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Methodenartikel

Bestimmung von Biofilm Initiation auf Virus-infizierte Zellen durch Bakterien und Fungi

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DOI:

10.3791/54162

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6. Juli 2016

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Midwestern University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hierin wird ein Verfahren zur Bestimmung der Assoziation und Konkurrenz zwischen den Königreichen (bakteriell und pilzlich) für die Adhärenz an virusinfizierten HeLa-Zell-Monoschichten beschrieben. Dieses Protokoll kann auf mehrere Kombinationen von Prokaryoten, Eukaryoten und Viren ausgeweitet werden.

Zusammenfassung

Die Studie von polymikrobiellen Interaktionen über die taxonomische Königreiche, die Pilze, Bakterien und Viren sind nicht zuvor in Bezug auf, wie virale Mitglieder des microbiome beeinflussen nachfolgende Mikroben-Interaktionen mit diesen Virus infizierten Wirtszellen untersucht worden. Das Zusammenleben von Virus mit Bakterien und Pilzen besteht hauptsächlich darin, die auf den Schleimhäuten der Mundhöhle und des Genitaltrakts. Mucosal Zellen, insbesondere solche mit persistenten chronischen oder persistenten latenten Virusinfektionen, könnte einen erheblichen Einfluss auf die Mitglieder des microbiome durch Virus Veränderung in der Anzahl und Art der Rezeptoren zum Ausdruck gebracht haben. Änderung in Wirtszellmembran Architektur in veränderter Fähigkeit der nachfolgenden Mitglieder der normalen Flora und opportunistischen Erregern würde den ersten Schritt in die Biofilmbildung, das heißt, die Einhaltung zu initiieren. Diese Studie beschreibt ein Verfahren zur Quantifizierung und visuelle Untersuchung des HSV Wirkung auf die Einleitung BIOFILm - Bildung (Adhärenz) von S. aureus und C. albicans.

Einleitung

Der menschliche microbiome umfasst unterschiedliche Organismen aus verschiedenen taxonomischen Königreiche, die im Körper geografischen Regionen teilen. Die Einhaltung der Zelloberflächen ist ein wichtiger erster Schritt in die Biofilmbildung, die Teil des microbiome Kolonisierung ist. Eingeschlossen in die microbiome können Viren sein, die chronische und persistente Infektionen verursachen. Die chronische Zellinfektion durch diese Viren kann eine Veränderung in mutmaßlichen Rezeptor Verfügbarkeit führen. 1,2 Zusätzlich Zelleintritt durch intrazelluläre Erreger auch Wirts Membranfluidität / Hydrophobizität, die wiederum verändern können Anbringung weiterer microbiome Mitglieder, einschließlich Bakterien und Pilzen beeinflussen könnten . Um die Wechselwirkungen zu verstehen, die zwischen diesen mehrere Krankheitserreger, die Co-Lokalisierung in den gleichen Regionen des menschlichen Wirts auftreten können, müssen wir die Wechselwirkung von Krankheitserregern zu studieren können, die das Spektrum von taxonomischen Königreiche, die an der Schleimhautoberfläche darstellen.

t "> Die Herpesviridae sind eine Familie von Mikroben in 100% der Menschen als ständige Mitglieder des microbiome 3,4. Darüber hinaus können sie auch beide beharrlich vergossen werden in Gegenwart und in Abwesenheit von Symptomen. Insbesondere Herpes - simplex - Virus-1 und Herpes-simplex-Virus-2 (HSV-1 und HSV-2, jeweils) sind permanent Mitglieder der microbiome im oronasopharynx und Genitaltrakt. in immunkompetenten Individuen sowohl HSV-1 und HSV-2 verursachen Gingivostomatitis, sowie Genital - Herpes 5-8. an diesen Stellen verursacht HSV eine latente durch chronische persistente asymptomatischen Virus gekennzeichnet Infektion zu vergießen 9. Eintritt von HSV in Zellen führt zu Veränderungen in der Oberflächenexpression von nectins, Heparansulfat, Lipid Rafts und Herpes - Virus Eintrag Mediator / Tumor - Nekrose Faktor - Rezeptor (HVEM / TNFr) 25.10. Diese potenziell gemeinsamen Rezeptoren für einige Bakterien und Pilze darstellen, zB S. aureus und C. albicans, die während opportunistische Erreger,können auch als Mitglieder der Schleimhaut microbiome des oronasopharynx 26,27 befinden. Innerhalb des oronasopharynx S. aureus und C. albicans belegen zwei verschiedene Stellen der Besiedlung. In Hosts mit natürlichen Zähnen wird die Mundschleimhaut durch HSV-1 geteilt und C. albicans, während die vorderen Nasen nares werden von S. besetzt aureus 28. Doch trotz in - vitro - Ergebnisse , dass S. aureus hält sich an den Mund Epithelzellen, 29,30 S. aureus ist selten von oralen Proben isoliert , wenn die normale Gewebe vorhanden 29,30 ist. Es ist wenig bekannt , Genitaltrakt über Co-Kolonisation Nischen jenseits der klinischen Befunde , dass S. aureus ist mit aerober Vaginitis verbunden sind , gekennzeichnet durch Genital - Entzündung, Entladung und Dyspareunie, während C. albicans erzeugt Schleimhautläsionen ähnlich der in der Mundhöhle beobachtet 31-35. Obwohl also diese Mitglieder der Mund- und Genital microbiome Quer taxonomischen Reiche wenig bekannt ist , ihre Interaktion , wie sie Auswirkungen ihrer Fähigkeit , die Bildung von Biofilmen durch die Einhaltung der Wirtszelloberfläche 5 über einzuleiten. Dieses Protokoll wurde effektiv die funktionellen Folgen der Co-Kolonisation / Infektion zu bestimmen, angewandt.

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Protokoll

1. HSV-Stämme und Handhabung

Hinweis: Recombinant kein Ausbreiten HSV-1 (KOS) gL86 und HSV-2 (KOS) 333gJ - mit beta-Galactosidase - Reporteraktivität verwendet wurden von V. Twiari 36,37 zur Verfügung gestellt.

  1. Verwenden Sie Virus aus einem Los und bei -80 ° C bei einer 1: 1-Verhältnis von Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 20% fötalem Rinderserum (FBS) und Magermilch bis zur Verwendung. Vor viral Menge Lagerung, Viruskonzentration von o - Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid (ONPG) und 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (X-Gal) Assay bestimmen.
  2. Bestimmen die Lebensfähigkeit des Virus und Multiplizität der Infektion (MOI) von X-Gal - Färbung für jeden experimentellen Testlauf unter Verwendung von Reporter - Virus Eintrag Assay, wie vorstehend beschrieben (Figur 1) 14.
  3. Verdünnte-Virus (Opt-MEM), um die gewünschten MOI. Fix Monolayern (Paraformaldehyd, 0,5 ml / Vertiefung) vor der Färbung. Platzieren Sie die Lebensfähigkeit des Virus Kontrollen in einem separaten microtiter Platte parallel zu polymikrobiellen Testplatten.

2. HeLa 299 Cell Handling

  1. Wachsen bei 37 ° C, 5% CO 2 in DMEM mit 4,5 g / L Glucose, 10% hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum (FBS), Gentamicin (50 ug / ml) und L-Glutamin. Passage-Zellen bei 80% Konfluenz mit Trypsin-Lösung (Ethylendiamintetraessigsäure, 0,53 M EDTA; 0,05% Trypsin; 5 ml / Kolben).

3. C. albicans Handhabung

Hinweis: C. albicans aus einem klinischen Labor Quelle erhalten wird bei -80 ° C in Remmel Magermilch 2x Medium gespeichert.

  1. Kultur gefroren Lager auf Sabouraud-Dextrose-Medium (37 ° C). Nach 24 Stunden Subkultur der C. albicans auf Fungisel Medium (37 ° C; 48 h) zur Verwendung.
  2. Generieren Keimschlauch (GT) Formen (Pick repräsentative Kolonien; 3 ml FBS; 3 h; 37 ° C; Abs 600, 0,3). Nach der Inkubation waschen GT (HBSS; 2x; 4000 · g). In gewaschen GT erwärmt HBSS (37 &# 176; C; 0,32 Abs 600). GT Formulare sollten 99% der Zellen beobachtet, wie er durch Haemocytometerzählung bestimmt.
  3. Machen Sie Hefeform (YF) Stoffsuspensionen durch Picken Vertreter Fungisel Kolonien (HBSS, 3 ml; 0,32 Abs 600). Zählen Sie die Anzahl von YF Formen / ml unter Verwendung von mikroskopisch einer Zählkammer. YF Formulare sollten 99% der Zellen beobachtet, wie er durch Haemocytometerzählung bestimmt.
  4. Machen Sie arbeiten Pilz-Lager (250 ul GT oder YF Lager in 25 ml HBSS; 37 ° C; 10 5 KBE / ml)

4. S. aureus Handhabung

  1. Shop S. aureus ATCC 25923 (-80 ° C; Remmel Milch 2x abschöpfen). Kultur auf Schafblut-Agar (5%; 37 ° C; 24 h). Wählen repräsentative Kolonien und übertragen Salze Mannit Medium innerhalb von 2 Tagen für Lager (37 ° C; 18 h).
  2. Machen Sie S. aureus Stoffsuspension (3 ml HBSS; 1.32 Abs 600; 10 8 KBE / ml)
    1. Machen Sie S. Arbeits aureus Lager (100 & mgr; lder Lager in 25 ml HBSS; 10 5 CFU / ml).

5. Candida und S. aureus Suspensions

  1. Machen Sie Misch C. albicans und S. aureus - Suspension (250 ul YF oder GT Lager und 100 & mgr; l S. aureus Lager in 25 ml HBSS).

6. polymikrobiellen Biofilm-Assay

  1. Seed Platten mit 96 Vertiefungen mit 200 ul 2 x 10 5 HeLa - Zellen / ml (85% Konfluenz Ebene). Gesteinsplatten (30 - 45 min; 37 ° C) vor der Inkubation (37 ° C; 5% CO 2 -Inkubator; 18 h). Wash Monolayern (1x; Opt-MEM) dann Samen mit HSV (HSV-1 (KOS) gL86 oder HSV-2 (KOS) 33 gJ - in 100 ul Opt-MEM; MOI 50 und 10). Inkubieren Platten (3 h; 37 ° C; 5% CO 2). Verwenden Sie nur einen Virusstamm pro Tag.
  2. Waschen infizierten Monoschichten (1x; phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) mit Mg +2 und Ca +2; 100 & mgr; l). Ersetzen PBS mit warmem HBSS verlassen 25 & #181; l in jeder Vertiefung.
    1. In YF, GT und / oder S. aureus Arbeits Suspensionen (100 & mgr; l, Ziel zu Zellenverhältnis = 5: 1; n = 16) dar . Wie in Tabelle 1 angegeben inkubieren Platten (static; 30 min; 37 ° C; 5% CO 2).
  3. Nach der Inkubation aspirate eine Spalte zu einer Zeit sofort mit 300 & mgr; l PBS mit Mg +2 und Ca +2 Nachfüllen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal fügen Sie dann Radio-Immunopräzipitation Lysepuffer (RIPA; Filter sterilisiert; 200 ul einer Verdünnung von 1:50).
  4. Verreiben schnell die HeLa Zelllysat anschießend auf 50 & mgr; l Mannit Salze (MS) und / oder Fungisel (F) Medien (Abbildung 2). Verbreiten Sie das Lysat mit einem Glasstab gebogen in einem 90 ° Winkel mit. Inkubiere die Platten (18 h bei 37 ° C). zählen manuell die Anzahl der Kolonien pro Platte. Kontrollen bestehen aus S. aureus und / oder C. albicans Einhaltung der HSV-nicht infizierten HeLa - Zellen.

7. Imaging Studies

  1. Waschen Sie jede Runde Deckglas (12 mm; 50 ml Aceton in 100-ml-Becher). Trockene und sterilisieren Deck (Kimwipes; Petrischalen aus Glas). Legen Sie trockene sterile Deckgläschen in die Vertiefungen von sterilen 24-Well-Platten mit Alkohol Flamme sterilisierten Pinzette.
  2. Hinzufügen HeLa-Zellen (1 ml; 5x Volumen für 96-Well-Platten verwendet werden) in die Vertiefungen von 24-Well-Platten die gewaschenen sterilen Rundglasplättchen enthält. Fügen Sie die Viren, Bakterien und Pilze nach der Vorlage (Tabelle 2) bei 5x das Volumen der 96 - Well - Platten verwendet, dann brüten und Verfahren , wie 6.2.1 bis 6.4 oben in den Schritten beschrieben.
  3. Nach dem letzten Waschen, Fixieren der Zellen für die Mikroskopie durch die Folie mit Methanol überschwemmen und ermöglicht es zu verdampfen. Lagern Sie die Platten bei RT bis zur Färbung.
  4. Für Hellfeldmikroskopie (1,000x letzte Originalvergrößerung) füllen die Vertiefungen mit Methanol fixierten Deck mit entsalztem Wasser enthält. Ab sofort absaugen Wasser. Cover jede Deckglas mit Grams Kristallviolett. Wash Deckgläser frei von nicht gebundenen Fleck (VE-Wasser). Dry Deck in situ haften sie dann mit harten Satz Eindeckmediums zu einem markierten Schieber (Abbildung 3).
  5. Für Fluoreszenzmikroskopie (100x Objektiv; 1,000x letzte Originalvergrößerung) waschen Deckgläser frei im wesentlichen aus Methanol, wie in Schritt 7.4 beschrieben. Trocknen Sie die Deckgläser in den Vertiefungen.
    1. die Deckgläser Nach dem Trocknen entfernen und sie auf markierten Folien. Dann fügen Sie eine ausreichende Menge an 1:20 Verdünnung von Fluorescein (FITC) -konjugierte Herpes Simplex Virus Typ 1 + 2 gD-Antikörper das Deckglas zu bedecken (1 - 5 ul).
    2. Inkubieren der Objektträger in einer feuchten Kammer bei 37 ° C für 30 min. Nach der Inkubation waschen Sie die Deckgläser in vier Änderungen von PBS.
    3. Nach dem letzten Waschen, bringen Sie das Deckglas an die markierte Folie. Fleck mit 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI; Feuchtigkeitskammer; 37 ° C für 30 min). Nach der Inkubation waschen Sie die Deckgläser in 4 changes von PBS, dann zu dem markierten Schlitten mit harten Satz Eindeckmediums befestigen.
    4. Ermöglichen die Befestigungsmittel für 24 h bei RT im Dunkeln zu heilen. Untersuchen Sie die Deckgläser unter Öl-Objektiv entweder auf einem Hellfeld-Mikroskop oder Fluoreszenzmikroskop mit FITC und DAPI Cutoff-Filter. Untersuchen Sie Bilder von mindestens 50 Felder (100 Zellen pro Organismus Minimum) für die Co-Lokalisierung (Abbildung 4).

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Ergebnisse

Der Grad der Zuverlässigkeit der Daten , die aus System in diesem Bericht beschrieben wird , in Abbildung 2 af 38 gezeigt. Durch die Verwendung dieses Systems die Modulation von Staphylokokken und Pilz Wechselwirkung mit viral infizierte Zellen und deren Wirkung auf jedes Anhaften des anderen können abgegrenzt werden. Diese Arten von Studien erfordern mikroskopische Untersuchung der Wechselwirkung , wie in den 3 und 4 gezeigt ...

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Diskussion

Derzeit liegen keine Informationen über komplexe Wechselwirkungen zwischen permanent zu semi-permanenten Mitglieder des Host microbiome , die mehrere taxonomische Domänen kreuzen, dh prokaryotischen, eukaryotischen und viral. Deshalb entwickelten wir ein neuartiges in System - vitro - Modell Biofilm Einleitung von S. zu studieren aureus und C. albicans auf HSV-1 oder HSV-2 infizierten HeLa 229 (HeLa - Zellen) 38. Die HeLa-Zellen Modellsystem stellt einen e...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Dieses Projekt wurde unterstützt von der Midwestern University, IL Office of Research and Sponsored Programs (ORSP) und dem Midwestern University College of Dental Medicine-Illinois (CDMI).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
C.albicans
BBL Sabouraud DextroseBD211584
Fungisel AgarDot Scientific7205A
S.aureus
Mannitol Salz AgarTroy Biologicals7143B
Schafblut-AgarTroy Biologicals221239
Hela-Zellen
1x DMEM (Dubelcco's Modified Eagle Medium, mit 4,5 g/L Glucose und L-Glutamin, ohne NatriumpyruvatCorning10-017-CM
Gentamicin 50 mg/mlSigma139750 µ g/ml Endkonzentration im vollständigen DMEM
Trypsin EDTA (0,05 % Trypsin, 0,53 M EDTA)Lösung 1xCorning25-052-CI
Fetal Bovine SerumAtlanta BiologicalsS1115010 % Endkonzentration im vollständigen DMEM
strong>Sonstiges Medium und Reagenzien
ONPGThermo Scientific34055
Ultra-Pure X galInvitrogen15520-018
1x HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution)Corning20-021-CV
1x PBSDot Scientific30042-500
RIPA LysisLife Technologies89901
Staining
MethanolFisher ScientificA433P-4
HSV 1& 2, spezifisch fürgD ViroStat196
DAPISIGMAD8417-5MG
Gram Crystal VioletTroy Biologicals212527
Supplies
Petrischale 100 x 15Dot Wissenschaftliche229693 
Petrischale 150 x 15Kord Valmark2902
96-Well-PlattenEvergreen Scientific222-8030-01F
24-Well-PlattenEvergreen Scientific222-8044-01F
Kulturröhrchen 100 x 13Thomas Scientific9187L61
Deckglaser-Kreise, 12 mmDeckglaserCB00120RA1
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Referenzen

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Bakterielle AnheftungPilzadherenceHSV-InfektionStaphylococcus aureusCandida albicansHeLa-Zellenpolymikrobieller AssayKristallviolett-Färbung
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