bis zu 1.000 hemogenic Endothelzellen (Flk1 + / ckit + / CD45- SP-Zellen) oder HSPC (Flk1- / ckit + / CD45 + SP-Zellen) für Schütt Expansion und Differenzierung direkt in jede Vertiefung derPlatte, die Methylcellulose. 20% - Koloniebildung wird in etwa 10 detektiert.
  3. In einer sterilen Kultur Haube Gewebe, verwenden Sie einen P1000 Spitze mit der Spitze getrimmt seiner Bohrung zu erweitern, um sanft jede Vertiefung der ausgesäten Methyl Medien 2 suspendieren - 3-mal, wobei darauf geachtet Erzeugung von Blasen zu vermeiden. Dies stellt sicher Suspension der sortierten Zellen in das halbfeste Methyl für ein optimales Wachstum.
  4. Inkubieren Platte bei 37 ° C mit 5% CO 2 für bis zu 2 Wochen.
  5. Überwachen Einzelzellkulturen zur Bildung von differenzierten hämatopoetischen Zellkolonien über die Zeit (Abbildung 4). Score Vertiefungen für Anzahl und Art von differenzierten hämatopoetischen Kolonien an den Tagen 1, 3, 7 und 14 nach der Methode (n) skizziert nachfolgend in Schritt 6.7.
    1. Score Platten am Tag 1 Konfluenz und Lebensfähigkeit der sortierten Zellen zu bestätigen.
    2. Am Tag 3, überprüfen Sie für die frühe Bildung von adhärenten hemogenic endothelialen Zellkolonien mit "GerölleTon "Morphologie (siehe Goldie et al. 11 und Marcelo et al. 12 zur Darstellung von Tag 3 Morphologie).
    3. Nach Tagen fähig 5 - 7, überprüfen Sie für die Bildung von gerundeten HSPC Cluster in Brunnen sortiert hemogenic EG enthält. HSPC sollte neben beobachtet werden hemogenic EC Anzeigen einer "Kopfsteinpflaster" endothelialen Zellmorphologie abgeflacht.
      Anmerkung: Hemogenic Endothelzellen sollte hämatopoetischen Kolonien bilden (bestimmt durch hämatopoetische Kolonie-Zahl), und sollte mehr lineage Differenzierungskapazität (durch Beobachtung mehrerer Kolonietypen aus einer einzigen Zelle bestimmt wird) zeigen. Wir haben bereits festgestellt , dass ca. 20% der hemogenic EC oder HSPC abgerufen durch FACS zu bilden , überleben Differenzierung und hämatopoetischen Kolonien in Methylcellulose 11 wuchernden.
  6. Zur Beurteilung der Koloniebildung durch Phasenmikroskopie:
    1. Visualisieren und Kolonien bei geringer Vergrößerung und zählener eine Phasenlichtmikroskop und identifizieren BFU-E, CFU-GM und CFU-GEMM - Kolonien durch Kolonie - Morphologie, wie von Goldie et al. 11 beschrieben.
  7. Koloniebildung durch Zellmorphologie zu beurteilen:
    1. Absaugen einzelne Kolonien von Methyl Oberfläche in eine P1000 Spitze mit dem Ende getrimmt Bohrung zu erweitern. Dies erleichtert das Absaugen des viskosen Methylcellulose-Medium und sorgt erfolgreichen Abruf der Kolonie.
    2. Resuspendieren nahm Kolonien in 200 ml HBSS und Spin auf einem Glasobjektträger für 5 min ein Zytozentrifuge bei 28 · g verwendet wird.
    3. Fix Dias in 100% Methanol für 5 min (ACHTUNG: Methanol ist giftig und sollte nur in einer chemischen Haube mit entsprechender Belüftung und persönliche Schutzausrüstung verwendet werden).
    4. Versenken Dias in 0,04% Giemsa für 20 min (ACHTUNG:. Giemsa enthält Methanol Verwendung in einer chemischen Haube mit entsprechender Belüftung und Personal Schutzausrüstung).
    5. Spülen Sie gleitet in entmineralisiertem Wasser.
    6. Berg Träger mit Deckgläsern und Bild bei hoher Vergrößerung unter einem Standardlichtmikroskop, das Vergleichen der Zellmorphologie zu, dass klassisch in hämatopoetischen Zellen aus adulten Knochenmark beobachtet, die in Methyl Medien kultiviert werden. Für Beispiele, bitte den Anweisungen des Herstellers zu sehen.
  8. Koloniebildung durch Zellexpression von hämatopoetischen Abstammungslinie Marker durch FACS Zur Beurteilung:
    1. 2 ml HBSS zu jeder Vertiefung einer 24-Well - Platte Kolonien kultiviert auf 0,5 ml Methylcellulose enthält (dh verdünnte im Handel erhältliche Lager Methylcellulose 1: 4). Pipette nach oben und unten zu mischen, und übertragen an die frische Röhre (n).
    2. Zentrifuge Probe bei 2.000 xg für 5 min bei 4 ° C eine Standard-Tisch-Mikrozentrifuge verwendet wird.
    3. Überstand entfernen und resuspendieren Zellpellet (s) in 1 ml HBSS +, Pooling Proben, wenn dies gewünscht wird.
    4. Centrifuge Probe bei 2000 × g für 5 min bei 4 ° C.
    5. Überstand entfernen und resuspendieren Zellpellet (s) in 400 & mgr; l HBSS +.
    6. Aliquoten in vier 1,5-ml-Röhrchen wie folgt: Unstained; B220-FITC nur; GR-1-FITC nur; Ter119-FITC nur.
    7. fluoreszenz konjugierten Antikörper an geeignete Röhre zu einer Endkonzentration von 2 ug / ml hinzu. für 15 min bei 37 ° C inkubieren.
    8. Zentrifuge Probe bei 2.000 xg für 5 min bei 4 ° C. Überstand entfernen und resuspendieren Zellpellet in eiskaltem 0,5 ml HBSS.
    9. Analysieren Sie jede Probe durch FACS für Expression jedes hämatopoetischen Linienmarker: B220 markiert B-Zellen 20; GR-1 markiert myeloischen Zellen 21; Ter119 markiert erythroiden Zellen 22.
      Hinweis: Weitere Antikörper anderen hämatopoetischen Abstammungslinie Marker Targeting kann in diesen Ansatz einbezogen werden, wenn dies gewünscht wird.

Ergebnisse

Erfolgreiche Kennzeichnung von hemogenic Endothelzellen und HSPC aus embryonalen YS oder AGM wird FACS Streudiagramme ähnlich den repräsentativen Parzellen dargestellt in Abbildung 3. Ausbeute nach Standard lebenden Zellen und Dubletten Diskriminierung durch Vorwärts- und Seitenstreuung (nicht dargestellt), Seitenpopulation (SP) Ereignisse sichtbar gemacht werden in einem linearen Hoechst Rot gegen Hoechst Blau Differential Grundstück in Abwesenheit von Verapamil als "Schulter" nach links verschoben von der Mehrheit der (nicht-SP) Ereignisse (3A). 3% der gesamten lebensfähigen Zellen YS und 3 - - 5% der gesamten lebensfähigen AGM Ereignisse Wenn der SP-Gate richtig gezeichnet wird, SP-Zellen werden etwa 1 darstellen. Verapamil Behandlung sollte in> 50% ige Hemmung der SP Ereignisse unabhängig von Gewebequelle (3A, Deckplatten) zur Folge haben . Wir haben früher festgestellt, dass andere Populationen, die außerhalb des SP Schulter erscheinen, sondern auch von Verapamil sind Ter119-positive erythr blockiertenoblasts und sind von unserem SP Bevölkerung 5 daher ausgeschlossen.

Im Vergleich zu dem SP, sind nicht-SP - Zellen als dichte Cluster von Zellen angrenzend an den SP "Schulter" (3A) identifiziert. Diese Population enthält nicht Hemogenic EG , die eine CD31-PE mit gegen CD45-FITC Tochter Plot (3B) unterschieden werden können, als CD31 + / CD45- Veranstaltungen. Nicht Hemogenic EC sind typischerweise 2 bis 5% der nicht-SP - Zellen von AGM (3B) oder Dottersack (nicht gezeigt) und eine hohe Zahl dieser Zellen zurück relativ leicht sortiert werden können.

Zur Identifizierung von HSPC und Hemogenic EG Tochter Tore aus dem SP - Fraktion gezogen werden, CD45 + und CD45- Zellen zu identifizieren, in denen CD45 + Zellen typischerweise <20% der gesamten Ereignisse in beiden AGM (3C) oder YS (nicht dargestellt). Hemogenic EG werden anschließend von CD45- Zellen in einem Differential ckit-APC vs. Flk1-PECy7 Tochter p identifiziertLos als doppelt positiven Ereignisse, und in der Regel 1 darstellen - 3% des CD45- Ereignisse , wenn entweder von AGM (Abbildung 3 D) oder YS isoliert (nicht dargestellt). HSPC werden aus der CD45 + Fraktion in einem separaten ckit-APC vs. Flk1-PECy7 Tochter Grundstück als Flk1- / ckit + Zellen identifiziert, und auch in der Regel zwischen etwa 25 - 30% der kleinen Population von CD45 + Zellen , wenn sie entweder von YS erhalten (nicht gezeigt) oder AGM (Abbildung 3 E). Somit können sowohl Hemogenic EG und HSPC außerordentlich selten sind (~ 0,01% der gesamten Zellereignisse), und es ist typisch für dieses Protokoll ein paar hundert jeder Zelltyp zurückzukehren, selbst wenn das Gewebe aus mehreren Embryonen gepoolt werden. Gates Tochter Flächen sollten mit Bezug auf negative Kontrollgruppen festgelegt. Um zwischen spezifischer und unspezifischer Antikörperfärbung zu unterscheiden, sollte Gates zunächst in Bezug auf die beiden Kontrollen Ungefärbte gezogen werden (Abbildung 3C) sowie Proben , die mit fluoreszenz konjugierten Isotyp-(IgG2A oder IgG2B) Kontrollantikörper (nicht gezeigt) behandelt worden sind. Diese letztgenannte Steuerung hat gezeigt , dass nicht-spezifische Färbung durch dieses Protokoll minimal ist daher während empfohlen, Isotyp-Kontrollantikörper (z. B. IgG2A-PE oder IgG2B-FITC) zunächst FACS Sorter Einstellungen zur Optimierung verwendet werden , und die Gate - Grenzen bestimmen , finden wir auch, dass ungefärbten Kontrollen ausreichend sind, um Gate-Grenzen und experimentelle Qualität während der Routine FACS-Sortierung zu überprüfen. Wenn Gatter richtig gezeichnet sind, minimal positive Streuung sollte in einzel- oder doppelsträngige positive Gattern beobachtet werden, wenn von ungefärbten oder Isotyp-Kontrollen der Aufnahme.

Hemogenic Endothelzellen aus der AGM und HSPC laufen hämatopoetische Differenzierung über 14 Tage der Kultur in Methylcellulose (4A). Der relative Anteil an Kolonietypen typischerweise in diesen beobachtetenKulturen auf Gewebequelle abhängig. Hemogenic Endothelzellen aus yolk sac Geweben bei E8.5-E9.5 führen zu BFU-E, CFU-GM isoliert, und nur wenige CFU-GEMM 5, während hemogenic Endothelzellen aus der E10.5 AGM Anstieg CFU geben isoliert überwiegend -GEMM 12, obwohl auch andere Linien noch beobachtet werden, wie in 4B (oben links) angezeigt. HSPC isoliert von E10,5 AGM geben auch überwiegend auf CFU-GEMM auf die Kultur in Methylcellulose (4B, oben Mitte) steigen, obwohl diese Zellen auch in anderen hämatopoetischen Kolonietypen als auch unterscheiden wird. Nicht-hemogenic Endothelzellen (CD31 + / CD45- nicht-SP) sind ebenfalls (4B, oben rechts) überzogen worden. Diese Zellen zeigen kein Wachstum in hämatopoetischen Kultur nach 14 Tagen.

Assays von hämatopoetischen Kapazität der einzelnen Oberflächenmarker Zelltypen exprimieren, einschließlich Zellen mit und ohne Ausdruck von hämatopoetischen einnd endothelialen Marker CD31, Flk1, c-Kit, VE-cad, CD41 und CD45 innerhalb der SP-Fraktion der Hauptversammlung bei E10,5 durchgeführt wurden, und zeigen, dass die Multi-Abstammungslinie Kolonie bildende Aktivität in der E10,5 AGM beschränkt ist zu CD31 +, VE-Cadherin +, c-Kit +, CD41 + und CD45 + SP - Zellen 12. Interessanterweise wurde Kolonie bildende Aktivität festgestellt, in beiden Flk-1 + und Flk-1- SP-Zellen, aber nur Flk1 + c-Kit + CD45- SP-Zellen führte zu mehreren lineage Kolonien über eine endotheliale einschichtige Zwischen sowohl von "Pflasterstein gekennzeichnet "endothelialen Zellmorphologie (4B, untere linke Tafel) und von Dil-AcLDL Aufnahme 12. Des Weiteren wird die Expression von c-Kit ist für hämatopoetische Aktivität von AGM SP - Zellen 12 erforderlich.

Während es, dass einige myeloischen Vorläufern ähnliche morphologische Merkmale haben gezeigt worden ist, wenn sie auf hemogenic Endothelzellen im Vergleich zu exprimieren myeloischen Vorläuferzellen CD45 und können mehr lineage Kolonien nicht erzeugen in vitro. HSPC auch Multi-Abstammungslinie Kolonien erzeugen, aber obwohl diese Zellen CD45, es fehlt ihnen an Flk-1 - Expression 12,23 und führen zu abgerundeten Zellcluster ohne eine zugrunde liegende endotheliale Monoschicht (4B, unten rechts). Daher definieren die Bevölkerung wir als hemogenic Endothel (oder, Flk-1 + / c-Kit + / CD45-SP-Zellen) Blut Endothelzellen mit Bildungspotential und robuste hematoendothelial Genexpression darstellen, einschließlich GATA-1/2 LMO2, SCL / Tal-1, Runx-1, c-Kit, CD34, CD41, CD45 und 11 , die von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen verschieden sind, sowie deren nicht-hemogenic Endothelzelle Pendants.

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Abbildung 1. Gesamt Workflow. Kurz gesagt, Embryonen werden von schwangeren Dämme entfernt und YS oder AGM - Gewebe werden geerntet. Embryos optional kultiviert werden für 2 4-48 h ex vivo vor der Gewebeernte. Geernteten YS oder AGM Gewebe werden zu einer Einzelzellsuspension verdaut, aliquotiert in Kontroll- und Probenröhrchen und in Gegenwart von Hoechst Farbstoff und / oder fluoreszierend konjugierten Antikörper inkubiert. Verapamil, ein Calciumkanalinhibitor, ist auch eine negative Kontrolle wesentlich für die Überprüfung der genauen Gating der SP-Fraktion zu erzeugen, verwendet. Hemogenic endothelialen Zellen durch FACS wie Flk1 + / ckit + / CD45- SP-Zellen identifiziert, während HSPC innerhalb des Flk1- enthalten / ckit + / CD45 + SP Fraktion von Zellen; beide Zelltypen werden auf Methylcellulose für die Bestätigung der hemogenic Potential sortiert. Darüber hinaus können nicht-hemogenic Endothelzellen unterschieden werden (und abgerufen, wenn dies gewünscht wird ) als CD31 + / CD45- nicht-SP - Zellen. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 2. Dissection von YS und AGM - Gewebe. A) Der YS wird seziert weg von E8.5 - Embryonen und stellte ganz in sterile HBSS + für die anschließende Verdauung. B) Der Stamm von E10.5 Embryonen , indem horizontale Schnitte unter den beiden vorderen Gliedmaßen und hinteren Gliedmaßen Knospen isoliert ist. Die Hauptversammlung wird dann aus den Extremitätenknospen getrennt und ventralen Gewebe mit einer Pinzette. C) Hellfeld - Bilder zeigen Dissektion beider YS und AGM von einem E10,5 Embryo (Skala = 1 mm). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version zu sehen diese Figur.

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Abbildung 3. Repräsentative Plots Demonstrieren Tor Hierarchie für Diskriminierungvon Hemogenic Endothelzell s (Flk1 + / ckit + / CD45- SP - Zellen), HSPC (Flk1- / ckit + / CD45 + SP - Zellen) und Non-hemogenic Endothelial Cells (CD31 + / CD45- nicht-SP) durch FACS von E8.5 YS oder E10,5 AGM. im Anschluss an lebenden Zellen und Dubletten Diskriminierung von Zellen , die aus entweder YS (linke Felder) oder AGM (rechte Felder) durch Vorwärts- und Seitenstreuung (nicht dargestellt), A) der Seitenpopulation (SP) Tor gezogen und überprüft durch eine deutliche Abnahme der SP-Fraktion in der Verapamil-behandelten Negativkontrolle. Die nicht-SP Population wird als dichte Cluster von Zellen angrenzend an den SP identifiziert. In jeder der dargestellten Plots 20.000 Ereignisse werden angezeigt B) Nicht-hemogenic endothelialen Zellen als CD31 + / CD45- Zellen innerhalb der nicht-SP - Fraktion identifiziert sind, und repräsentieren . 2 - 5% der nicht-SP - Zellen entweder von AGM erhalten (gezeigt ) oder YS (nicht gezeigt). Um GLEICHBEHAstimmter Hemogenic EC oder HSPC, C) Tochter - Gattern aus der SP - Fraktion gezogen werden CD45 + und CD45- Zellen zu identifizieren. D) Zur Identifizierung hemogenic Endothelzellen aus entweder AGM (gezeigt) oder YS (nicht gezeigt), zusätzliche Tochter Gattern gezeichnet von der CD45- Fraktion ckit + (vs. cKit-) und Flk1 + (vs. Flk1-) Zellen zu unterscheiden. Hemogenic EG entweder von YS oder AGM sind in der Regel ca. 1 - 3% des CD45- Ereignisse E) HSPC aus der CD45 + Fraktion identifiziert werden als ckit + und Flk1-, und stellen typischerweise 20 -. 30% der CD45 + Zellen , ob von AGM sortiert (gezeigt ) oder YS (nicht. gezeigt) Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 4. Visualisierung von hämatopoetische Differenzierung folgende Kultur von Hemogenic Endothelial Cells und HSPC auf Methylcellulose. A) Kolonien Form von sortierten einzelnen Zellen innerhalb von 7 Tagen auf Methyl Plattierung. Multi-lineage hämatopoetischen Potential kann durch Beobachtung mehrerer hämatopoetischen Kolonie - Typen, identifiziert durch Beurteilung unterschiedlicher Koloniemorphologien . 11 ​​B) Phase mikroskopische Abbildung von sortierten hemogenic EC und HSPC von AGM (oder YS, nicht gezeigt) zeigen , multi-lineage hämatopoetischen bestätigt werden Koloniebildung nach 7 Tagen Kultur in Methylcellulose-Kulturmedium. Nicht hemogenic EG von AGM (oder YS, nicht gezeigt) zeigen keinen Wachstum unter diesen Bedingungen. Bei höherer Vergrößerung, anhaftenden Zellen mit klassischen "Kopfsteinpflaster" endothelialen Zellmorphologie (weißer Pfeil) können, die zu Clustern von hämatopoetischen Zellen in Cul gesehen werdenturen von hemogenic EG; keine solchen Endothelzellen in Kulturen von sortierten HSPC (Skala = 100 & mgr; m) eingehalten werden. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Diskussion

Es bleiben viele offene Fragen auf dem Gebiet der hematovascular Entwicklung - ein Feld, das aufgrund der technischen Schwierigkeiten noch in den Anfängen ist inhärent Studium vorübergehend und kleinen Zellpopulationen, die nur während bestimmter Entwicklungs Fenster entstehen. Die Techniken, die oben skizzierten verbessern viele dieser Schwierigkeiten, indem sie für die Isolierung von sogar einzelne Zellen aus der hemogenic Endothelzellen und HSPC Populationen in embryonalen Geweben bei kritischen Entwicklungszeitpunkten Reagenzien und Geräte verwenden, die in den meisten Labors der Regel zur Verfügung stehen. Unser Protokoll ermöglicht auch die parallele Isolierung von nicht-hemogenic endothelialen Zellfraktionen aus der YS und AGM, die für unabhängige Analysen verwendet werden kann oder als Kontrollen für die hemogenic endothelialen Zellfraktion in nachfolgenden Analysen.

Ein wichtiger Punkt in der Isolierung der hemogenic Endothelzellen dieses mehrfarbige FACS-basierte Methode ist geeignet spektralen compensation und genaue Zeichnung von einfarbige Tore. Als solches ist es dringend empfohlen, dass ungefärbte und einfarbige Kontrollen in allen Versuchsreihen aufgenommen werden, und dass sie - zusammen mit Proben mit Isotyp-Kontroll-Antikörper behandelt - verwendet werden, um zunächst geeignete spektrale Kompensation und Zeichnung von Toren etablieren. Jedoch unspezifische Anfärbung ist dieses Protokoll minimal, so ungefärbten und einfarbige Kontrollen für die Routineprüfung von Gattern ausreichend sind einmal FACS Sorter Einstellungen optimiert wurden.

Ungenau gezogen SP Tore sind ein besonderes Anliegen, mit dem Ansatz, die in diesem Bericht beschrieben. Frühere Studien haben gezeigt , dass die multipotenten Stammzellen Vorzugs Efflux von Hoechst zeigen rot 17, die physiologische Grundlage für ihr Aussehen in der SP durch FACS bilden. Wir haben gezeigt, dass hemogenic Endothelzellen und HSPC werden in ähnlicher Weise innerhalb der SP Zellfraktion 5,11 gefunden. Medikamente wie der Calciumkanal inInhibitor Verapamil blockiert dieses Hoechst Farbstoff Ausströmen Verhalten in SP-Zellen über Blockierung einer Vielzahl von Widerstands Transporter multidrug Trans. In hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen, in diesem Fall in erster Linie über den ABCG2 / BCRP1 transporter 24. Verapamil induziert typischerweise> 50% Blockierung der SP, aber der Gesamtgrad der Hoechst Efflux und seine anschließende Blockierung durch Verapamil gesehen wurde von Entwicklungszeitpunkt beeinflußt zu werden gezeigt, vermutlich aufgrund sich ändernder Expression mehrerer mehrfach arzneimittelresistenten transporter Typen mit Differential Hoechst Effluxleistung und Empfindlichkeit gegenüber Verapamil 5. Somit ist es dringend empfohlen, Verapamil behandelten Hoechst gebeiztes Negativkontrolle standardmässig enthalten sein richtige SP Gating zu gewährleisten: Wenn ein SP-Gatter richtig gezogen wird, sollte eine bemerkenswerte Reduktion in der Anzahl der SP-Zellen in Proben mit Hoechst gefärbt detektiert werden in das Vorhandensein von Verapamil.

Wir haben zuvor gezeigt, die sortiertSP - Zellen aus den E9.5 murine Dottersack haben eine ~ 80-90 - fach größere Fähigkeit HSPC in Methylcellulose-basierte hämatopoetischen Kultur , wenn auf eine abgestimmte Anzahl von E9.5 unfraktioniertem, nicht Hoechst gefärbt ganze YS Gewebezellen 5 im Vergleich zu erzeugen. Weitere Charakterisierung der SP hat, dass in dem murine Dottersack während der frühen hämatopoetischen und Gefäßentwicklung bei E8.0 gezeigt, gibt es merkliche Expression von VE-Cadherin und Flk-1, jedoch geringe Expression des Stiels (c-Kit) und hämatopoetischen Marker (CD45). Somit wird bei diesem Entwicklungs Zeitpunkt, Ur (non-hemogenic) EG, definiert als Flk-1 + / CD31 + / CD45- nicht SP-Zellen vorherrschen. Dieser Expressionsprofil verschiebt als endothelialen Marker - Expression abnimmt und CD45 und c-Kit - Expression erhöht, gleichzeitig mit einer zunehmenden Fähigkeit HSPC in vitro zwischen E9.5 und E11.5 5 zu erzeugen. Dies legt nahe, hämatopoetische Aktivität von YS Gewebe innerhalb des SP enthalten ist, immer am deutlichsten zwischen E9.5 und E11.5 und occurring durch einen zeitlich abgestimmten Verlust der endothelialen Eigenschaften und allmählichen Erwerb von hämatopoetischen Kapazität. Als solche Expression der multidrug resistance - Transporter, der zu dem SP - Phänotyp verleihen sind eine wichtige phänotypische Marker hemogenic Endothel 5; in der Tat, zeigen nicht-SP - Zellen von der Hauptversammlung nicht Blut bildende Potential 12. Somit erfolgreiche Isolierung des SP über Hoechst-Färbung sowohl in der YS und AGM wird sichergestellt, dass Zellen aus der hämatopoetischen Stammzellabteil eines bestimmten Gewebes geordnet werden, und die anschließende Antikörperfärbung von Zellen innerhalb dieser Fraktion Unterscheidung des hemogenic ermöglichen (Flk -1 + / c-Kit + / CD45-) im Vergleich zu HSPC (Flk1- / c-kit + / CD45 +) Populationen 5,11,12. Weiterhin wurde festgestellt worden , dass die zuvor CD41 + Zellen innerhalb der SP des Dottersackes und AGM Geweben der Bildung multi lineage Kolonie in der Lage sind , auf Basis Methylcellulose Kultur 11,12. Wir definieren hemogenic Endothelzellen als Flk1 + c-Kit + CD45- SP Zelles von CD45 als Designated Marker hämatopoetischer Abstammung mit eher als CD41 angesichts unserer dass die Expression von Flk1 und CD45 zu finden , ist praktisch gegenseitig ausschließende 5,11. Dies ermöglicht eine reine Isolierung von Zellen innerhalb der SP, die sowohl Endothel haben (Flk-1) und Stamm Merkmale (c-Kit), die für Endothelzellen zu hämatopoetischen Übergang aber, die noch nicht diese Veränderung erfahren, wie durch das Fehlen von CD45 in diesen bestimmt Zellen. Es wäre nützlich, Unter Fraktionierung der HSPC Bevölkerung zu berücksichtigen, definiert als Flk-1- / c-Kit + / CD45 + / SP-Zellen, in CSF1R + (Gewebe-Makrophagen) und Csf1r- (HSC) Fraktion wie kürzlich von Gomez und Kollegen berichteten 25, da dieser eine höhere Auflösung des wahren HSPC gegenüber Gewebe - Makrophagen - Vorläuferpopulationen bereitstellen würde, aber dies sollte nicht die Integrität der hemogenic endothelialen Zellfraktion beeinflussen deren Isolierung wir seit CSF1R umrissen ist eine Markierung der Makrophagen - Vorläufern 26.

Hemogenic Endothelzellen sind eine seltene Subpopulation sowohl YS und AGM (bestehend aus 1-3% der Endothelzellen) und daher eine große Herausforderung in ihrer Studie nicht ausreichend Zellausbeute für nachfolgende Anwendungen. Dieses Protokoll führt in der Regel 70-80% der Zellen durch die Zeit des Sortierens tragfähige verbleibenden und einem typischen hemogenic Endothelzelle Art, die aus gepoolten Geweben aus verschiedenen Embryonen erhalten werden, können nur einige hundert Zellen selbst unter optimalen Bedingungen, mit nur 10-20% Ausbeute von eingebetteten Zellen in Methyl produzierenden Kolonien abgerufen. Um sortierten Zellzahl zu maximieren, ist es dringend empfohlen, dass die Ermittler Schritte unternehmen, um Gewebe und die Lebensfähigkeit der Zellen bei jedem Schritt des Verfahrens zu gewährleisten: Gewebe sollte schnell seziert und gepoolt und Proben sollten, wann immer möglich auf Eis gehalten werden. Die Proben sollten frisch unmittelbar vor der FACS-Sortierung und sortiert in Sammelröhrchen mit einem hohen Serumgehalt oder direkt in Methyl Kultur hergestellt werden, wie beschrieben,d über. Wenn Lebensfähigkeit Probleme weiterhin bestehen, Sammelröhrchen auch sein kann mit Serum vorbeschichtet weiter sortierte das Überleben der Zelle zu verbessern. Wenn hemogenic endothelialen Zellausbeute gering bleibt, adulten Knochenmark oder im Handel erhältlichen fluorophorkonjugierten Kügelchen können für die spektrale Kompensation anstelle der embryonalen Gewebe stamm einzelne Farbe Kontrollen hierin beschriebenen verwendet werden. Wenn sortierten Zellen für die Kultur bestimmt sind, hemogenic Endothelzellen und HSPC sollten direkt in Gewebekulturvertiefungen sortiert werden. Wenn sortierten Zellen für DNA oder RNA-bezogenen Genexpressionsanalyse bestimmt sind, hemogenic und nicht-hemogenic Endothelzellen und HSPC können direkt in den Sammelröhrchen, die Probe Lysepuffer Verlust zu minimieren Zelle sortiert werden.

Die skizzierten Technik erlaubt erfolgreich (und simultan) Isolierung von hemogenic und nicht-hemogenic Endothelzellen sowie HSPC und reifen Blutzellfraktionen aus den gleichen embryonalen Geweben. Dieser Ansatz ermöglicht es weiteren Zapfeny der molekularen Grundlagen der kritischen Übergänge, die auftreten, wie Endothelzellen Blut erzeugen. Erkenntnisse aus diesen Entwicklungsstudien gewonnenen Erkenntnisse können dann die Erzeugung von menschlichen hemogenic Endothelzellen und HSPC Nachkommen von pluripotenten zur Optimierung verwendet werden und möglicherweise autologe Stammzellen für die Behandlung von vorherrschenden hämatopoetischen Erkrankungen.

Offenlegungen

Diese Arbeit byNIH Zuschüsse HL128064, HL096360, EB017103 unterstützt wurde, und CT-Innovationen gewähren 15-RMB-YALE-04, zu KKH und NICHD / NIH T32HD007094.

Danksagungen

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
DAPT (N-[N-(3,5-Difluorphenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycin-t-butylester)SigmaD5942GIFTIGER Reizstoff: Tragen Sie bei der Handhabung Augenschutz, Maske und Handschuhe.
Saugfähige BankunterlageCovidien7134
#5 Gerade PinzetteFine Science Tools11251-20
8,5 cm gerade SchereFine Science Tools14090-09
Isofluran (Isothesie)Henry Schein 50033GIFTIGES Inhalationsmittel: Verwendung im Abzug.
100x Penicillin Streptomycin Glutamin (10.000 U/ml Penicillin, 10.000 mg/ml Streptomycin, 29,2 mg/ml L-Glutamin)  Invitrogen10378016
Typ II KollagenaseWorthingtonLS004174
Falcon 70 μ M Nylon-ZellsiebCorningCLS431751
Anti-Maus CD45-FITCeBioscience11-0451-81
Anti-Maus CD31 - PEeBioscience12-0311-81
Anti-Maus Flk-1 PE-Cy7BD Pharmingen561259
Hoechst 33342 (BisBenzimid H 33342 Trihydrochlorid)Sigma14533GIFTIG: reizend. Tragen Sie bei der Handhabung einen Augenschutz und Handschuhe. Herstellung einer Stammlösung von 25 mg/ml in destilliertem H2O, Lagerung der Aliquots bei -20 ° C bis zur Gebrauchsbereitstellung.
VerapamilHydrochlorid Sigma1711202 GIFTIG: reizend. Tragen Sie bei der Handhabung Augenschutz, Maske und Handschuhe.   Bereiten Sie eine Stammlösung von 5 mM (100x) in 95%igem Ethanol vor. Lagern bei -20 ° C bis zur Gebrauchsbereitung 
Falcon 5 ml Reagenzglas aus Polystyrol mit rundem Boden, mit Zellsieb SchnappkappeCorning352235
MethoCult GF M3434Stem Cell Technologies3434Auftauen und aliquotieren gemäß Herstelleranweisungen
Modifizierter Giemsa StainSigmaGS500TOXIC: Enthält Methanol - im Abzug verwenden und bei der Handhabung Handschuhe tragen. In destilliertem Wasser auf 0,02%ige Lösung verdünnen.
Cytospin ZentrifugeThermo ScientificA78300003
Clipped Funnel Starter KitThermo Scientific3120110Enthält Cytofunnels, Filterpapier, Cytoslides und Cytoclips zur Verwendung mit der Cytospin Zentrifuge
Anti-Maus B-220 - FITCBD Pharmingen553088
Anti-Maus Gr-1-FITCeBioscience11-5931-85
Anti-Maus Ter-119-FITCeBioscience11-5921-85
Gibco Fötales RinderserumThermo Scientific10437-077
Dulbecco's Modifiziertes Adlermedium (4,5 g/L)Life Technologies 11965-092
Hank's Technologien für die Lebensdauer der gepufferten Salzlösung 14175-095
Fibronektin-beschichtete 24-Well-GewebekulturplatteEMD MilliporePIFB24P05
IgG2A-PEBD Pharmingen553930
IgG2B-FITCBD Pharmingen556923

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